張瑞， 王明曉， 安建梅

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041000)

中華蒙潮蟲Mongoloniscussinensis(Dollfus，1901)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門Arthropoda甲殼動(dòng)物亞門Crustacea真軟甲亞綱Eumalacostrace軟甲綱Malacacostra囊蝦總目Peracarida等足目Isopoda潮蟲亞目Oniscidea緣潮蟲科Agnaridae蒙潮蟲屬M(fèi)ongoloniscus(Boykoetal.，2008)，中國特有種。中華蒙潮蟲的環(huán)境適應(yīng)能力非常強(qiáng)，主要分布于山西、北京、內(nèi)蒙古、吉林等地(陳國孝，2000)，是我國古北界典型的溫帶特有種，本課題組在山東、陜西西安、遼寧、天津、河南、河北均發(fā)現(xiàn)該物種。師二燕(2015)基于線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ基因(mtCOⅠ)對(duì)中華蒙潮蟲進(jìn)行了譜系地理研究，共基于26個(gè)居群(跨越5省15市26縣區(qū))進(jìn)行了分析，推測該物種可能的進(jìn)化路線為從北往南，且最有可能的發(fā)源地為我國東北平原。有研究表明，中華蒙潮蟲還可作為環(huán)境的重金屬指示物種(牛曉倩，2015；李夢雯，2016)。關(guān)于多基因聯(lián)合分析中華蒙潮蟲種群遺傳多樣性的相關(guān)研究未見報(bào)道。

分子標(biāo)記以蛋白質(zhì)、核酸的突變?yōu)榛A(chǔ)，檢測生物遺傳結(jié)構(gòu)及其變異(白玉，2007)。動(dòng)物線粒體基因組遵循嚴(yán)格的母系遺傳且分子的各部分均共享同一祖先(Wilsonetal.，2010)，且線粒體基因組進(jìn)化速率快，是單拷貝核DNA的5～10倍，群體內(nèi)變異大，群體遺傳進(jìn)化常用此標(biāo)記(陳復(fù)生等，2003；Itoetal.，2011；Zhouetal.，2011；Lietal.，2012)，也是物種生物地理研究的常用標(biāo)記之一(Aviseetal.，1987；徐慶剛，花保禎，2001；王蘭萍等，2013)。

線粒體內(nèi)不同基因的進(jìn)化速率不同。NADH5氧化還原酶基因(ND5)進(jìn)化速率相當(dāng)快，是種群系統(tǒng)發(fā)育研究中較有效的基因之一(智妍等，2008)。COⅠ基因常用于種以下的系統(tǒng)發(fā)育研究，具有進(jìn)化速率快、富含系統(tǒng)發(fā)育遺傳信息等特點(diǎn)，常用于探討物種分類及近緣種和種群遺傳結(jié)構(gòu)多樣性等系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系(鄧春興，2014；劉平等，2018)。本研究采用基因聯(lián)合(COⅠ+ND5)的方法對(duì)中國華北地區(qū)10個(gè)地理種群89只中華蒙潮蟲進(jìn)行群體遺傳多樣性分析，以期了解華北地區(qū)中華蒙潮蟲種群間的遺傳分化和基因交流。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2011年4月—2018年6月采集了10個(gè)地理種群共89只中華蒙潮蟲(表1，圖1)，標(biāo)本浸泡于無水乙醇。

外群選用海蟑螂Ligiaoceanica(Linnaeus，1767)(GenBank登錄號(hào)：DQ442914)和Cylisticusconvexus(De Geer，1778)(GenBank登錄號(hào)：KR013002)。

表1 中華蒙潮蟲采集信息Table 1 Sampling informations of Mongoloniscus sinensis

圖1 中華蒙潮蟲采樣點(diǎn)Fig. 1 The sample locations of Mongoloniscus sinensis

1.2 DNA的提取及測序

DNA的提取使用Chelex-100法(戴文申等，2007)，選取綠豆大小的中華蒙潮蟲胸足或腹足肌肉于0.5 mL離心管中，加純水清洗，隨后放入干凈的培養(yǎng)皿中晾干。將晾干的組織樣品放入200 μL 5%的Chelex-100離心管中，并加入5 μL 5 mg·mL-1的蛋白激酶，混勻振蕩，確保肌肉組織完全浸沒于Chelex-100的顆粒中。56 ℃ 3 h以上，取出振蕩；100 ℃ 8 min，振蕩；13 000 r·min-1離心3 min，取上清用于PCR擴(kuò)增或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

