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(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150001; 2.大連工業(yè)大學(xué)國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧大連116034)

心血管疾病(Cardiovascular Disease,CVD),又稱循環(huán)系統(tǒng)疾病,居全球死亡率首位,預(yù)計(jì)到2030年將會(huì)有超過(guò)2360萬(wàn)人死于心血管疾病[1-2]。血栓類疾病是典型的心血管疾病,具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率及并發(fā)癥多的特點(diǎn)?？鼓委熓穷A(yù)防和治療血栓的主要手段。目前用于治療此類疾病的藥物主要有肝素、華法林及阿加曲班等。但這些藥物都存在一定的副作用,例如引起血小板減少、出血及骨質(zhì)疏松等。目前,一些肽類化合物已被報(bào)道具有顯著的抗凝血活性[3]。同時(shí),食源性生物活性肽憑借其吸收性好[4-5]、副作用小[6]等優(yōu)點(diǎn)日益受到研究者的重視。食源性抗凝血肽主要來(lái)源于乳類蛋白[7]、蛋清蛋白[8]及水產(chǎn)蛋白[9-10]等。

由于人體內(nèi)凝血系統(tǒng)極為復(fù)雜,不同抗凝血肽的抗凝機(jī)制也不盡相同,主要分為抑制凝血酶活性、抑制除凝血酶之外的其他凝血因子活性及抑制血小板聚集活性。目前體外抗凝血活性肽的篩選檢測(cè)方法并不成熟完善,沒(méi)有相對(duì)統(tǒng)一且高效的檢測(cè)方法用于量化評(píng)價(jià)抗凝血物質(zhì)的活性效果,因而阻礙了食源性抗凝血肽的研究步伐。本文將從抗凝血肽的活性機(jī)制及活性檢測(cè)方法方面進(jìn)行綜述,以期為食源性抗凝血活性肽的篩選研究奠定基礎(chǔ)。

1 抗凝血肽的活性作用機(jī)制

1.1 抑制凝血酶

凝血酶(thrombin,EC 3.4.21.5)是一種絲氨酸蛋白酶,也是人體凝血系統(tǒng)中的一種活化的凝血因子(FIIa)[11],在人體內(nèi)凝血系統(tǒng)中起到重要作用。它能夠?qū)⒗w維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白,進(jìn)而纖維蛋白聚集形成血栓;激活部分凝血因子;誘導(dǎo)血小板聚集;主要通過(guò)和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面PAR1受體結(jié)合激活血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此,通過(guò)抑制凝血酶的活性可以起到抑制血栓形成的作用。

如圖1所示,凝血酶共有4個(gè)結(jié)合位點(diǎn),包含2個(gè)外結(jié)合位點(diǎn),1個(gè)Na+結(jié)合位點(diǎn)及1個(gè)活性中心[12-13]。外結(jié)合位點(diǎn)I又稱為纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn),帶有正電荷氨基酸及部分疏水氨基酸,能識(shí)別纖維蛋白原、凝血酶受體等底物帶有負(fù)電荷的區(qū)域。此位點(diǎn)被公認(rèn)為是許多底物甚至抑制劑的主要結(jié)合位點(diǎn)[14]。外結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ,又稱為肝素結(jié)合位點(diǎn),為正電荷氨基酸殘基區(qū),它可以與帶負(fù)電荷的配體如水蛭素、肝素、硫酸軟骨素等相互作用[14-15]。因而,凝血酶可以作為抗凝治療的理想靶點(diǎn),通過(guò)抑制凝血酶的活性可以有效阻礙凝血過(guò)程的發(fā)生,凝血酶抑制劑是調(diào)節(jié)血栓形成過(guò)程的有效工具。

