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(光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海乳業(yè)生物工程技術研究中心, 乳業(yè)生物技術國家重點實驗室,上海 200436)

人類腸道是一個高度復雜的生態(tài)系統(tǒng),密集定殖了大量的微生物,從而影響著宿主的生理機能、免疫功能以及健康狀態(tài)。在構成人類腸道微生物的大量成員中,存在一部分和宿主共同進化的有益生作用的微生物,其中包括雙歧桿菌[1]。雙歧桿菌作為人類腸道菌群中的重要菌群之一,該菌屬中的特定菌株能夠對人類產生益生作用,因而被認為是益生菌。特定雙歧桿菌菌株具有抗癌作用和抗菌活力,能夠抵制致病菌、降低潰瘍性結腸炎復發(fā)頻率等。盡管雙歧桿菌的功能宣稱已存在推斷性證據,但關于其促進健康作用的分子機制很大程度上仍不明確,其可能的分子機制之一是和菌株產生的胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)有關[2-3]。雖然目前尚未確定識別雙歧桿菌胞外多糖(bifidobacterial exopolysaccharides,B-EPS)的特異性宿主受體,但B-EPS被推測是雙歧桿菌和宿主互作的效應物[4]。

EPS是復雜的碳水化合物,位于細胞的外側,一些雙歧桿菌菌株以及其他的微生物均能產生這類聚合物[5]。在雙歧桿菌菌種/株中,合成B-EPS相關的基因簇具有多樣性[6]。目前報道的B-EPS基本都屬于由兩種或兩種以上不同類型單糖組成的重復單元構成的雜多糖,且不同菌株產生的EPS結構也具有高度差異[7-8]。此外,B-EPS能夠提高雙歧桿菌在腸道中酸/膽鹽耐受力,影響菌株的黏附和定殖、調節(jié)腸道菌群、調節(jié)免疫應答,具有抗氧化活性、抗癌等作用[9-10]。B-EPS對于理解雙歧桿菌與宿主間的共生關系具有十分重要的作用,在功能食品領域具有十分廣泛的應用前景[11-12]。因此,本文總結了B-EPS的來源、組成及結構特點,并重點分析了B-EPS與宿主關系的研究進展,以期為產B-EPS的雙歧桿菌菌株的篩選、構效關系的研究及B-EPS在益生產品和功能食品中的開發(fā)應用提供理論指導。

1 雙歧桿菌胞外多糖的性質

1.1 來源

相比于乳酸菌,產EPS的雙歧桿菌的報道和研究相對較少。目前已確定的產EPS的雙歧桿菌菌種,包括動物雙歧桿菌(Bfididobacteriumanimalis)、短雙歧桿菌(Bfidobacteriumbreve)、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、假鏈狀雙歧桿菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)和鏈狀雙歧桿菌(Bifidobacteriumcatenulatum)等[13-14]。在乳酸菌中,乳酸菌胞外多糖基因簇(LAB-eps clusters)通常擁有編碼和調控、合成重復單元的糖基轉移酶相關蛋白的基因,以及編碼決定EPS鏈長、聚合度和釋放等蛋白的基因。相反地,雙歧桿菌屬基因組中epsclusters沒有表現出類似于乳酸菌中的保守結構,且種間和種內存在較高的差異[11]。雙歧桿菌中合成EPS的基因簇具有菌株特異性,基因在種/株間存在高度差異,可能會影響EPS的結構以及免疫應答等功能[6]。

1.2 分子量和產量

B-EPS的分子量分布范圍較廣,約在10～1000 kDa之間。由于目前雙歧桿菌各個種中菌株的分子量分析數量較少,因此無法準確建立EPS分子量分布和產EPS雙歧桿菌菌種之間的直接聯系。通常一株雙歧桿菌菌株合成的EPS可同時產生大小不同的色譜峰,而分子量大小可能是影響宿主與菌株關系的重要因子[11]。在產量方面,EPS的產量具有菌株依賴性,可以通過改變培養(yǎng)基的組成、pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等因素來優(yōu)化產量。B-EPS產量的報道較少,其產量和乳酸菌EPS產量范圍較為接近[11]。在雙歧桿菌中,B.longum是最常見的產EPS的雙歧桿菌菌種,其產量也相對更高。其中,源自B.longumBCRC14634菌株的B-EPS產量高達4100 mg/L,生長在含葡萄糖培養(yǎng)基中的B.longumsubsp.longum菌株產生的B-EPS產量為616 mg/L,此外生長在含乳糖培養(yǎng)基中的B.longum菌株產生的EPS產量達到466 mg/L[15-16]。