COⅠ基因引物(Folmeretal.，1994)為COⅠF：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；COⅠR：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。ND5基因引物為877F：5’-TTTATCTTTTGGGTTCGCTA-3’；1608R：5’-TAAAATTAAATCCTTGCCCTC-3’，是選取中華蒙潮蟲ND5基因全序列(GenBank登錄號(hào)：MG729627)的877～1 608 bp片段(編碼區(qū)序列)，用Oligo 7(Rychlik，2007)加上手工調(diào)整而設(shè)計(jì)的。引物合成委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。PCR的擴(kuò)增體系為50 μL：2×HieffTMPCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各3 μL，DNA模板7 μL，ddH2O 12 μL。

PCR在TCA0096擴(kuò)增儀上進(jìn)行：94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s，退火45 s(退火溫度為COⅠ基因：50 ℃；ND5基因：45.5 ℃)，68 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，擴(kuò)增效果良好且足量的樣品原液委托蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行純化及雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測序所得序列峰圖用Geneious(Kearseetal.，2012)檢查和篩選，經(jīng)校驗(yàn)后進(jìn)行序列雙向拼接，剪切掉引物部分，并分別進(jìn)行BLAST搜索以確定每個(gè)基因片段的同源性。所有序列在Geneious中排序比對(duì)。序列拼接使用SequenceMatrix，將2個(gè)基因序列合并為1個(gè)完整序列數(shù)據(jù)集，并命名為COⅠ+ND5。利用PAUP 4.0對(duì)序列集的堿基組進(jìn)行同質(zhì)性檢驗(yàn)。使用MEGA 7(Kumaretal.，2016)對(duì)獲得的序列數(shù)據(jù)集計(jì)算堿基組成、保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)以及序列間的轉(zhuǎn)換顛換比率；采用Kimura(Kimura，1980)雙參數(shù)模型計(jì)算種群遺傳距離。使用DnaSP 5.0(Librado & Rozas，2009)統(tǒng)計(jì)單倍型，計(jì)算各種群核苷酸多樣性(Pi)、單倍型多樣性(Hd)，并構(gòu)建遺傳分化指數(shù)(Fst)，F(xiàn)st反映2個(gè)種群之間的遺傳差異程度，其值與基因流(Nm)成反比，即Fst越大，基因交流程度越??；中性檢驗(yàn)通過計(jì)算Tajima’sD值和Fu’sFs值來表示種群是否經(jīng)歷過擴(kuò)張，二者值接近0時(shí)，種群較為穩(wěn)定，小于0(P<0.05)時(shí)，種群近期經(jīng)歷過擴(kuò)張，大于0時(shí)，種群可能出現(xiàn)了分化(Fu，1997)。構(gòu)建單倍型岐點(diǎn)分布圖，通過可視化曲線觀察種群近期是否經(jīng)歷過擴(kuò)張。系統(tǒng)發(fā)育分析分別采用MEGA 7構(gòu)建最大簡約(MP)樹和MrBayes 3.0(Ronquistetal.，2012)構(gòu)建貝葉斯(BI)樹。BI樹中，由于每個(gè)基因、編碼基因中每個(gè)密碼子位點(diǎn)進(jìn)化速率的不同，采用Partitionfinder 1.1.1(Lanfearetal.，2012)分別對(duì)COⅠ與ND5基因的第一、第二、第三密碼子進(jìn)行分區(qū)計(jì)算。

采用Arlequin 3.5(Excoffer & Lischer，2010)進(jìn)行分子變異分析(AMOVA)。但所有單倍型幾乎未按地理來源分支，因此按照系統(tǒng)發(fā)育劃分出支系進(jìn)行區(qū)域分組，將分布零散的運(yùn)城獨(dú)立為1個(gè)組。使用Network 4.1構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

中華蒙潮蟲COⅠ部分基因長604 bp，ND5部分基因長615 bp，拼接后長度為1 219 bp。對(duì)數(shù)據(jù)集(COⅠ+ND5)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)保守位點(diǎn)716個(gè)，變異位點(diǎn)503個(gè)(占總序列長度41.3%)，其中，單一多態(tài)位點(diǎn)235個(gè)，簡約信息位點(diǎn)268個(gè)。聯(lián)合序列的堿基A、T、C、G平均含量分別為30.8%、41.0%、11.2%、17.0%，A+T(71.8%)明顯高于C+G(28.2%)，符合節(jié)肢動(dòng)物門高A+T含量特點(diǎn)(孫紅英等，2003)，序列間的轉(zhuǎn)換/顛換比值為2.8。

數(shù)據(jù)集(COⅠ+ND5)同質(zhì)化檢驗(yàn)結(jié)果顯示，P=0.053，表明二者為同質(zhì)性樣品，可進(jìn)行聯(lián)合分析。

