琺菲亞協(xié)同戊巴比妥鈉改善睡眠作用的研究

趙 穎，彭紀銘，路 娟，柴瑞平，呂欣鍇，陳 曦*

（1.中國醫(yī)學科學院·北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193；2.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355）

睡眠與覺醒是機體外在表現(xiàn)的兩種不同狀態(tài)，二者晝夜交替往復(fù)，保證機體在各種腦力和體力活動過后得以充分休息及恢復(fù)，從而更好地適應(yīng)環(huán)境變化[1]。睡眠有多種生理功能，如：對學習記憶的相關(guān)信息在大腦皮層進行重組與處理，深化記憶力；對于機體受損細胞有一定修復(fù)功能；保證免疫及代謝系統(tǒng)能有條不紊地運行[2]?，F(xiàn)今社會人們承受來自不同方面的壓力越來越多，睡眠剝奪已經(jīng)普遍地影響到人們的身體健康及生活習慣，臨床分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)?；加兴邉儕Z易引發(fā)抑郁癥及精神分裂等其他相關(guān)精神疾病[3]。

琺菲亞，為莧科Amaranthaceae植物巴西人參Pfaffia glomerata的根，在當?shù)孛耖g應(yīng)用史已有300多年，其藥理作用有抗腫瘤、抗炎、壯陽、鎮(zhèn)靜、保護胃黏膜、抗疲勞和增強免疫力等[4-8]。目前關(guān)于琺菲亞改善睡眠作用的研究較少，F(xiàn)enner等[9]研究證實琺菲亞有改善睡眠的作用，其他并未見相關(guān)文獻報道。通過預(yù)實驗，作者發(fā)現(xiàn)琺菲亞改善睡眠作用的有效部位與Fenner報道并不吻合。本研究考察了腹腔注射閾劑量和閾下劑量戊巴比妥鈉的協(xié)同睡眠實驗，通過觀察統(tǒng)計小鼠睡眠潛伏期、睡眠時間和睡眠發(fā)生率確定琺菲亞改善睡眠的作用及其量效及時效關(guān)系，并通過檢測小鼠皮質(zhì)、海馬和下丘腦中多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）、谷氨酸（Glu）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）的含量研究琺菲亞改善睡眠的作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YP10002電子天平（上海越平）；AB265-S電子天平（梅特勒-托利多）；TH101溫濕度計（歐達時科技）；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津泰斯特）；LD-T100粉碎機（上海頂帥）；eppendorf移液槍（艾本德）；2-16R低溫離心機（上海托莫斯）；MX-F渦旋混勻器（北京大龍）；全波長多功能酶標儀（瑞士TECAN）；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特）；

1.2 藥品與試劑

琺菲亞為莧科Amaranthaceae植物巴西人參Pfaffia glomerata的根，由浙江琺菲亞生物科技有限公司提供；地西泮（北京益民藥業(yè)，批號H11020898）；羧甲基纖維素鈉（天津光復(fù)精細化工研究所，批號20150529）；戊巴比妥鈉（成都華夏，批號922L0314）；多巴胺ELISA檢測試劑盒（南京建成，批號20161215）；谷氨酸ELISA檢測試劑盒（南京建成，批號20161216）；一氧化氮ELISA檢測試劑盒（南京建成，批號20161209）；5-羥色胺ELISA檢測試劑盒（南京建成，批號20161215）；去甲腎上腺素ELISA檢測試劑盒（南京建成，批號20161215）；一氧化氮合酶 ELISA檢測試劑盒（南京建成，批號20161206）；

1.3 實驗動物

ICR品系小鼠，體重18～20g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2016-0002。動物飼養(yǎng)于SPF級動物房（溫度23±2 ℃，濕度45%±15%，12:12h明暗交替，動物自主進食進水），實驗單位使用許可證編號：SYXK（京）2017-0020。