1.3 單糖組成和結構特點

根據EPS的化學組成,可將EPS分為兩種類型:同多糖和雜多糖,分別由同一種單糖組成的重復單元構成和由兩種或兩種以上不同類型單糖組成的重復單元構成。在乳酸菌中,兩種類型EPS均存在。而在雙歧桿菌中,只有合成雜多糖的基因被報道,而催化同多糖合成相關酶的編碼基因尚未檢測到,因此雙歧桿菌合成的B-EPS普遍都屬于雜多糖[17-18]。大部分B-EPS含有葡萄糖和半乳糖,部分含有鼠李糖。在少數雙歧桿菌中,檢測到甘露糖、阿拉伯糖、果糖和半乳糖醛酸等(表1)。B-EPS一般不含有6-脫氧-L-塔羅糖,該糖主要存在于懸鉤子土壤桿菌(Agrobacteriumrubi)等革蘭氏陰性菌株中,目前僅在B.adolescentis菌株和B.longumsubsp.longum菌株中檢測到該糖[19]。

表1 雙歧桿菌胞外多糖的特點Table 1 Characteristics of bifidobacterial exopolysaccharides

B-EPS的單糖比例和菌種尚未發(fā)現顯著的關系,具有菌株特異性。研究推測,相比于食源菌株,人源菌株產生的EPS通常含有較高比例的鼠李糖,例如B.animalissubsp.lactisIPLA-R1菌株產生的HMW-EPS,含有50%的鼠李糖[8]。此外,結合核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)等分析手段,目前僅解析了十多種構成B-EPS的重復單元結構。重復單元主鏈的不同單糖通過不同糖苷鍵連接,包括α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6、β-1,2、β-1,3、β-1,4和β-1,5多種糖苷鍵,連接在主鏈上的側鏈基團也是如此,從而使得不同菌株產生的B-EPS結構具有高度差異性(表2)。之后的研究需深入探究B-EPS具有結構多樣性的原因,及其和菌株的多種生理功能之間的聯系[20]。

表2 雙歧桿菌胞外多糖的結構Table 2 Structure of bifidobacterial exopolysaccharides

2 雙歧桿菌胞外多糖與宿主的關系

2.1 B-EPS對雙歧桿菌的作用

相關研究表明,B-EPS在雙歧桿菌菌株和宿主(人類)間的相互作用關系中起到重要作用。B-EPS可通過影響雙歧桿菌菌株腸道耐受能力和腸道定殖能力,影響菌株在宿主體內功能的發(fā)揮,進而調節(jié)人類健康[32]。

2.1.1 B-EPS對雙歧桿菌腸道耐受能力的影響 宿主口服雙歧桿菌后,菌體經過胃腸道到達結腸受到一系列脅迫作用,包括胃部低pH造成的酸脅迫和十二指腸分泌的膽鹽造成的脅迫[33]。耐酸和耐膽鹽的能力對于菌株的保持和定殖具有非常重要的作用,測定菌株耐膽鹽和耐酸的能力是篩選新型益生菌菌株的標準之一[7]。

研究發(fā)現,在酸、膽鹽等極端環(huán)境下,雙歧桿菌產生的EPS對菌株具有保護作用。Yan等[12]探究了B.longum菌株的EPS產量與人工胃腸液耐受性的關系,研究發(fā)現,三株EPS產量最高的菌株在模擬胃腸液中耐受力最高,而兩株只產生連接在細胞表面的胞外多糖(cell-surface-bound exopolysaccharide,EPS-b)的菌株,在經過模擬胃腸液處理后也具有相對較高的存活率,表明菌株的耐受性和EPS的產量相關,尤其是和EPS-b產量有關。相比分離自嬰兒的菌株,分離自老年志愿者菌株的EPS-b產量更高,這表明雙歧桿菌和宿主發(fā)生共同進化,其對于雙歧桿菌在不利環(huán)境(胃腸道)中的生存具有十分重要的作用。Fanning等[2]監(jiān)測了B.breveUCC2003菌株(EPS+)及EPS-突變株在低pH和膽鹽條件下的生長情況,相比于EPS+對照株,兩株EPS-菌株生長率顯著下降,且終點OD600 nm值更低,表明了EPS層對菌株在低pH和膽鹽條件下具有保護作用。同樣地,Taboun等[33]發(fā)現,B.longumsubsp.longum105-A菌株產生的EPS也能夠保護菌株抵抗宿主環(huán)境的脅迫。