2.2 單倍型多樣性和遺傳多樣性

89只中華蒙潮蟲線粒體聯(lián)合基因序列(COⅠ+ND5)共45種單倍型(表2)。其中，單倍型H1[北京東城區(qū)(DCQ)、河北石家莊(SJZ)、遼寧葫蘆島(HLD)]、H16[河南新鄉(xiāng)(XX)、山西臨汾(LF)、山西呂梁(LL)] 和H21[SJZ、LL、山東桃村(TC)]為3個(gè)種群間的共享單倍型；H15[LF、山西運(yùn)城(YC)]、H41[XX、陜西西安未央?yún)^(qū)(WYQ)]為2個(gè)種群間的共享單倍型，其余為種群獨(dú)享單倍型，表現(xiàn)出地理種群之間明顯的遺傳分化。10個(gè)種群總的Hd為0.964(DCQ僅1種單倍型，無種群內(nèi)多樣性體現(xiàn))。其余9個(gè)地理種群中，SJZ、HLD、LL、山西大同(DT)、YC顯示出較高的單倍型多樣性(Hd>0.900)，但總體核苷酸多樣性(0.005 6)較低。

2.3 種群間的遺傳距離和遺傳分化

WYQ、LF與XX之間的遺傳距離最小(0.00～0.01)，這3個(gè)種群與其他種群的遺傳距離隨著地理位置增大，越往北延伸遺傳距離越大。DT和其他9個(gè)種群的遺傳距離均較大(0.08～0.11)，DCQ與HLD種群的遺傳距離為0。所有種群的平均遺傳距離為0.06。

Fst<0.150的種群主要有：TC與HLD、LL與SJZ、DCQ與HLD、YC與LL和SJZ，以及SJZ與LL。LF、WYQ和XX這3個(gè)種群分別與DCQ和HLD種群的遺傳分化系數(shù)較大(Fst>0.900)，基因交流水平貧乏，絕大多數(shù)種群之間的遺傳分化系數(shù)為0.150～0.500(表3)。平均Fst為0.513，平均Nm為0.24。

2.4 種群動(dòng)態(tài)分析

僅TC種群顯示出明顯的種群擴(kuò)張(P<0.05)，XX和HLD種群的Tajima’sD雖為負(fù)值，但均不顯著，未達(dá)到種群擴(kuò)張(P>0.10)。SJZ種群的Tajima’sD值為不顯著負(fù)值(0.05

表2 中華蒙潮蟲(COⅠ+ND5)聯(lián)合基因單倍型分布Table 2 Haplotypes of mt DNA (COⅠ+ND5) genes of Mongoloniscus sinensis

表3 中華蒙潮蟲(COⅠ+ND5)序列的種群遺傳距離(對(duì)角線上方)和各種群間遺傳分化系數(shù)(對(duì)角線下方)Table 3 Genetic distance (above diagonal) and pairwise fixation indices of genetic variation (below diagonal) of Mongoloniscus sinensis among different populations based on COⅠ and ND5 genes

單倍型歧點(diǎn)分析結(jié)果見圖2?；?0個(gè)種群的所有單倍型的岐點(diǎn)分布曲線未成單一峰型，表明中華蒙潮蟲近期未曾經(jīng)歷種群擴(kuò)張事件，即種群之間存在一定程度的分化。這與種群之間較大的遺傳分化系數(shù)吻合。

2.5 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

Partitionfinder計(jì)算所得COⅠ+ND5聯(lián)合序列的最佳分區(qū)方案和各區(qū)最適核苷酸替代模型見表4。

中華蒙潮蟲不同地理種群的單倍型系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系幾乎得到了完全一致的系統(tǒng)發(fā)育樹，僅節(jié)點(diǎn)支持率略有差異，這里僅顯示BI樹(圖3)。中華蒙潮蟲個(gè)別地理種群的單倍型并沒有完全按照地理來源形成明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。單倍型較好的DCQ、HLD、DT、WYQ、XX以及LF種群按地理分布進(jìn)行劃分，其余種群如YC、SJZ、LL以及TC種群則出現(xiàn)了單倍型混雜的分布情況。按照進(jìn)化的先后以及不同地理種群的單倍型聚合情況大致可以分為5個(gè)主要支系；C1為DT；隨之進(jìn)化出的主要類群為TC和SJZ，劃分為C2；C3主要為DCQ和HLD；LL雖分布零散，但絕大部分個(gè)體位于C3之后，因此劃分為C4；最后演化出的是WYQ、LF及XX種群，劃分為C5；YC單倍型個(gè)體在各個(gè)支系均有涉及，主要分布于C4與C5。