2 方法

2.1 琺菲亞水提物溶液的制備

準確稱取一定量法菲亞藥材，置于圓底燒瓶中，加16倍量蒸餾水回流提取1 h，二次加10倍量蒸餾水回流提取1 h，合并濾液，100 ℃水浴蒸發(fā)濃縮，然后60 ℃真空干燥。取干燥的琺菲亞水提物加0.5% CMC-Na溶液分別配制成含0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g生藥/ml琺菲亞水提物溶液，待用。

2.2 琺菲亞水提物對閾劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠潛伏期、睡眠時間的影響及閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠發(fā)生率的影響

將60只小鼠隨機分為6組，每組10只。閾劑量組與閾下劑量組均經(jīng)灌胃給予琺菲亞水提物6 g生藥/kg體重，兩組空白對照組給予0.5%CMC-Na，兩組陽性對照組給予地西泮15 mg/kg，給藥體積均為0.02 ml/g。連續(xù)給藥14 d，末次給藥1 h后，閾劑量組腹腔注射戊巴比妥鈉44 mg/kg，閾下劑量組腹腔注射戊巴比妥鈉29 mg/kg，注射體積0.01ml/g，分別記錄閾劑量組、閾劑量空白對照組及閾劑量陽性對照組睡眠潛伏期與睡眠持續(xù)時間，以及閾下劑量組、閾下劑量陽性對照組睡眠發(fā)生率。

2.3 琺菲亞水提物改善睡眠作用的量效關(guān)系研究

將72只小鼠隨機分成6組，每組12只。除空白組外各組分別經(jīng)灌胃給予不同濃度的琺菲亞水提物溶液，即2，4，8，12，16 g生藥/kg體重，空白對照組給予0.5%CMC-Na，注射體積均為0.02 ml/g。連續(xù)給藥14 d，于末次給藥1 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉44 mg/kg，注射體積0.01 ml/g，分別記錄各組睡眠潛伏期與睡眠持續(xù)時間。

2.4 琺菲亞水提物改善睡眠作用的時效關(guān)系研究

將72只小鼠隨機分成6組，每組12只。除空白對照組外各組均經(jīng)灌胃給予琺菲亞水提物溶液16 g生藥/kg體重，連續(xù)給藥時間分別為1，5，10，14，21 d，空白對照組給予0.5%CMC-Na，給藥體積均為0.02 ml/g。末次給藥1 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉44 mg/kg，注射體積0.01ml/g，分別記錄各組睡眠潛伏期與睡眠持續(xù)時間。

2.5 琺菲亞水提物對小鼠腦內(nèi)DA、NE、5-HT、GLU、NO、NOS含量的影響

將24只小鼠隨機分為2組，分別為空白對照組和給藥組，每組12只。給藥組灌胃給予琺菲亞水提物溶液16 g生藥/kg體重，空白對照組給予0.5%CMCNa，給藥體積為0.02 ml/g，連續(xù)給藥14 d，末次給藥1 h后，斷頭處死，冰浴上剝離全腦，快速分離皮質(zhì)、下丘腦、海馬稱重。用冷的生理鹽水研磨，14 000 r/min離心10 min，取上清，按照試劑盒說明測定DA、NE、GLU、NO、NOS、5-HT含量。

2.6 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 琺菲亞水提物對閾劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠潛伏期、睡眠時間的影響及閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠發(fā)生率的影響

結(jié)果表明，陽性對照地西泮組能極顯著縮短小鼠睡眠入睡潛伏期，并能延長小鼠睡眠時間，顯著提高小鼠的睡眠發(fā)生率，三者與空白組比較有極顯著性差異（P＜0.01），表明該實驗方法可靠。給予琺菲亞水提物的閾劑量組能顯著延長小鼠睡眠時間，并縮短睡眠入睡潛伏時間，二者與空白組比較有顯著性差異（P＜0.05），見表1。給予琺菲亞水提物的閾下劑量組能顯著提高小鼠的睡眠發(fā)生率，與空白組比較有顯著性差異（P＜0.05），見表2。結(jié)果表明琺菲亞水提物具有協(xié)同戊巴比妥鈉改善睡眠的作用。