相關報道表明,膽鹽和酸能夠誘導/影響特定菌株B-EPS的產量,從而影響菌株的腸道耐受性[4]。例如,Ruas-Madiedo等[34]首次提出膽汁能夠誘導雙歧桿菌屬中EPS的合成,其研究結果表明,膽汁可以誘導gtf01207基因(EPS合成相關)的表達,顯著促進B.animalissubsp.lactis菌株合成EPS。雙歧桿菌酸耐受能力也會影響B(tài)-EPS的合成,近年來Yang等[35]結合轉錄組學和生理學的方法發(fā)現,相比其親本菌株B.breveBB8,菌株B.breveBB8d的pH酸耐受能力提高和合成細胞壁成分肽聚糖和EPS的基因表達,以及碳水化合物運輸、代謝和能量產生途徑相關。同樣地,菌株B.longumsubsp.longumBBMN68經過酸預處理后,和EPS合成有關的幾種基因的表達出現上調[36]。EPS的產量和膽鹽、pH之間的關系表明,當雙歧桿菌面臨腸道中的嚴苛環(huán)境時,通過合成EPS聚合物作為一種保護自身的機制。

膽鹽除了通過改變菌株產量、影響腸道耐受性以外,還可能影響B(tài)-EPS的組成,進而對菌株的腸道耐受產生影響。Salazar等[24]比較分析了B.longumNB667菌株和相對應的耐膽鹽突變株B.longumIPLA B667dCo產生的EPS物化特性,突變株EPS中葡萄糖和半乳糖的比例更低,相應的EPS殘基→4)-Glcp-(1→和3→)-Galp-(1→的比例更小。相比于原生株,菌株適應膽鹽環(huán)境可能會對B-EPS的組成產生影響,從而影響菌株的腸道耐受性。

綜上,B-EPS對保護菌株抵抗宿主腸道中酸、膽鹽脅迫具有十分重要的作用,同時,腸道環(huán)境也會誘導和影響B(tài)-EPS的產量等性質,進而影響菌株的腸道耐受性。此外,在篩選腸道耐受性較好的益生菌株時,可重點關注EPS-b的產量,并進一步探討EPS-b的結構和作用機理。

2.1.2 B-EPS對雙歧桿菌腸道定殖的影響 影響雙歧桿菌菌株定殖腸道的因素包括膽鹽/酸耐受力、碳水化合物利用能力、黏附素(adhesins)、菌毛(pili)、EPS等[7]。下文將詳細闡述B-EPS對雙歧桿菌腸道定殖的影響。

菌株黏附到腸黏膜的能力是影響菌株定殖宿主腸道的重要因素,和菌株與宿主間的互作能力相關,且菌株能夠黏附到腸粘膜常被認為是篩選益生菌株的標準之一[37]。研究表明,B-EPS可能誘導雙歧桿菌黏附到腸上皮,進而影響菌株的定殖[4]。Lopez等[38]通過體外實驗發(fā)現,產生富含鼠李糖高分子量EPS的B.animalissubsp.lactisIPLA-R1菌株對腸道上皮細胞(Caco-2和HT29)的黏附能力顯著高于原生株,可能有利于菌株在腸道中的短暫定殖。此外,Fanning等[2]的研究結果表明,B.breveUCC2003菌株產生的表面EPS能夠調節(jié)B細胞,對于菌株的長期定殖具有十分重要的作用。大部分B.breve菌株存在于腸腔和上皮表面,B細胞應答被認為是免疫清除這類菌株非常重要的機制。UCC2003菌株(EPS+)表面的EPS結構通過避免補體級聯反應或其他激活的免疫細胞,使得菌株逃避宿主的驅逐。同時,EPS掩蓋菌株表面其他重要的抗原,而在EPS-菌株中,抗原處于暴露狀態(tài),導致被宿主發(fā)現,從而引起更強的免疫應答。綜上,B-EPS可能誘導雙歧桿菌黏附到腸上皮或者通過調節(jié)B細胞,從而對菌株的腸道定殖過程發(fā)揮作用。

雙歧桿菌菌株的黏附和定殖具有菌株特異性,不同B-EPS對菌株的黏附和定殖產生的影響存在差異。例如,Taboun等[33]發(fā)現,B.longumsubsp.longum105-A菌株產生的EPS對菌株結合到Caco-2細胞具有抑制作用,菌株和單層培養(yǎng)Caco-2細胞不發(fā)生結合,而突變株可與Caco-2細胞結合,數值達到7.8±2.3。該結果與Fanning等[2]的研究結果完全相反,其原因可能是由于B.longum105-A菌株的EPS結構完全不同于源自B.breve的EPS,105-A菌株的EPS可能通過覆蓋細胞器或者抑制細胞器的表達(例如能夠促進菌株結合到上皮細胞的菌毛),而成為菌株定殖的屏障。Ruas-Madiedo等[39]研究了LactobacillusrhamnosusGG、B.longumNB667、B.animalisIPLA-R1菌株產生的EPS對益生菌黏附人類腸黏液的影響,結果顯示,高濃度GG-EPS輕微促進了B.animalisIPLA-R1菌株的黏附,而NB667-EPS和IPLA-R1菌株產生的EPS則顯著降低了IPLA-R1菌株的黏附,B-EPS的物化或者結構特性的差異可能對菌體的黏附產生不同作用。因此,建議探究雙歧桿菌菌株產生的B-EPS的結構特點及物化特性,在基本性質研究充分的基礎上,深入挖掘菌株黏附、定殖能力和結構之間的聯系,進而探明菌株發(fā)揮益生作用的具體機制。

