陳葉雨，劉 亞，杜 軍，宋明江，賴見生，林 玨，龔 全

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，四川 成都 611731)

【研究意義】達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)是我國長江流域特有淡水定居種類，近年來，由于過度捕撈、棲息地破壞以及環(huán)境污染等因素，其野生種群數(shù)量急劇下降[1]，已被列為國家一級重點保護動物和極度瀕危物種。自1995年后，長江流域葛洲壩下游已經(jīng)沒有野生達(dá)氏鱘的報道[1-2]。因此，人工繁殖及增殖放流是達(dá)氏鱘種質(zhì)資源保護最重要的途徑。性別比例平衡是增殖放流過程中的重要考慮因素。由于達(dá)氏鱘沒有第2性征，外部特征不足以進行性別鑒別，而當(dāng)前鱘魚性別鑒定技術(shù)(微創(chuàng)手術(shù)、內(nèi)窺鏡、超聲等)都需要鱘魚生長到較大個體[3]，甚至到性成熟后才較為準(zhǔn)確，且通常對魚體都具有不同程度的損傷性。因此，深入了解達(dá)氏鱘的性別決定與分化，利用分子標(biāo)記的方法進行性別鑒定，對達(dá)氏鱘物種保護具有深遠(yuǎn)的意義?！厩叭搜芯窟M展】目前一些研究通過雌核發(fā)育技術(shù)推測大多數(shù)鱘魚的性別決定系統(tǒng)為ZZ-ZW型[4-5]，但是在鱘魚中卻一直未能鑒定出異形性染色體[6]。然而，無論是野生種群還是人工養(yǎng)殖種群，鱘魚的性別比例均接近于1∶1，表明其性別決定機制可能主要是由遺傳決定[7]，這為利用分子標(biāo)記的手段來進行性別鑒定提供了可能。但目前利用大量的顯性標(biāo)記(AFLP，RAPD等)在不同性別的鱘魚中進行篩選，結(jié)果都未找出性別特異性的分子標(biāo)記[8-11]?！颈狙芯壳腥朦c】微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)具有共顯性、分辨率高、重復(fù)率及可信度高的優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物育種領(lǐng)域的研究。然而鱘魚染色體組的多倍性給共顯性標(biāo)記的分析研究帶來困難[12]，在鱘形目魚類中已開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量相對其他模式水生生物較為稀少。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，開發(fā)達(dá)氏鱘多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記并首次進行達(dá)氏鱘性別相關(guān)位點的篩選，為今后達(dá)氏鱘性別鑒定及鱘魚的性別決定與分化的研究具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用達(dá)氏鱘全部來自四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所親魚樣本，共96尾(48尾♀；48尾♂)性成熟個體，平均體重20 kg。剪取部分尾鰭條于100 %乙醇中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

達(dá)氏鱘DNA采用CTAB高鹽法進行制備，取1 μl左右的樣品進行電泳檢測DNA質(zhì)量，并用分光光度計測定純度和濃度，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 微衛(wèi)星引物設(shè)計和多態(tài)性驗證

利用前期達(dá)氏鱘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)微衛(wèi)星分析結(jié)果[13]，隨機選取多個微衛(wèi)星位點，根據(jù)其兩端序列，利用Primer 3軟件設(shè)計微衛(wèi)星位點的特異性引物。以達(dá)氏鱘基因組DNA為模版，進行PCR擴增，體系為10 μl，包括50 ng基因組DNA，1×PCR緩沖液，Mg2+(1.5 mM)，1 UTaq酶，dNTPs 0.2 mM，正反引物均為0.25 μM。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，最后4 ℃保存。PCR擴增完成后，利用8 %的非變性聚丙烯凝膠電泳驗證其多態(tài)性。多態(tài)性良好的引物分別用FAM、HEX、TAMRA 3種熒光標(biāo)記，隨機選取43個達(dá)氏鱘個體基因組DNA作為模板進行PCR擴增，在ABI 3730XL測序儀進行毛細(xì)管電泳和STR分型以確定達(dá)氏鱘微衛(wèi)星標(biāo)記在不同個體上的等位基因大小。

根據(jù)每個微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物的等位基因大小確定其基因型，用ATetra 1.2軟件[14]計算期望雜合度以及Shannon-wiener多樣性指數(shù)等。