目前,部分肽類化合物已被發(fā)現(xiàn)具有顯著的抗凝血活性,部分活性肽的結(jié)構(gòu)也得到進(jìn)一步鑒定。例如,水蛭素可以在凝血酶的催化位點(diǎn)以及纖維蛋白結(jié)合位點(diǎn)與凝血酶1∶1結(jié)合形成非共價(jià)復(fù)合物[16],阻止凝血酶進(jìn)一步水解纖維蛋白原,從而抑制纖維蛋白聚集。采采蠅凝血酶抑制劑,分子量為3530 Da,除為凝血酶抑制劑之外,也能抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集[17]。此類凝血酶抑制肽盡管抗凝效果良好,但成本較高且較難獲得。目前,一些食源性蛋白水解、發(fā)酵等產(chǎn)物已被證實(shí)具有抗凝血活性,如魚(yú)皮蛋白水解物[18]、豆類蛋白水解物[19]、酪蛋白水解物[7]及貽貝蛋白水解物[20]等。進(jìn)而,從食物源中深入研究開(kāi)發(fā)具有抗凝血功能的肽類具有廣泛的前景。

1.2 抑制除凝血酶外的其他凝血因子

迄今為止,在人體凝血系統(tǒng)中共發(fā)現(xiàn)含纖維蛋白原、凝血酶原、組織因子等在內(nèi)的12種主要凝血因子[21]。它們中絕大多數(shù)為蛋白酶類,經(jīng)活化后在人體凝血止血過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。因此,只要抑制其中某一種因子的活性就可以起到直接或者間接抑制凝血的作用。其中,FXa因其存在于外源性、內(nèi)源性及共同凝血途徑中被廣泛關(guān)注。針對(duì)FXa的抑制劑研究也隨即而來(lái)。如,蜱抗凝血肽(Tick Anticoagulant Peptide,TAP)[22],含60個(gè)氨基酸并以劑量依賴性方式抑制FXa的活性,其抑制常數(shù)Ki為(0.588±0.054) nmol/L。蜈蚣毒液抗凝肽(TNGYT,554.3 Da)也以劑量依賴性方式抑制FXa,其IC50值為41.14 mg/mL,同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它能夠顯著延長(zhǎng)小鼠的凝血時(shí)間和出血時(shí)間[23]。

1.3 抑制血小板聚集

血小板是血液中的一種組成成分,來(lái)源于骨髓巨核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)碎片。其無(wú)細(xì)胞核結(jié)構(gòu),直徑約為2～3 μm[24-25]。血栓形成過(guò)程中一般包含血小板黏附、顆粒釋放、激活及血小板聚集過(guò)程。如圖2所示,血小板表面存在很多受體[26],ADP、凝血酶、U46619、花生四烯酸及膠原等通過(guò)與受體相互作用,進(jìn)一步引起血小板的級(jí)聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)血小板聚集。凝血酶主要通過(guò)與血小板表面PAR1、PAR4受體結(jié)合激活血小板;ADP特異性結(jié)合G蛋白偶聯(lián)膜受體P2Y1、P2Y12,刺激細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)[27];膠原則與GPVI受體結(jié)合;U46619為血管收縮劑血栓素A2的類似物,同血管收縮劑血栓素A2(TXA2)一樣,其與TP-α特異性結(jié)合。在血小板表面也存在一種重要的糖蛋白受體GPIIb/IIIa(整合素αIIbβ3),當(dāng)其配體結(jié)合到整合素αIIbβ3上后,介導(dǎo)血小板黏附聚集并起始一系列胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),這些信號(hào)將引起血小板一系列反應(yīng)[28]。三肽RGD(Arg-Gly-Asp)是典型的GPIIb/IIIa受體拮抗劑,同時(shí)也是細(xì)胞外基質(zhì)和血液中多種粘附蛋白所共有的細(xì)胞粘附識(shí)別位點(diǎn)。血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa復(fù)合物在血小板活化后形成黏附分子受體,其能識(shí)別纖維蛋白原配體上的RGD序列而與纖維蛋白原結(jié)合,是血小板聚集和血栓形成的最后共同通路。利用RGD肽競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷GPIIb/IIIa與纖維蛋白原的結(jié)合,從而抑制血小板的聚集,是防治血栓性疾病的一種有效手段[29]。目前,牛奶蛋白[30]、蜈蚣蛋白[31]及大豆蛋白[32]中均有抑制血小板聚集的活性肽報(bào)道。特別地,大豆蛋白水解物顯示出較好的抑制ADP誘導(dǎo)的抗血小板聚集活性(IC50=2 mg/mL),肽SSGE、DEE均為高度親水性且抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的IC50分別約為480和460 μmol/L[32]。

