岳冬梅，王林美，李佩佩，葉 博，趙振軍，張 波，李樹英，范 琦

(遼寧省海洋水產科學研究院/大連生物技術研究所，遼寧大連 116024)

柞蠶(Antheraeaepemyi)為鱗翅目大蠶蛾科柞蠶屬昆蟲，是我國特有的昆蟲資源，有著悠久的放養(yǎng)歷史。作為我國傳統(tǒng)的食用昆蟲、泌絲昆蟲及工業(yè)原料，柞蠶為國家外貿的增長和人們生活水平的提高做出了重大貢獻。然而，柞蠶業(yè)的發(fā)展受到柞蠶微粒子病的困擾，柞蠶微粒子病在絲繭生產上一般年份的發(fā)病率為30%～70%，有些年份可高達90%以上[1]，給柞蠶生產帶來了重大的經濟損失，蠶農每年損失達上億元。因此，迫切需要探明微粒子病病原的發(fā)育特點、侵染方式和分子特征，從而建立更有效的微粒子病防控體系，減少柞蠶業(yè)損失。

柞蠶微粒子病現(xiàn)已證實是由微孢子蟲(Microsporidium)侵染柞蠶導致，微孢子蟲屬微孢子門微孢子目，是專性細胞內寄生的單細胞真核生物[2]，無法直接進行離體培養(yǎng)，只能通過細胞及活體材料等進行培養(yǎng)、增殖。已報道微孢子蟲屬超過150個、種超過1 400個[3]，宿主范圍包括脊椎和無脊椎動物。目前研究發(fā)現(xiàn)，柞蠶微粒子病主要病原除柞蠶微孢子蟲(Nosemapernyi，Np)外，還有柞蠶微孢子新種(Nosemasp)、修飾內網蟲(Endoreticulatusschubergi)、訥卡變形孢蟲(Vairimorphanecatrix)和鏈孢變形孢蟲(Vairimorphachainsporum)[4-5]。

在細胞和分子水平上分析微孢子蟲種株及發(fā)育機制是開展早期檢測、預防及開發(fā)治療藥物的基礎，因而建立柞蠶微孢子蟲有效的體外培養(yǎng)方法，分離感染柞蠶的不同微孢子蟲株，建立柞蠶微孢子蟲分離、培養(yǎng)和保存的技術體系十分必要，這將加快對柞蠶微孢子蟲發(fā)育特點、侵染方式及分子特征的了解，從而有效提升柞蠶微粒子病的控制，降低柞蠶業(yè)損失。

1 材料與方法

1.1材料和主要儀器設備柞蠶品種為二化性青六號，鳳城蠶業(yè)研究所提供。相差倒置熒光顯微鏡(Leica，德國)；超凈工作臺(蘇州蘇凈集團)；低速離心機(上海安亭科學儀器廠)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)；細胞培養(yǎng)瓶及吸管(江蘇江陰科學器材公司)。TC-100培養(yǎng)基購自德國PAN公司；胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)購自美國Hyclone公司；青鏈霉素混合液(青霉素、鏈霉素各10 000 單位/mL)購自北京索萊寶科技有限公司；柞蠶微孢子蟲為研究室制備。

1.2柞蠶微孢子蟲的分離

1.2.1接種用柞蠶微孢子蟲的制備。將野外采集的發(fā)病材料參照姜義仁等[6]的方法，經Percoll密度梯度離心法精制微孢子蟲，生理鹽水調制成濃度為108個/mL孢子懸液，置于4 ℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2柞蠶微孢子蟲添食柞蠶。飼養(yǎng)柞蠶至5齡起蠶，按照每頭蠶添食 600個柞蠶微孢子蟲的用量，將制備好的微孢子蟲混懸液稀釋成6×104個/mL，取10 μL孢子液涂抹在約2 cm2的柞葉上，每頭蠶飼喂1片葉進行添食，而后正常放養(yǎng)柞蠶直至上簇結繭。

1.2.3原代細胞培養(yǎng)法分離柞蠶微孢子蟲。將感染柞蠶微孢子蟲的蠶蛹，用75%乙醇浸泡15 min，于超凈臺內無菌水沖洗2～3次，放置于無菌紗布上吸干體表水分。無菌操作剪開腹部，取柞蠶蛹單個卵巢或精巢組織，于無菌的盛有生理鹽水的小平皿中，剔除卵巢或精巢上粘連的脂肪組織和被膜等，放置于200目滅菌不銹鋼MLM-篩網上，無菌小棒研磨，用400 mL的TC-100培養(yǎng)液沖洗，接種于48孔細胞培養(yǎng)板(底面積為0.7 cm2/孔)中，置于 27 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天利用相差倒置熒光顯微鏡觀察細胞生長及孢子增殖情況，5～7 d后篩選出有孢子增殖的無其他污染物的柞蠶原代細胞。