1.4 雌雄差異條帶的篩選

利用本研究篩選出的微衛(wèi)星位點，加上20個四川省水產(chǎn)研究所分子實驗室前期自主開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記[11]以及已公開發(fā)表的達(dá)氏鱘或鱘魚通用微衛(wèi)星標(biāo)記71個[15-18]，由上海生工生物工程公司合成。根據(jù)擴增產(chǎn)物片段大小的差異，各對引物分別標(biāo)記FAM、HEX、TAMRA 3種熒光中的1種，取48尾雌魚及48尾雄魚作為模板，進行PCR。擴增結(jié)果送上海生工生物工程公司，在ABI 3730XL測序儀進行毛細(xì)管電泳和STR分型，以確定達(dá)氏鱘微衛(wèi)星標(biāo)記在不同個體上的等位基因大小。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

分型結(jié)果用Genemarker軟件進行讀取，并做人工校正，從而得到每個個體在所有位點中的基因型。根據(jù)SSR分型結(jié)果，用SPSS 13.0軟件包中的CompareMeans(平均數(shù)比較)法對雌、雄群體的等位基因頻率進行平均數(shù)配對樣本的T檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星引物篩選結(jié)果及遺傳多樣性分析

通過對各微衛(wèi)星位點的多態(tài)性分析，本研究共篩選出15個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點，分別命名為ADX01、ADX08、ADX10、ADX13、ADX23、ADX26、ADX28、ADX31、ADX44、ADX49、ADX54、ADX56、ADX62、ADX64和ADX71。該15個位點在43個達(dá)氏鱘個體中均表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性，并能對其進行準(zhǔn)確的基因分型(圖1)。各位點在43個個體中的等位基因數(shù)量為3～8，平均等位基因數(shù)為4.6(表1)。其中，6個位點以2堿基為重復(fù)單元，3個位點為3堿基重復(fù)，5個位點為4堿基重復(fù)，1個位點為5堿基重復(fù)序列。根據(jù)微衛(wèi)星分型結(jié)果及遺傳多樣性參數(shù)的計算，該15個微衛(wèi)星標(biāo)記的期望雜合度的范圍為0.3831～0.8607，平均雜合度為0.7078，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)為0.6541～1.9663，平均值為1.3362，證明本研究篩選的微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性。

2.2 106個微衛(wèi)星位點在達(dá)氏鱘中的擴增及分析

利用本研究開發(fā)的15對微衛(wèi)星引物及文獻(xiàn)報道的91對引物，在達(dá)氏鱘雌雄個體中進行擴增，其中，Ada2，Ada10，Ada11，Ada26，Ag18，Ag49，DS3，DS8，DS25，Anac11，Spl113，Afu34和AciG76共13個位點在此次檢測的96個達(dá)氏鱘個體中無多態(tài)性，其余93個位點均存在多態(tài)性。該93個位點在48個雌性個體中的等位基因數(shù)為1～10(表2)，平均值為4.6；在雄性個體中的等位基因數(shù)為2～10，平均值為4.5，其中等位基因數(shù)最多的位點為ADX33(表2)。93個位點中，ADX23，AD6，DS18，Ada4，Ada5，Ada9，Ada12，Ada18，Ada24，ADX21，ADX29，ADX70，ADX80共13個位點在雌、雄個體中的等位基因數(shù)量存在差異，其余80個位點在雌雄個體之間的等位基因數(shù)量相等。

表1 新開發(fā)達(dá)氏鱘微衛(wèi)星標(biāo)記的特征

2.3 達(dá)氏鱘性別相關(guān)位點的篩選

此次檢測的93個多態(tài)性微衛(wèi)星位點在96個雌雄個體中共產(chǎn)生438個等位基因，其中有66個等位基因在96個雌雄個體中出現(xiàn)的頻率沒有差異，370個等位基因頻率在雌雄個體間存在差異但差異不顯著。只有1個位點ADX21的2個等位基因ADX21-144 bp和ADX 21-151 bp在雌雄個體間出現(xiàn)的頻率差異達(dá)到60 %(表2)。其中ADX 21～144 bp在雄性群體中的頻率為75 %，顯著高于雌性個體的頻率15 %，為雄性優(yōu)勢條帶，而ADX 21～151 bp在雌性群體中的頻率為85 %，顯著高于雄性個體的頻率25 %，為雌性優(yōu)勢條帶。