2 抗凝血肽的活性分析方法研究進(jìn)展

2.1 凝血酶抑制劑活性分析方法

2.1.1 分光光度法 近年來(lái),Yan等[33]建立了一種測(cè)定抑制凝血酶活性的分光光度法。該方法因其成本低、易操作及效率高等優(yōu)點(diǎn)在國(guó)內(nèi)外受到廣泛認(rèn)可。其主要原理是通過(guò)考察抑制物對(duì)凝血酶水解纖維蛋白原的抑制率來(lái)判斷其對(duì)凝血酶的抑制活性。其主要的過(guò)程為:在37 ℃,405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定在加入凝血酶前后,纖維蛋白原與抑制劑的混合液的吸光值變化。Qiao等[20]通過(guò)采用分光光度法測(cè)定貽貝蛋白水解物的抗凝血活性,再利用UPLC-Q-TOF-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)鑒定水解產(chǎn)物中的肽段,并進(jìn)一步結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)模擬凝血酶與水解肽的相互作用,最終從貽貝(Mytilusedulis)中篩選預(yù)測(cè)到一種新型潛在的凝血酶抑制十肽(ELEDSLDSER),其可能是其通過(guò)與凝血酶分子上的氨基酸Lys36-Gln38-Arg67-Arg73-Thr74-Lys81-Ile82-Lys110相互作用,從而抑制凝血酶活性。Feng等[34]同樣結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS/MS、分子對(duì)接及分光光度抗凝血活性測(cè)定法成功從貽貝蛋白中分離、鑒定出一種具有抑制凝血酶活性的13肽(KNAENELGEVTVR),并且此肽在9 mg/mL的濃度時(shí)對(duì)凝血酶的抑制率可達(dá)到89.96%±5.30%。類似地,Tu等[35]通過(guò)結(jié)合序列對(duì)比預(yù)測(cè)、UPLC-Q-TOF-MS/MS、分子對(duì)接及分光光度抗凝血活性測(cè)定法從β-酪蛋白中預(yù)測(cè)出一種抗凝血16肽(FQSEEQQQTEDELQDK),并闡述了其與凝血酶相互作用的可能活性機(jī)制。Rojas-Ronquillo等[7]通過(guò)采用干酪乳桿菌發(fā)酵牛乳蛋白,并采用此方法鑒定出一條同時(shí)兼具抑制凝血酶及ACE活性的17肽(YQEPVLGPVRGPFPIIV)。Ren等[36]運(yùn)用分光光度法測(cè)定蝎子蛋白水解物的抗凝血活性后,再結(jié)合MALDI-TOF/TOF-MS等技術(shù)從蝎子蛋白中篩選出一種具有抗凝血活性的10肽(VEPVTVNPHE)。Yu等[37]從蛋清蛋白中鑒定到一種具有降血壓、抗氧化及抗凝血活性的5肽(RVPSL),分光光度法測(cè)定結(jié)果表明當(dāng)此肽濃度為100 mmol/L時(shí)能夠完全抑制凝血酶活性。雖然此方法具有較多的優(yōu)點(diǎn),但是一些缺點(diǎn)也不容忽視。例如,此方法檢測(cè)靈敏度低、重復(fù)性差、測(cè)量結(jié)果易受時(shí)間影響。

2.1.2 基于凝血酶活性的發(fā)色底物法 凝血酶發(fā)色底物法的主要原理是:凝血酶能夠水解發(fā)色底物(S-2238,HD-Phe-Pip-Arg-pNA)使發(fā)色基團(tuán)硝基苯胺(pNA)被釋放,并在405 nm顯色,其顏色深淺與凝血酶活性成正相關(guān)。因而,通過(guò)分析待測(cè)抑制物對(duì)凝血酶水解產(chǎn)生發(fā)色底物的抑制率來(lái)評(píng)價(jià)其抗凝血活性。Motoyashiki等[38]采用凝血酶發(fā)色底物法驗(yàn)證了水蛭素對(duì)凝血酶較強(qiáng)的抑制效果。Cleary等[39]采用凝血酶發(fā)色底物法證實(shí)了含9個(gè)氨基酸的緩激肽(RPPGFSPFG)能夠直接與凝血酶的活性位點(diǎn)結(jié)合而達(dá)到抑制凝血酶的效果。Francischetti等[40]結(jié)合凝血酶發(fā)色底物法等從動(dòng)力學(xué)角度闡述了anophelin肽(6.5 kDa)的抗α-凝血酶機(jī)制,結(jié)果表明anophelin可逆、緩慢的競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-凝血酶。