1.3柞蠶微孢子蟲在卵巢原代細胞中的擴繁

1.3.1柞蠶正常卵巢原代細胞的制備。取多個健康柞蠶雌蛹，用75%乙醇浸泡15 min，于超凈臺內無菌水沖洗2～3次，放置于無菌紗布上吸干體表水分。無菌操作剪開腹部，用眼科剪刀和鑷子解剖取出卵巢組織，放置于盛有無菌生理鹽水的小平皿中，剔除卵巢上粘連的脂肪組織和被膜等，再將卵巢轉移至盛有無菌生理鹽水的小燒杯中，洗滌3次。將卵巢組織剪成0.5～1.0 mm3大小的組織塊，加細胞培養(yǎng)液，用滅菌吸管溫和抽吸后，直接將懸液連同組織塊一起接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，將小塊均勻涂布于板底[7]。一般每孔接種10～15個卵巢為宜，然后于培養(yǎng)孔中加入適量培養(yǎng)基，27 ℃靜置培養(yǎng)，5～7 d更換1/3培養(yǎng)液。

1.3.2柞蠶微孢子蟲在卵巢原代細胞中的擴大培養(yǎng)。將單個卵巢或精巢組織培養(yǎng)的柞蠶微孢子蟲懸液，每5～7 d按1∶2的比例加入健康蛹制備的生長狀態(tài)良好的柞蠶卵巢原代細胞中，用吸管輕輕混勻后，27 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天觀察微孢子蟲增殖擴繁情況。

1.4柞蠶微孢子蟲在柞蠶蛹中的擴繁將通過卵巢原代細胞培養(yǎng)增殖出的微孢子蟲培養(yǎng)液，5 000 r/min離心5 min，去上清，加入500 μL 0.2 mol/L的KOH溶液，靜置于27 ℃條件下發(fā)芽40 min[8]，然后用生理鹽水調孢子濃度至1×106個/mL，蛹體表面乙醇消毒，然后用一次性無菌注射器注射柞蠶健康蛹，每個蛹注射100 μL，將未經發(fā)芽處理的孢子，生理鹽水調濃度至1×106個/mL，直接注射柞蠶蛹作為對照組，室溫下培養(yǎng)7 d后，轉入4 ℃低溫保存。

1.5柞蠶微孢子蟲的繼代和保存低溫保存的微孢子蟲注射蛹，依次用75%乙醇浸泡15 min、無菌水沖洗2～3次。無菌條件下取柞蠶蛹單個卵巢或精巢組織，按“1.2.3”中方法制備原代細胞。27 ℃靜置培養(yǎng)，待微孢子蟲增殖后，即分離到柞蠶微孢子蟲一代，然后再次采用單卵巢(精巢)制備原代細胞分離孢子、正常卵巢原代細胞擴繁孢子和注射柞蠶健康蛹繼代保存微孢子蟲的交替方法，實現(xiàn)柞蠶微孢子蟲株(系)的分離、繼代、擴繁及保存。

2 結果與分析

2.1柞蠶微孢子蟲的分離及在原代細胞中的擴大培養(yǎng)采用單個精巢或卵巢制備原代細胞，分離培養(yǎng)柞蠶微孢子蟲的方法，分離篩選出無其他污染物的柞蠶微孢子蟲，結果如圖1所示。圖1C和圖1D分別是經過5～7 d培養(yǎng)后，單個精巢和單個卵巢組織制備的原代細胞中培養(yǎng)增殖出的微孢子蟲情況，可見2種原代細胞均可以培養(yǎng)增殖出柞蠶微孢子蟲。

注：A.單精巢制備的原代細胞；B.單卵巢制備的原代細胞；C.單精巢原代細胞分離培養(yǎng)的柞蠶微孢子蟲；D.單卵巢原代細胞分離培養(yǎng)的柞蠶微孢子蟲Note：A.Primary cells prepared from single testis；B.Primary cells prepared from single ovary；C.Isolation and culture of N. pernyi from single testis primary cells；D.Isolation and culture of N. pernyi from single ovary primary cells圖1 柞蠶微孢子蟲的分離培養(yǎng)Fig.1 Isolation and culture of N. pernyi