圖2 所有單倍型總體錯(cuò)配分布Fig. 2 Mismatch distribution analysis for all haplotypes

2.6 分子變異分析

用Arlequin對(duì)劃分后的5個(gè)組進(jìn)行分子變異分析，中華蒙潮蟲的分子變異在各組間以及種群內(nèi)差異不大，種群內(nèi)略高(53.12%)(表5)。

表5 基于COⅠ與ND5組合的組間和群體間的變異分析Table 5 AMOVA analysis for Mongoloniscus sinensis among groups and populations based on COⅠ and ND5 genes

2.7 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析

中華蒙潮蟲各個(gè)地理種群的單倍型幾乎未按地理來源進(jìn)行劃分，這與分子系統(tǒng)樹所得結(jié)果一致。單倍型H1、H21及H16出現(xiàn)的頻率較高且屬于2～3個(gè)種群的共享單倍型，推測其為祖先類型。LL、SJZ種群較為分散，與系統(tǒng)樹類型一致；WYQ、LF及XX種群明顯聚成一個(gè)簇群。

3 討論

遺傳多樣性是生態(tài)系統(tǒng)多樣性、物種多樣性和景觀多樣性的基礎(chǔ)，通常遺傳多樣性最直接的表現(xiàn)形式就是決定進(jìn)化潛力的遺傳變異水平。對(duì)于任何一個(gè)物種而言，個(gè)體生命雖短暫，但種群或種群系統(tǒng)在自然界卻具有特定的分布格局，這些分布格局會(huì)隨著外界條件不斷發(fā)生改變，因此，遺傳多樣性不僅包括變異水平的高低，而且包括變異的分布格局(Shen & Liu，2001)。

中華蒙潮蟲屬于生物圈中分布極廣的節(jié)肢動(dòng)物門，雖不如昆蟲綱Insecta種類繁多，但也具備極強(qiáng)的繁殖生長能力，種群數(shù)量相對(duì)較大。該物種的研究報(bào)道十分稀少，遺傳多樣性的研究也非常薄弱。本研究首次聯(lián)合使用COⅠ及ND5基因序列對(duì)我國華北地區(qū)中華蒙潮蟲種群遺傳多樣性進(jìn)行了探討。

圖3 基于COⅠ與ND5基因組合序列構(gòu)建的中華蒙潮蟲貝葉斯樹Fig. 3 Bayesian tree of Mongoloniscus sinensis based on COⅠ and ND5 genes

圖4 中華蒙潮蟲(COⅠ+ND5)單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 Haplotype network of Mongoloniscus sinensis based on COⅠ and ND5 genes

3.1 種群遺傳多樣性

衡量一個(gè)種群遺傳多樣性水平可通過Hd及Pi綜合體現(xiàn)。本研究中，DCQ種群僅1種單倍型，該地區(qū)的遺傳分化極為貧乏，結(jié)合目前城市化水平的升高導(dǎo)致物種棲息地破壞、生境破碎、基因交流斷裂，加之北京西部是太行山余脈的西山，北部是燕山山脈的軍都山，兩山在南口關(guān)溝相交形成的大山彎，山脈的阻隔降低種群交流的程度。SJZ種群的Hd(0.964)和Pi(0.058 0)均顯示出較高的遺傳多樣性；HLD、LL、DT和TC種群均具有較高的Hd(>0.900)，但Pi整體不高。一般認(rèn)為，如果1個(gè)種群有較高的Hd，但核苷酸水平較低，推測可能是種群的建群者效應(yīng)，即1個(gè)較小的有效種群通過內(nèi)部的變異，積累了大量單倍型多態(tài)性，但卻未達(dá)到積累核苷酸序列多樣性的水平，由此種群迅速增長(Wright，1943)。所有種群顯示出較高的Hd以及較低的Pi，據(jù)此推斷華北地區(qū)中華蒙潮蟲種群遺傳多樣性水平中等。

3.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)

種群遺傳結(jié)構(gòu)的差異是遺傳多樣性的重要體現(xiàn)，種群遺傳變異決定該種群內(nèi)物種進(jìn)化潛力以及抵御不良環(huán)境的能力(Grant，1991)。單倍型岐點(diǎn)圖以及中性檢驗(yàn)顯示該種群近期未經(jīng)歷擴(kuò)張，但總體有平穩(wěn)分化現(xiàn)象?；贏MOVA顯示，中華蒙潮蟲的變異主要來自種群內(nèi)部，F(xiàn)st(0.513)顯示各個(gè)種群之間遺傳分化程度明顯，平均Nm(0.24)很低，考慮中華蒙潮蟲是陸地爬行類物種，因此，生境限制其無法遠(yuǎn)距離活動(dòng)，造成種群之間交流稀缺，這也是中華蒙潮蟲種群內(nèi)部不斷分化的原因。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