2.2 凝血途徑及凝血因子抑制活性分析方法

2.2.1 活化部分凝血活酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間指標(biāo)測(cè)定 活化部分凝血活酶時(shí)間(partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶時(shí)間(thrombin time,TT)及凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)常被用來(lái)分析抗凝血物質(zhì)作用的凝血途徑。Nasri等[41]采用地衣芽孢桿菌NH1蛋白酶水解蝦虎蛋白并結(jié)合APTT和TT方法測(cè)定水解物的活性,同時(shí)采用ESI-MS/MS鑒定出4種抗凝血活性組分肽段(LCR、HCF、CLCR及LCRR)。研究者通過(guò)分析比較已報(bào)道的抗凝活性肽,發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)肽的C端均為精氨酸(Arg,R),其結(jié)果與一些研究報(bào)道的抗凝血肽的結(jié)構(gòu)特性相符,因而推斷當(dāng)肽的C端為精氨酸時(shí)可能有助于其具有抗凝血活性。Indumathi等[42]采用APTT、PT、TT為篩選指標(biāo),從紫菜中篩選鑒定出一種僅能夠延長(zhǎng)APTT時(shí)間的抗凝血14肽(NMEKGSSSVVSSRM),其IC50為0.3 μmol/L。該研究結(jié)果表明,此肽抑制了內(nèi)源性凝血途徑的凝血因子。Kong等[31]從蜈蚣(Scolopendrasubspinipes)蛋白中鑒定出3種能夠延長(zhǎng)APTT的抗凝肽(FSAPAVY、IRDL、DLDHYSF)。Jung等[9]從貽貝(Mytilusedulis)蛋白中鑒定出一種抗凝血22肽(EADIDGDGQVNYEEFVAMMTSK),其能夠延長(zhǎng)TT及APTT。進(jìn)一步研究結(jié)果表明其能與凝血因子FIX、FX及FII相互作用。此外,有研究表明海參蛋白水解物也具有抗凝血活性[43]。

雖然此方法比較成熟、省時(shí)且可信度高,但是此方法不能表明活性肽是具體抑制哪一種凝血因子,只能表明抑制的凝血途徑。且因?yàn)榇朔椒ㄐ栌玫侥治鰞x及特定的分析試劑盒,所以其費(fèi)用昂貴。

2.2.2 基于凝血因子測(cè)定的發(fā)色底物法 同研究凝血酶抑制物的發(fā)色底物法類似,針對(duì)除凝血酶外其他凝血因子的抑制效果測(cè)定只需替換成相應(yīng)的發(fā)色底物。S2765(S2222/S2732)、S2302、S2366、S2288分別是針對(duì)凝血因子FXa、FXIIa、FXIa、FVIIa。通過(guò)此方法,Deng等[44]從線蟲(chóng)中鑒定出一種具有抑制凝血因子FXIa、FVIIa共同作用的多功能活性肽,研究表明其抑制活性較高,對(duì)FXIa及FVIIa的抑制活性IC50值分別為(25.76±1.06) nmol/L及(123.9±1.71) nmol/L。Gan等[45]從十二指腸蟲(chóng)中鑒定出一種能夠同時(shí)抑制凝血因子FXa和FXIa的抗凝血活性肽,抑制動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明其抑制常數(shù)分別為(7.34±1.74) nmol/L 及(42.45±3.25) nmol/L。