將分離培養(yǎng)出的柞蠶微孢子蟲在正常卵巢原代細胞中進行擴繁培養(yǎng)(圖2A)，柞蠶微孢子蟲可以繼續(xù)感染原代細胞，進而大量增殖擴繁。

柞蠶卵巢原代細胞的培養(yǎng)方法最為成熟，且細胞狀態(tài)好，不易褐化死亡，存活時間較長，利于微孢子蟲的增殖。將分離培養(yǎng)出的柞蠶微孢子蟲在正常卵巢原代細胞中進行擴大培養(yǎng)(圖2B)，柞蠶微孢子蟲可以在原代細胞中不斷擴繁，5～10 d增殖速度較快，15～20 d增殖速度變緩，變緩原因可能與原代細胞后期狀態(tài)變差、部分細胞死亡有關。

圖2 柞蠶微孢子蟲在卵巢原代細胞中的擴大培養(yǎng)Fig.2 Expansion culture of N. pernyi in ovary primary cells

2.2柞蠶微孢子蟲在柞蠶蛹中的擴繁圖3為柞蠶蛹注射了柞蠶微孢子蟲后，其精巢和卵巢原代細胞增殖培養(yǎng)微孢子蟲情況，結果表明，孢子注射蛹體后可以繼續(xù)感染蛹的精巢和卵巢組織，且分離的精巢和卵巢原代細胞可以大量增殖出柞蠶微孢子蟲。

注：A.精巢原代細胞；B.卵巢原代細胞Note：A.Primary culture of testis cells；B.Primary culture of ovary cells圖3 注射孢子后柞蠶蛹的單卵巢(精巢)原代細胞分離增殖的柞蠶微孢子蟲Fig.3 Isolation and proliferation of N. pernyi from primary cells of single ovary(testis)of A. pernyi pupa after injecting spore

表1為不同保存溫度條件下柞蠶蛹中微孢子蟲增殖情況，結果表明，4 ℃存放條件下柞蠶微孢子蟲對蠶蛹感染率低且增殖十分緩慢；22 ℃存放條件下柞蠶蛹孢子可以在蛹中快速大量增殖，有利于短期內獲得大量微孢子蟲，但柞蠶蛹發(fā)病嚴重容易死亡，進而不利于孢子的長期儲存；在22 ℃條件下放置7 d后，轉入4 ℃存放條件下柞蠶微孢子蟲可以高效感染柞蠶蛹，且微孢子蟲在蛹中緩慢增殖，對柞蠶蛹影響較小，有利于微孢子蟲的長期儲存。

表1 柞蠶微孢子蟲在柞蠶蛹中的擴繁情況

注：變溫表示22 ℃培養(yǎng)7 d后轉入4 ℃；柞蠶蛹初始注射濃度為1×106個/蛹

Note：Variable temperature means 22 ℃ training after 7 days to 4 ℃，initial injection concentration ofA.pernyipupa was 1×106spores/pupa

2.3柞蠶微孢子蟲的保存圖4為儲存不同時間后柞蠶微孢子蟲的發(fā)芽情況，注射前微孢子蟲發(fā)芽率為52.41%，注射后的柞蠶蛹在4 ℃儲存90 d與180 d的微孢子蟲發(fā)芽率分別為65.68%、64.84%，二者發(fā)芽率沒有明顯差別，并較注射前微孢子蟲發(fā)芽率略高，說明微孢子蟲在蛹體儲存過程中保持較好活力，可長期保存。

注：A.保存90 d；B.保存180 d；黑色箭頭為未發(fā)芽微孢子蟲；白色箭頭為發(fā)芽后微孢子蟲Note：A.Keep for 90 days；B.Keep for 180 days；Black arrow.Ungerminated spores;White arrow.Germinated spores圖4 柞蠶蛹中儲存的柞蠶微孢子蟲發(fā)芽情況(400×)Fig.4 Germination of N. pernyi stored in A. pernyi pupa(400×)

圖5是不同保存條件下儲存90 d后，柞蠶微孢子蟲的發(fā)芽情況，儲存于0～4 ℃活蛹體內的柞蠶微孢子蟲發(fā)芽率達65.68%，遠遠高于其他儲存條件下微孢子蟲的發(fā)芽率，表明在4 ℃低溫活蛹儲存條件下，最有利于微孢子蟲活力的保持。

注：1.4 ℃保存，柞蠶蛹體；2.4 ℃保存，生理鹽水；3.-20 ℃保存，生理鹽水；4.液氮保存，生理鹽水；5.液氮保存，30 %甘油；6.液氮保存，10%DMSONote:1.4 ℃ cryopreservation，pupa;2.4 ℃ cryopreservation，physiological saline;3.-20 ℃ cryopreservation，physiological saline;4.Liquid nitrogen cryopreservation，physiological saline;5.Liquid nitrogen cryopreservation，30% glycerin;6.Liquid nitrogen cryopreservation，10% dimethy sulfoxide圖5 不同保存條件下柞蠶微孢子蟲發(fā)芽率Fig.5 The germination rate of N. pernyi under different preservation conditions