2.2 B-EPS調節(jié)宿主腸道菌群

B-EPS具有調節(jié)宿主腸道菌群的作用,可被腸道菌群中的特定種屬作為可發(fā)酵底物(或益生元),從而調節(jié)腸道菌群[8]。將分離自11種分別屬于B.animalis、B.longum和B.pseudocatenulatum菌株(分離自人類腸道)的B-EPS作為碳源,添加在未調節(jié)pH的糞漿中分批培養(yǎng),其結果表明,B-EPS能夠促進培養(yǎng)物中雙歧桿菌水平的適度增長。當和B.longum和B.animalis菌株的B-EPS培養(yǎng)時,大腸桿菌(Escherichiacoli)的數量出現顯著降低[40]。Salazar等[41]通過體外實驗,結合調節(jié)pH的分批培養(yǎng)方式,分析分離自人類腸道的B.longumsubsp.longumIPLA E44和乳源的B.animalissubsp.lactisIPLAR1菌株產生的EPS對腸道菌群的影響,發(fā)現兩種來源的B-EPS均能夠調節(jié)腸道菌群,促進相關微生物菌群數量和代謝上發(fā)生改變。進一步通過體內實驗(Wistar鼠)驗證這兩種菌株的菌群調節(jié)能力,結果表明,相比于IPLA E44和安慰劑組盲腸內容物PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)的實驗結果,IPLA R1菌株能夠顯著增加腸道菌群多樣性[42]。此外,在腸道體系中,B-EPS能夠作為菌群的碳源,通過不同的互養(yǎng)方式利用B-EPS,從而改變短鏈脂肪酸的譜圖,最終影響宿主健康。例如,乙酸和丙酸比例的降低被認為是降血脂的表征因子,研究發(fā)現,B.longumE44和B.longumC52B-EPS的乙酸/丙酸比例值甚至顯著低于菊粉[11]。Rios-Covian等[5]以純化的B-EPS作為唯一碳源,首次發(fā)現脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)可以利用 B-EPS作為發(fā)酵底物,釋放代謝產物短鏈脂肪酸和有機酸。將該結果外推到人類腸道,可以推測出B-EPS和Bacteroides之間的關系可能會影響腸道中短鏈脂肪酸的平衡,最終影響人類的健康。

近年來,大量的研究致力于探究B-EPS對致病菌的抑制/驅逐作用[4]。分離自B.bifidumWBIN03菌株的EPS,促進乳桿菌以及其他厭氧菌的生長,同時抑制腸桿菌、腸球菌以及B.fragilis的生長[10]。源自B.longumBCRC 14643菌株的EPS,濃度為80 μg/mL時,可抑制食物的腐敗變質和致病菌的生長[16]。EPS的益生作用在于EPS干擾致病菌的細胞分裂過程而不是細胞裂解過程。Serafini等[43]發(fā)現,分離自嬰兒糞便的菌株B.bifidumPRL2010能夠黏附到Caco-2和HT-29細胞上,從而防止致病菌E.coli和阪崎腸桿菌(Cronobactersakazakii)的黏附。Fanning等[2]也發(fā)現,B-EPS能夠保護宿主抵制入侵的致病菌,B.breve(EPS+)菌株產生的EPS能夠降低致病菌鼠類檸檬酸桿菌(Citrobacterrodentium)在小鼠腸道中定殖。EPS+菌株相比于EPS-菌株能夠抑制致病菌水平的原因,可能是由于菌株具有形成生物膜的能力,而EPS-菌株由于缺乏EPS可能被宿主識別為外來細菌,從而引起強烈的免疫應答。目前,仍需要通過更多的研究進一步準確詳細地闡明B-EPS抵抗致病菌的機制。