圖1 部分微衛(wèi)星分型Fig.1 The genotype results of two microsatellite markers

位點Locus等位基因Allele雌♀雄♂等位基因頻率差值范圍(%)Frequency difference?位點Locus等位基因Allele雌♀雄♂等位基因頻率差值范圍(%)Frequency difference?位點Locus等位基因Allele雌♀雄♂等位基因頻率差值范圍(%)Frequency difference?ADX01550～12DS14772～23Afu54442～14ADX08330～9DS15660～7Ag1660～19ADX10774～23DS16550～15Ag9334～19ADX13660～12DS18422～13Ag12880～44ADX23324～22DS22550～18Ag14447～9ADX26442～11DS27220Ag22226～7Adx28445～23Ada1442～4Ag28330～9ADX313310～19Ada3880～11Aox27440～15ADX44550～14Ada4542～21AoxB28220～3ADX49880～19Ada5132Spl101660～2ADX54440～31Ada6663～12 %Spl170a880～11ADX56444～19Ada72214ADX11330ADX62440～8Ada8662～19ADX21874～60ADX64552～30Ada9652～9ADX29760～21ADX71446～19Ada12560～10ADX3310102～27AD1222Ada13550～23ADX37220～4AD2444～30Ada14775～23ADX38662～19AD3440～33Ada15227～19ADX40442～19AD4330～4Ada16550～15ADX42550～15AD5550～7Ada17772～11ADX52440～29AD6560～14Ada18452～8ADX55770～27AD7880～29Ada19532～15ADX58338～15AD8660～8Ada20550～14ADX59440～15DS1662～6Ada21440～13ADX60665～21DS2225～11Ada22662～17ADX61330～19DS5440～9Ada23222ADX66660～33DS7330～2Ada24422～6ADX70322～4DS9772～21Ada25550～12ADX72448～17DS11332～21AciG142440～16ADX74770～12DS12330～13Afu19220～2ADX75440～21DS13440～14Afu39330～13ADX80560～35

注：*等位基因頻率差值范圍：微衛(wèi)星每個等位基因在雌雄個體中出現(xiàn)的頻率差值，從小到大進行統(tǒng)計的范圍。

Note:*The range of frequency difference was caculated orderly according to the distribution of each allele in female and male individuals.

3 討 論

在水產(chǎn)動物育種中，性別控制的方法通常包括激素、溫度和雜交選育等方式。用激素改變性別分化方向的方式最為簡單快捷，然而激素處理后的雌魚對魚子醬品質(zhì)的安全影響無法評估。另一種控制性別的方法是調(diào)控溫度，研究發(fā)現(xiàn)有些魚類，例如羅非魚[19]，在高溫下傾向于雄性發(fā)育，而低溫時則向雌性分化。但不是所有魚類的性腺分化都受溫度控制，研究發(fā)現(xiàn)施氏鱘在性腺分化時，溫度只改變其分化的時間，并不改變其分化方向[20]。雜交選育也是控制后代性別的方式之一，然而，達(dá)氏鱘性成熟時間過長，所以篩選雜交后代性別的周期也相對較長，而且鱘魚性別決定系統(tǒng)的研究還處于相當(dāng)初級的階段，雖有研究發(fā)現(xiàn)其性別決定系統(tǒng)可能為ZZ-ZW型[4-5]，但是一直未能在鱘魚中鑒定出性染色體，所以通過雜交的方式在鱘魚中進行性別選育相對較困難。近年來，隨著分子遺傳學(xué)和分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，使基因水平上控制動物的性別成為可能。分子標(biāo)記具有操作簡單、對環(huán)境依賴小、成本低等優(yōu)點，最重要的是可以通過不傷害動物的方式來對物種進行性別鑒定、個體識別、親子鑒定等。