中華蒙潮蟲作為中國古北界特有種，BI樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，不同種群之間的單倍型并未完全按地理來源進(jìn)行分布。位于系統(tǒng)發(fā)育起始端主要為華北偏北地區(qū)的種群，如DT、SJZ；而最后演化出來的為WYQ、LF和XX的全部個(gè)體，這也在一定程度上與師二燕(2015)的研究結(jié)果相吻合，即中華蒙潮蟲的主要演化路線為從北向南，同理，與冰川影響下物種的遷移路線基本吻合。另外，TC及YC的單倍型個(gè)體較為分散。Hap36(TC)是除外群之外最早分化出的一種單倍型，考慮山東位于黃河下游，東臨渤海黃海，且中華蒙潮蟲的進(jìn)化未經(jīng)歷淡水階段，直接從海洋過渡到陸生(Brolyetal.，2013)，可以將Hap36看做中華蒙潮蟲的原始單倍型；其次Hap39/37/38(TC)與緯度較為接近的SJZ主要支系交叉分布；基于中性檢驗(yàn)分析，TC數(shù)據(jù)顯著，近期可能經(jīng)歷了擴(kuò)張。YC樣本量雖偏少，但結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹以及單倍型分布情況，主要?jiǎng)澐譃镃4與C5支系，其地理位置與演化情況幾乎和研究結(jié)果相一致，推測數(shù)據(jù)對(duì)路徑的演化影響不大。

本研究中，由于個(gè)別種群采集數(shù)量較少，單倍型分布零散，考慮小的樣本量可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定偏差，后期將繼續(xù)加大樣本量，完善數(shù)據(jù)信息。近年來分子標(biāo)記作為生物學(xué)領(lǐng)域一個(gè)強(qiáng)有力的工具，在遺傳多樣性以及生態(tài)領(lǐng)域均發(fā)揮重要作用，然而，當(dāng)種群樣本數(shù)很少或不平均的情況下，利用分子標(biāo)記對(duì)遺傳多樣性和遺傳分化進(jìn)行解釋就需要謹(jǐn)慎。樣本數(shù)太大會(huì)花費(fèi)很多時(shí)間、資源和經(jīng)費(fèi)，而樣本數(shù)太小往往會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論(王麗等，2010)，因此，樣本量是一個(gè)非常重要的問題。后期應(yīng)加大采集量，轉(zhuǎn)向南方未涉及到的區(qū)域，加大種群覆蓋地區(qū)，細(xì)化中華蒙潮蟲的系統(tǒng)演化路徑以及種群分布的動(dòng)態(tài)情況。

4 結(jié)語

土壤中生活著豐富的生物類群，它們?cè)谧匀簧鷳B(tài)系統(tǒng)中扮演著消費(fèi)者和分解者的角色，是重要的地下生物寶庫，對(duì)全球物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)起著不可替代的作用。然而，由于人類活動(dòng)的強(qiáng)烈干擾，生境的不斷喪失，土壤生物多樣性已日趨減少，這又加劇了土地的退化。由于土壤生物與地上動(dòng)植物息息相關(guān)，只有將對(duì)二者的保護(hù)結(jié)合起來，才能實(shí)現(xiàn)完整的全球意義上的生物多樣性保護(hù)(章家恩，1999)。本研究基于線粒體COⅠ和ND5基因的聯(lián)合序列，對(duì)華北地區(qū)中華蒙潮蟲遺傳多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性處于中等水平，主要變異來自于種群內(nèi)部，個(gè)別種群的單倍型沒有完全按照地理分布形成簇群；系統(tǒng)發(fā)育和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，基于華北地區(qū)10個(gè)種群的中華蒙潮蟲的主要演化是從北向南，但存在個(gè)別單倍型的混雜分布。本研究基于多基因的聯(lián)合分析與師二燕(2015)基于單基因的研究結(jié)果基本一致，這也與Avise(2009)對(duì)系統(tǒng)地理學(xué)歸納的第六種模式相吻合，即“即使一個(gè)單一的線粒體基因樹也能提供重要的生物學(xué)見解”。后期，將擴(kuò)大采集范圍(由古北界向東洋界過渡)，完善該物種在中國的分布地區(qū)，結(jié)合形態(tài)標(biāo)記與核基因進(jìn)行中華蒙潮蟲演化路徑的研究。