表1 琺菲亞水提物對閾劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠潛伏期、睡眠時間的影響（，n=10）

表1 琺菲亞水提物對閾劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠潛伏期、睡眠時間的影響（，n=10）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對照組

睡眠時間/min琺菲亞水提物組65.12±3.64*38.20±22.06*空白對照組-8.78±1.7220.46±22.67陽性對照組-3.35±0.74**64.65±11.96**組別劑量/g·kg-1睡眠潛伏期/min

表2 琺菲亞水提物對閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠發(fā)生率的影響（，n=10）

表2 琺菲亞水提物對閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠發(fā)生率的影響（，n=10）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對照組

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3.2 琺菲亞水提物改善睡眠作用的量效關(guān)系研究

與空白對照組比較，16，14 g/kg劑量組小鼠睡眠潛伏期顯著縮短，睡眠時間明顯延長（P＜0.01或P＜0.05）；而8 g/kg劑量組小鼠僅睡眠時間延長（P＜0.05）；4，2 g/kg對睡眠潛伏期和睡眠時間無明顯作用。16 g/kg劑量組小鼠的睡眠潛伏期最短，睡眠時間最長，效果最好。見表3。

表3 琺菲亞水提物改善睡眠作用的量效關(guān)系（，n=12）

表3 琺菲亞水提物改善睡眠作用的量效關(guān)系（，n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對照組

睡眠時間/min琺菲亞水提物組25.35±0.6934.09±15.69 44.96±1.3538.24±9.64 84.42±1.1042.56±9.40*124.05±0.76*48.09±8.62*163.70±1.10*56.23±9.62**空白對照組-5.50±1.8332.79±10.14組別劑量/g·kg-1睡眠潛伏期/min

3.3 琺菲亞水提物改善睡眠作用的時效關(guān)系研究

結(jié)果表明，琺菲亞水提物16 g/kg經(jīng)灌胃連續(xù)給藥10 d后開始起效，對小鼠睡眠持續(xù)時間有顯著延長作用，并能縮短入睡的潛伏時間，二者與空白組比較均有顯著性差異（P＜0.05）；隨著給藥時間延長，睡眠潛伏期顯著縮短，睡眠時間顯著延長。見表4。

表4 琺菲亞水提物改善睡眠作用的時效關(guān)系（，n=12）

表4 琺菲亞水提物改善睡眠作用的時效關(guān)系（，n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對照組

組別時間/d睡眠潛伏期/min睡眠時間/min琺菲亞水提物15.71±1.6430.25±10.42 55.25±0.7936.56±11.86 104.62±0.37*42.75±13.91*143.91±0.74*51.51±10.27**213.85±0.84*52.36±9.65**空白對照-5.87±1.5228.59±10.42

3.4 琺菲亞水提物對小鼠腦內(nèi)DA、NE、5-HT、Glu、NO、NOS含量的影響。

與空白對照組比較，給予琺菲亞水提物能導致小鼠腦內(nèi)DA、NE、GLU、5-HT含量明顯減少，NO、NOS含量明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表5～表7。

表5 給藥后小鼠腦內(nèi)海馬中神經(jīng)遞質(zhì)及NOS含量的變化（，n=12）

表5 給藥后小鼠腦內(nèi)海馬中神經(jīng)遞質(zhì)及NOS含量的變化（，n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對照組

組別DA/ng·ml-1NE/ng·ml-15-HT/ng·ml-1Glu/μmol·L-1NO/μmol·L-1NOS/U·mg-1空白組150.23±46.85720.45±63.93295.76±21.10298.03±32.2250.86±22.580.165±0.0024琺菲亞組112.59±47.51600.97±34.00*243.11±15.33**324.41±44.80107.10±31.62*0.171±0.0035

表6 給藥后小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)中神經(jīng)遞質(zhì)及NOS含量的變化（，n=12）

表6 給藥后小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)中神經(jīng)遞質(zhì)及NOS含量的變化（，n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對照組