2.3 血小板聚集抑制劑篩選方法

1995年,Qian等人[46]研究發(fā)現(xiàn)綿羊κ-酪蛋白的糖肽能夠抑制凝血酶及膠原誘導(dǎo)的血小板聚集,并呈顯著的量效關(guān)系,其IC50分別為215和100 μmol/L。Silva等[47]從大豆蛋白中分離純化出一種具有抑制血小板凝聚和抗凝血的功能蛋白組分。1986年,Jollès等[30]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于κ-酪蛋白106～116的氨基酸殘基片段(MAIPPKKNQDK)具有抑制ADP誘導(dǎo)的血小板凝集以及與纖維蛋白結(jié)合等抗凝血作用。同時(shí),他們研究發(fā)現(xiàn)采用胰蛋白酶將這個(gè)11肽水解為更短的片段(MAIPPKK、NQDK)后,其抗凝血活性減弱。這可能與其發(fā)揮抑制作用的關(guān)鍵性氨基酸有關(guān),文中研究表明Ile108-Lys112-Asn113-Asp115可能為發(fā)揮活性的關(guān)鍵氨基酸。不過(guò),2000年Clare等[48]報(bào)道,來(lái)源于κ-酪蛋白112～116片段(KNQDK)仍具有較好抗凝血功能。

本文總結(jié)了目前常用的體外篩選抗凝血活性肽的方法及已報(bào)道的食源性抗凝血肽,如表1及表2所示。雖然針對(duì)抗凝血物質(zhì)的研究由來(lái)已久,但是目前還沒(méi)有一種十分完美的方法供相關(guān)研究使用。分光光度抗凝血活性篩選法雖然便宜、易操作,但是其靈敏度低、穩(wěn)定差,只適用于如已經(jīng)藥物化的高活性物質(zhì)的活性檢測(cè)。發(fā)色底物法雖然重復(fù)性高,但是其測(cè)定結(jié)果易受實(shí)驗(yàn)人員影響,且大部分凝血因子價(jià)格昂貴。APTT、TT、PT三個(gè)臨床常用的凝血檢測(cè)指標(biāo),具有穩(wěn)定性強(qiáng)、可信度高的優(yōu)點(diǎn),但是,其價(jià)格昂貴,且檢測(cè)過(guò)程中需要血小板,并且檢測(cè)結(jié)果只能表明抑制某一種或多種凝血途徑,而不是具體某個(gè)凝血因子。血小板聚集法需要新鮮血小板或全血(2 h內(nèi))及血小板聚集儀,且成本較高、易發(fā)生溶血,但穩(wěn)定性較好,通過(guò)篩選能夠知道抑制劑針對(duì)的具體血小板聚集途徑。近年來(lái),隨著細(xì)胞表面受體的深入研究,抗凝血抑制劑也開(kāi)始著重于對(duì)細(xì)胞表面受體靶向抑制劑的開(kāi)發(fā)。典型的凝血信號(hào)通路受體RAR1、P2Y12和GPIIb/IIIa等已被報(bào)道。但是,目前食源性的受體蛋白拮抗劑的開(kāi)發(fā)還很罕見(jiàn)。綜上所述,目前的抗凝血活性物質(zhì)的篩選方法有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與完善。

表1 凝血抑制劑檢測(cè)方法比較Table 1 Comparison of anticoagulant inhibitor detection methods

表2 食源性抗凝血肽Table 2 Food-derived anticoagulant peptides

3 前景及展望

血栓類疾病正嚴(yán)重威脅著人類的健康與生命。食源性抗凝血活性肽的分離、鑒定及制備尤為重要。因而,掌握體內(nèi)凝血機(jī)制、開(kāi)發(fā)高效可靠的抗凝血肽篩選方法凸顯出重要意義。目前,各類抗凝血活性物質(zhì)篩選分析方法都存在自身的缺陷并且關(guān)于細(xì)胞表面受體抑制劑的研究較少,并未建立完善的分析體系;抗凝血活性物質(zhì)的功能機(jī)制闡述將是未來(lái)研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題,如結(jié)合蛋白組學(xué)、蛋白翻譯后修飾等技術(shù)闡述抗凝血肽的活性機(jī)制等均值得深入研究;同時(shí),以Caco-2等細(xì)胞模型為載體,闡述抗凝血活性肽的體內(nèi)吸收機(jī)制也將是未來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。

綜上所述,圍繞新型抗凝血活性物質(zhì)的篩選、分析檢測(cè)及多種技術(shù)組合活性機(jī)制闡述方法開(kāi)發(fā)等均具有良好的應(yīng)用前景。相信隨著科技進(jìn)步,未來(lái)能夠建立出一套更高效、靈敏、準(zhǔn)確、成熟的體外抗凝血肽的篩選技術(shù),促進(jìn)食源性抗凝血肽的研究。