HPLC同時測定心可寧膠囊中羥基紅花黃色素A和丹酚酸B的含量

李懷偉，張 朋，馬昌豪

（菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000）

心可寧膠囊為活血散瘀、開竅止痛的中成藥。主要用于治療冠心病，心絞痛，胸悶，心悸，眩暈[1-2]。心可寧膠囊處方由丹參、三七、冰片、水牛角濃縮粉、蟾酥、紅花、牛黃、人參須組成[3]。其中，丹參是心可寧膠囊中的君藥，具有改善心肌缺血，抑制血栓形成，活血化瘀等藥理作用[4]，紅花對心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均具有一定作用[5-6]；兩者均為心可寧膠囊的重要組成部分。紅花和丹參的主要活性成分分別為羥基紅花黃色素A和丹酚酸B，目前關(guān)于心可寧膠囊中羥基紅花黃色素A或丹酚酸B單一成分含量測定的文獻報道較多[7-8]，但同時測定兩種成分含量的方法未見報道。本研究建立了高效液相色譜法（HPLC）同時測定心可寧膠囊中羥基紅花黃色素A和丹酚酸B的含量，可用于該藥品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（美國安捷倫）；XS105 DualRange型十萬分之一天平（Mettler Toledo）；FRQ-1006HT型超聲波清洗器（杭州法蘭特）。

1.2 藥品與試劑

甲醇（色譜純，艾普利公司）；磷酸（色譜純，科密歐公司）；超純水；羥基紅花黃色素A（中國食品藥品檢定研究院，批號：111637-201609）；丹酚酸B（中國食品藥品檢定研究院，批號：111562-201514）；心可寧膠囊（市售，批號：20160301，20160401，20160402）；紅花陰性樣品（自制，批號20170801）；丹參陰性樣品（自制，批號20170802）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A和丹酚酸B各適量，加50%甲醇制成含羥基紅花黃色素A0.0592 mg/ml，丹酚酸B0.4195 mg/ml的混合對照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置入具塞錐形瓶，精密加入50%甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理30 min（功率250 W，頻率40 kHz），取出，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性溶液的制備 按工藝方法分別制備不含紅花、丹參的陰性樣品，按2.1.2項方法制備陰性對照溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax Extend C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.5%磷酸（35:65）；流速1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣體積10 μl；檢測波長為286 nm（丹酚酸B）、403 nm（羥基紅花黃色素A）。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性與系統(tǒng)適用性實驗 取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性溶液，依2.2項下色譜條件進樣分析，考察方法系統(tǒng)適用性，結(jié)果見圖1。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上有相同保留時間的色譜峰，而陰性樣品溶液在此保留時間無相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，表明沒有其他成分干擾。供試品色譜峰中羥基紅花黃色素A和丹酚酸B與相鄰色譜峰分離度均＞1.5，理論塔板數(shù)均不低于5000，方法適用性良好。

圖1 混合對照品溶液、供試品溶液與陰性樣品溶液的HPLC圖譜

2.3.2 線性關(guān)系考察 取混合對照品溶液，按2.2項色譜條件，分別精密吸取2，4，8，10，12，15 μl，注入液相色譜儀，測定色譜峰面積，以對照品的進樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進行線性回歸，結(jié)果線性關(guān)系均良好。羥基紅花黃色素A 回歸方程為Y=3281.8X+5.9204，r=0.9994，線性范圍為0.1184～0.8880 μg；丹酚酸B回歸方程為Y=740.03X+22.439，r=0.9998，線性范圍為0.8390～6.2925 μg。

2.3.3 精密度實驗 取上述混合對照品溶液，按2.2項色譜條件，精密吸取10 μl，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。羥基紅花黃色素A和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.28%和0.53%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性實驗 取同一批供試品（20160402）6份，按2.1.2項方法處理，按2.2項色譜條件測定，記錄色譜圖并計算含量，羥基紅花黃色素A和丹酚酸B的RSD分別為0.78%和0.69%，表明方法有較好的重復(fù)性。

2.3.5 穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h時，按2.2項色譜條件進樣測定，測得供試品中羥基紅花黃色素A和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.28%和0.60%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 回收率實驗 取已知含量的供試品（羥基紅花黃色素A含量0.3548 mg/g，丹酚酸B1.2980 mg/g）6份，每份約2 g，分別加入新配制的對照品溶液（羥基紅花黃色素A 0.3499 mg/mL丹酚酸B 1.3507 mg/ml）2 ml，按2.1.2項方法處理，按2.2項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算兩種組分的回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果（n=6）

2.4 含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按2.1.2項方法處理，按2.2項色譜條件測定，記錄色譜峰峰面積，計算羥基紅花黃色素色素A和丹酚酸B的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

根據(jù)羥基紅花黃色素A和丹酚酸B的性質(zhì)，考察了加熱回流和超聲提取兩種方法的提取效果，并對不同溶劑和提取時間進行了綜合考察，結(jié)果顯示，50%甲醇對兩種成分的提取效果最好，最終選用50%甲醇作為提取溶劑，同時發(fā)現(xiàn)超聲提取與加熱回流提取結(jié)果無顯著差異，最終選用簡單省時的超聲提取方法。在流動相選擇中，參照《中國藥典》2015年版一部[9]考察了甲醇-乙腈-磷酸、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸等多種比例的流動相，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.5%磷酸（35:65）為流動相，供試品和對照品溶液的色譜峰分離效果最好。

同時測定本品中兩味或多味藥材成分含量的文獻鮮有報道，本研究采用DAD檢測器雙波長檢測法，同時測定羥基紅花黃色素A和丹酚酸B的含量，該方法專屬性、穩(wěn)定性較好，準(zhǔn)確度高且方便快捷，可為心可寧膠囊的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。