組別DA/ng·ml-1NE/ng·ml-15-HT/ng·ml-1Glu/μmol·L-1NO/μmol·L-1NOS/U·mg-1空白組144.00±94.62562.87±48.95290.24±29.77373.62±32.4054.71±19.340.157±0.0026琺菲亞組90.01±24.75*499.63±45.12274.58±15.1277.66±23.15**53.43±29.660.167±0.0031*

表7 給藥后小鼠腦內(nèi)下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)及NOS含量的變化（，n=12）

表7 給藥后小鼠腦內(nèi)下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)及NOS含量的變化（，n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對照組

組別DA/ng·ml-1NE/ng·ml-15-HT/ng·ml-1Glu/μmol·L-1NO/ng·ml-1NOS/U·mg-1空白組181.83±75.47707.67±37.07279.86±20.90329.78±38.78308.80±50.080.169±0.0046琺菲亞組166.68±12.30749.80±75.00289.56±17.83250.71±54.28*322.67±35.160.165±0.0067

4 討論

目前，催眠藥的藥理實驗主要是通過觀察測試藥物對巴比妥類藥物或其他催眠藥物誘導的睡眠時間等指標的影響，觀察測試藥物是否能協(xié)同戊巴比妥鈉的作用，使小鼠入睡數(shù)目增加，縮短睡眠潛伏期，延長睡眠時間。以上3項結(jié)果中兩項呈陽性者，即可判定測試藥物具有改善睡眠功能[10-11]。但戊巴比妥鈉經(jīng)過肝藥酶代謝，若對肝藥酶有抑制的藥物，也能延長戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間和縮短其睡眠潛伏期，故能延長戊巴比妥鈉睡眠時間者，還必須看到使接受閾下催眠劑量戊巴比妥鈉的動物進入睡眠，或能使戊巴比妥鈉睡眠醒來的動物重新入睡，以避免單純抑制肝藥酶減少戊巴比妥鈉代謝的藥物明顯影響實驗結(jié)果[10]。本研究結(jié)果表明，琺菲亞水提物能縮短閾劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠潛伏期并延長其睡眠時長，同時提高閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發(fā)生率，結(jié)果表明，琺菲亞水提物具有改善睡眠的功能。

近年研究表明，睡眠是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種主動的神經(jīng)調(diào)節(jié)過程，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)某些特定結(jié)構(gòu)及中樞神經(jīng)遞質(zhì)的作用關(guān)系密切[12]。在促睡眠的物質(zhì)基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，睡眠與 DA、NE 和 5-HT 等在內(nèi)的諸多神經(jīng)遞質(zhì)關(guān)系密切[13]。DA是促覺醒類的神經(jīng)遞質(zhì)，多巴胺能神經(jīng)元在睡眠-覺醒中起到重要的調(diào)節(jié)作用[14]。文獻報道，安神中藥治療失眠及睡眠障礙的機制之一是通過加速5-HT的代謝或提高5-羥色胺受體的含量等[15]；大鼠下丘腦視前區(qū)5-HT含量增加可引起中樞性疲勞，并促進睡眠，而NE主要以興奮中樞和覺醒功能為主，兩者之間存在相互抑制作用[16-17]。內(nèi)源性NO是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與睡眠-覺醒周期的調(diào)控有關(guān)[18]。所以本研究選擇DA、NE、5-HT、NO等作為琺菲亞改善睡眠作用的細胞因子水平研究。

課題組前期研究顯示，琺菲亞改善睡眠作用的有效部位為水提部位。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上對琺菲亞水提物改善睡眠作用的量效、時效關(guān)系進行了研究，結(jié)果表明，琺菲亞水提物改善睡眠作用的最佳給藥量為16 g生藥/kg體重，最佳給藥時間為14 d?，m菲亞改善睡眠作用的機制為減少DA、NE、GLU等中樞性神經(jīng)遞質(zhì)在腦中的分泌、釋放，促進NOS合成、分泌，提高NO在腦內(nèi)的含量，并抑制5-羥色胺能神經(jīng)元，降低5-HT的分泌實現(xiàn)改善睡眠的作用。