2.3 B-EPS調節(jié)宿主免疫功能

B-EPS作用的準確分子機制尚不明確,但是B-EPS能夠對宿主免疫功能產生顯著影響[6]。不同的雙歧桿菌菌株對免疫系統(tǒng)刺激能力不同,一些菌株表現出促炎活性,而其他菌株表現出潛在的抗炎活力。Fanning等[2]通過小鼠實驗研究發(fā)現,產EPS的B.breveUCC2003菌株,和黏膜中為了防止檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)感染的促炎因子IL12、INF-γ和TNFα水平的升高有關,且相比于不產EPS的菌株,沒有引起強烈的免疫應答。Liu等[44]分析了B.animalisRH菌株產生的EPS在體外對吞噬細胞的免疫刺激活性,數據表明,EPS在體外通過提高巨噬細胞RAW264.7的增殖和吞噬作用的活力,從而發(fā)揮免疫調節(jié)作用。分離自B.animalissubsp.lactisIPLA-R1菌株的富含鼠李糖的高分子量EPS,能夠增加PBMC模型中抗炎細胞因子IL-10的水平,降低人類結腸活檢中TNFα的水平[45]。B.animalisRH菌株產生的一種分子量為23.1 kDa的中性多糖EPSa,通過體外促進免疫細胞增殖,維持小腸中派爾集合淋巴結(Peyer’s patch)的數量、穩(wěn)定血清中促炎細胞因子的水平以及平衡體內Th1/Th2免疫應答,從而提高黏膜免疫。相比于其他大部分的B-EPS,EPSa分子量相對較小,分子量較低可能是其具有免疫刺激活性的重要因素之一[9]。Lopez等[38]發(fā)現,小分子量B-EPS誘導更高水平細胞因子的產生,而高分子量化合物通過釋放更少的細胞因子或者降低TNFα/IL-10比例(作為抗炎指示物),從而降低免疫應答。因此,B-EPS的分子量等物化特性是決定免疫調節(jié)能力的關鍵因素。

目前,某些特定的雙歧桿菌菌株產生的EPS在宿主免疫調節(jié)方面具有十分廣泛的應用前景。B.longumsubsp.longum35624菌株能夠對腸道黏膜免疫細胞產生積極作用,從而保護機體免受炎性疾病。35624菌株引起的抗炎作用和菌株表面的EPS有關,相比于EPS陰性突變株,該菌株能夠防止TH17促炎反應的擴大[46]。35624菌株產生的EPS還能夠調節(jié)小鼠氣道過敏反應,可抑制卵清蛋白致敏小鼠肺部的Th2型免疫應答。TLR-2信號和IL-10的分泌對于抑制嗜酸性粒細胞增多和IL-4/IL-13基因表達具有十分重要的作用。呼吸道炎癥小鼠模型經EPS處理后,EPS通過TLR-2/IL-10路徑,減少小鼠肺部嗜酸性粒細胞的增多[47]。該EPS作為一種新型分子,能夠調節(jié)呼吸道內Th2型炎癥反應,防止TH17促炎反應的擴大,具有較大的應用前景。

綜上,部分雙歧桿菌菌株產生的B-EPS具有調節(jié)宿主免疫的功能,且B-EPS對免疫系統(tǒng)刺激能力具有菌株特異性。研究認為,B-EPS的分子量等物化特性是決定免疫調節(jié)能力的關鍵因素,但其具體作用的準確分子機制尚未完全研究清楚。因此,有待繼續(xù)研究和建立B-EPS物化特性和免疫功能調節(jié)能力的關系。

3 展望

B-EPS和特定雙歧桿菌菌株的多種益生功能密切相關,能夠影響雙歧桿菌的腸道耐受能力和定殖能力,具有調節(jié)宿主腸道菌群和免疫應答的功能,對理解菌株與宿主間的共生關系具有十分重要的作用。B-EPS的結構具有菌株特異性,其化學性質對菌株的功能特性可能具有十分重要的作用,例如聚合物分子量或者電荷等都可能是決定生物功能的關鍵性質。未來的研究需要解析更多的B-EPS結構(例如單糖組成、分子量、重復單元和構象等),建立聚合物的物化特性和其生物功能之間的關系,從而深入探究這些化合物在菌株和宿主關系中的具體作用機制。

此外,B-EPS作為潛在的益生元,在應用于食品工業(yè)和人類營養(yǎng)方面,其產量將是一個非常大的限制因素。而產EPS的雙歧桿菌菌株,能夠將益生元和益生菌結合起來,作為一種“合生元”的形式,在未來功能食品領域中將會是一種具有前景的應用方式,因此還需進一步通過人群干預實驗,深入探究和闡明產B-EPS雙歧桿菌對人類健康的作用機理,使其更好地應用于益生產品和功能食品等領域。