3 討論

目前家蠶微孢子蟲株分離及體外培養(yǎng)的相關研究已取得了很多進展，但柞蠶微孢子蟲在這方面的研究鮮有報道。家蠶微孢子蟲株的分離，多采用幼蟲期添食微孢子蟲，染病家蠶在室內人工飼養(yǎng)傳代，微孢子蟲在家蠶體內不斷增殖，經過多代傳代培養(yǎng)后，繼而分離出優(yōu)勢的微孢子蟲株。然而，柞蠶不同于家蠶，它是野外放養(yǎng)昆蟲，生長環(huán)境復雜，室內飼養(yǎng)很難成活，因而無法采用這種方法分離微孢子蟲的純凈株，且這種方法周期長，費時費力，添食不當或環(huán)境污染等因素很容易引起其他微孢子蟲株的二次污染。

家蠶微孢子蟲株體外培養(yǎng)方面，現(xiàn)在主要通過穩(wěn)定的家蠶細胞系和可被家蠶微孢子蟲侵染的其他昆蟲細胞系來實現(xiàn)。這種方法需要先從家蠶體中獲得家蠶微孢子蟲，讓其侵染細胞，隨著細胞的傳代培養(yǎng)，微孢子蟲在細胞內不斷增殖，經過多代培養(yǎng)后逐漸分離出家蠶微孢子蟲株，并隨著細胞繼代培養(yǎng)而保存下來，從而實現(xiàn)家蠶微孢子蟲的分離、培養(yǎng)及保存[9-12]。但這些方法的首要前提是需要穩(wěn)定的細胞系且該細胞系能被微孢子蟲感染、微孢子蟲在侵染細胞后能在細胞中不斷增殖。

柞蠶微孢子蟲株分離及體外培養(yǎng)技術的建立存在相當大的難度，因為尚未有穩(wěn)定地柞蠶細胞系建立，雖然柞蠶卵巢細胞已被公開能被柞蠶微孢子蟲侵染，但其繼代培養(yǎng)十分困難，難以使柞蠶微孢子蟲長期穩(wěn)定地進行傳代、增殖。同時，前期工作顯示柞蠶微孢子蟲在其他昆蟲細胞系sf21、High5和BmN中不能侵染和增殖，因而通過侵染細胞、進行細胞傳代培養(yǎng)來實現(xiàn)柞蠶微孢子蟲株(系)的培養(yǎng)、增殖及保存，借鑒現(xiàn)有技術很難實現(xiàn)。

該研究采用柞蠶精巢或卵巢原代細胞增殖柞蠶微孢子蟲。柞蠶精巢或卵巢原代細胞是從柞蠶體內分離，是柞蠶微孢子蟲的天然宿主細胞，因而具備柞蠶微孢子蟲感染增殖的最佳條件，相較其他異源細胞更適于孢子侵染增殖[13-14]。利用柞蠶蛹進行柞蠶微孢子蟲的增殖培養(yǎng)及保存，相比現(xiàn)行依賴細胞系的技術具有顯著優(yōu)勢：①作為柞蠶微孢子蟲繼代培養(yǎng)、保存的載體，材料易得，儲存容易，便于操作。柞蠶是野外放養(yǎng)的變態(tài)昆蟲，1年可放養(yǎng)1～2次，以蛹期滯育越冬，因而可以長期儲存，低溫條件下柞蠶蛹最長可儲存1年之久。以柞蠶蛹進行柞蠶微孢子蟲的培養(yǎng)及保存，顯著降低科研工作者勞動量，節(jié)約資源。②較其他生物材料而言，柞蠶蛹期體積較大且不能運動，易于操作，便于宿主大規(guī)模增殖、保存微孢子蟲。③柞蠶蛹無需進食，蛹體內部是獨立封閉的空間，不易受外界環(huán)境干擾，從而保證了體內培養(yǎng)和儲存的微孢子蟲的純凈度。④相比依賴細胞系培養(yǎng)、保存微孢子蟲的現(xiàn)有技術而言，柞蠶蛹作為生物材料，存活時間長，培養(yǎng)、保存的柞蠶微孢子蟲活力強，不易退化[15]。

該研究建立的柞蠶微孢子蟲體外培養(yǎng)技術體系能逐漸分離得到柞蠶微孢子蟲的不同株，并使柞蠶微孢子蟲得以擴繁和長期保存，這將加速柞蠶微孢子蟲的侵染機制、功能基因組學、流行病學等相關研究，從而創(chuàng)新柞蠶微粒子病防控技術手段，顯著降低柞蠶業(yè)經濟損失，提升我國柞蠶業(yè)產值。