本文首次利用共顯性標(biāo)記微衛(wèi)星對達(dá)氏鱘雌雄個體進行分型，共使用106個微衛(wèi)星位點和96個雌雄個體，這是目前為止在鱘魚中使用的最大數(shù)量的微衛(wèi)星標(biāo)記來進行性別差異性分析。在106個微衛(wèi)星位點中，有93個位點存在多態(tài)性，在48個雌性個體和48個雄性個體中的平均等位基因數(shù)分別為4.6和4.5，無顯著差異。93個多態(tài)性位點中，有92個位點的所有等位基因在雌雄個體中出現(xiàn)的頻率均無顯著差異，只有1個位點ADX21的2個等位基因ADX 21-144 bp和ADX21-151 bp在雌雄個體間的出現(xiàn)頻率差異均達(dá)到60 %，分別為雄性優(yōu)勢條帶和雌性優(yōu)勢條帶，推測該位點可能與達(dá)氏鱘的性別有一定關(guān)聯(lián)，有可能與性別決定基因連鎖，但其并不是性別特異性的位點，所以今后有必要采用更多的標(biāo)記來進行雌雄分型分析，進一步找出性別特異性位點或等位基因。

鱘魚性別連鎖位點的研究還處于起步階段，近年來偶有報道，但目前為止均未找到性別特異性的連鎖位點。Wuertz等[8]用AFLP，RAPD和ISSR等技術(shù)在西伯利亞鱘，意大利鱘，俄羅斯鱘和小體鱘四種鱘魚中進行隨機性篩選，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)與性別相關(guān)的標(biāo)記。McCormick等[9]利用RAPD技術(shù)在30個湖鱘個體中進行篩選，結(jié)果未找到性別特異性標(biāo)記。類似的結(jié)果在歐洲鰉的RAPD標(biāo)記研究中也有發(fā)現(xiàn)[10]。劉洋等[21]用32個微衛(wèi)星標(biāo)記分析了性成熟施氏鱘雌雄個體的遺傳差異，結(jié)果也未找到與性別直接相關(guān)的標(biāo)記。劉雪清等[11]在中華鱘中進行了性別相關(guān)的擴增片段長度多態(tài)性分子標(biāo)記篩選，同樣未能找到性別特異性的AFLP分子標(biāo)記。

結(jié)合本研究及目前為止所有文獻(xiàn)報道的標(biāo)記篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用顯性標(biāo)記RAPD、ISSR和AFLP及共顯性標(biāo)記SSR均未能在鱘魚雌雄個體中找到性別特異性存在的片段。分析原因：①大部分鱘魚是一種多倍體物種[18]，其染色體數(shù)量龐大，目前所篩相關(guān)標(biāo)記位點覆蓋面不夠，同時，鱘魚多倍性的特點也加大了對其性別連鎖標(biāo)記的篩選難度，今后可以繼續(xù)擴大標(biāo)記數(shù)量來進行篩選。②魚類遺傳性別決定的作用機制通常包括性染色體上的特定單基因或常染色體上的多基因所決定[22]。相對于高等脊椎動物，魚類的性染色體決定型相對復(fù)雜，除了主要的XX/XY和ZZ/ZW兩大系統(tǒng)，還存在復(fù)合型的性別決定系統(tǒng)[23]。根據(jù)鱘魚染色體研究結(jié)果，目前為止未能在鱘魚中找到異形的性染色存在[6]，所以鱘魚有可能為多基因決定的性別決定機制，這為性別連鎖標(biāo)記的開發(fā)提高了難度。但由于性別決定系統(tǒng)在同屬的不同種類之間也可能存在差異，所以后續(xù)需要進一步研究達(dá)氏鱘染色體組成結(jié)構(gòu)來確定其有無性染色體的存在。根據(jù)目前鱘魚類性別連鎖位點的研究結(jié)果，提示著通過DNA技術(shù)來篩選鱘魚性別特異性的標(biāo)記均不能獲得成功，將來可能需要更換鱘魚性別決定系統(tǒng)的研究方法，例如通過雌雄性腺的比較轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組學(xué)測序，特別是對性別分化關(guān)鍵階段的性腺進行比較組學(xué)的測序，來篩選性別決定相關(guān)基因，再從性別相關(guān)基因中篩選連鎖的SSR等標(biāo)記。

4 結(jié) 論

本文利用微衛(wèi)星標(biāo)記對達(dá)氏鱘雌雄樣本進行了分型及差異性分析，雖未鑒定出性別特異性位點，但本研究使用了大量的微衛(wèi)星標(biāo)記及驗證樣本，這為今后利用分子標(biāo)記分析鱘魚性別差異位點提供了很重要的參考，同時也為鱘魚性別決定系統(tǒng)的研究提供了理論基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。