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(1.四川東方主食產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,四川成都 611130; 2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院,四川成都 611130)

傳統(tǒng)PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),polymerase chain reaction)應(yīng)用非常普遍,然而假陽性污染和定量準(zhǔn)確度等問題限制了傳統(tǒng)PCR檢測技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用?，F(xiàn)今社會引起人類、動物中毒、感染和患病的病原微生物依然層出不窮,這要求病原微生物的檢測需更加及時準(zhǔn)確、特異高效。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,在一個反應(yīng)體系中進(jìn)行多個靶位點擴增的多重PCR技術(shù)(Multiplex PCR,MPCR)已廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測[1-5]等方面的研究,取得了較好的成效。

本文對多重PCR技術(shù)原理及其在病原微生物(人類、動物疾病、農(nóng)作物病害、食源性致病菌等)中的最新應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了闡述,提出了存在的問題及解決措施,并對其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望,以期為多重PCR技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 多重PCR技術(shù)原理

多重PCR技術(shù)是基于單一PCR技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)的一種新技術(shù),其較傳統(tǒng)PCR技術(shù)效率更高、產(chǎn)率更高、靈敏度更高、特異性更強、更加經(jīng)濟方便等[6]。它將多條引物和多條模板混合在一個反應(yīng)體系中分別特異擴增不同的目的條帶,或者多條引物和單一的模板DNA混合在同一反應(yīng)體系中擴增同一模板的不同片斷,常用于對超長片斷的擴增。在體外條件下,將雙鏈DNA熱變性成單鏈DNA,以一條單鏈DNA為模板,單鏈DNA靶序列與人工合成的引物結(jié)合,在4種堿基dNTPs底物和DNA聚合酶作用下,引物沿著DNA單鏈從5′末端到3′末端方向延伸,合成新的雙鏈,以其作為模板,又重復(fù)以上聚合酶反應(yīng),合成新的DNA雙鏈,經(jīng)過20～35個循環(huán)特異性擴增出大量拷貝[7]。

2 多重PCR技術(shù)在病源微生物檢測中的應(yīng)用

2.1 人類病原微生物的檢測

如今快節(jié)奏的社會生活要求各種病源微生物的檢測、應(yīng)急處理及臨床診斷更加及時準(zhǔn)確。

陽波等[8]建立的初步篩查和快速檢測389份腹瀉患者中彌散黏附性大腸埃希菌(DAEC)的四重PCR方法的檢測下限可達(dá)32 CFU/反應(yīng)(8.01×103CFU/mL)。在檢測病毒和不典型病原體在兒童下呼吸道感染(LRTI)病原中的分布中,多重PCR技術(shù)與直接免疫熒光法對相同病原檢出一致,但多重PCR技術(shù)病毒的檢出率更高,這更加有助于全面了解兒童LRTI的病原[9]。

此外,陳信良等[10]對醫(yī)院62例呼吸道感染患者的標(biāo)本進(jìn)行多重PCR擴增檢測,檢出陽性29例(陽性率46.8%),其中以流感病毒為主,占病毒陽性檢出48.3%,兩種或兩種以上病毒混合感染5例。這也不僅驗證了該技術(shù)能用于快速檢測呼吸道標(biāo)本,同時也在一定程度上說明可能多重PCR技術(shù)對病毒的檢測敏感度較高,可為急性病毒性呼吸道感染的常規(guī)檢測、應(yīng)急處理及臨床診斷提供快速檢測手段和更多的病原學(xué)依據(jù)。

另外,在兒童血流感染常見病原菌檢測方面,黃君華等[11]建立的多重PCR方法結(jié)果表明,180例血液樣本中血培養(yǎng)法的陽性率為7.8%,而多重PCR方法陽性率為13.9%,明顯高于血培養(yǎng)法,且將病原菌鑒定到種提前3～5 d,這對臨床及時合理用藥具有重要的指導(dǎo)意義。

多重PCR技術(shù)對診斷人類常見病原微生物具有高檢出率和高效性,可嘗試檢測更多的病原體,以加快應(yīng)用該技術(shù),為人類病原微生物的檢測提供更加及時的幫助。

2.2 動物病原微生物的檢測

多重PCR技術(shù)在畜禽病原診斷應(yīng)用方面同樣已有較多的研究,且效果顯著。Zhang等[12]建立的與牛呼吸道疾病綜合癥(BRDC)密切相關(guān)的多殺性巴氏桿菌、溶血性曼海姆氏菌和化膿性真菌3種病菌的多重PCR方法,對3種病菌基因組DNA的檢測限為40 pg/μL,加速實驗室診斷和指導(dǎo)治療BRDC。丁天翊等[13]建立的多重PCR方法具有較好的特異性和敏感性,對牛乳房炎4種主要致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌及白色念珠菌的敏感度分別為102、104、105和102CFU/mL。另外如表1,針對山羊、綿羊、豬、雞致病微生物檢測建立的多重PCR方法,雖與細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果一致,但較傳統(tǒng)方法更加快速、準(zhǔn)確度更高、特異性更強。

表1 動物病原微生物的檢測Table 1 The detection of animal pathogenic microorganisms

2.3 農(nóng)作物病原微生物的檢測

水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌是嚴(yán)重危害水稻抽穗的兩種病菌,可能會影響稻米產(chǎn)量。這兩種菌在形態(tài)性狀和分子遺傳學(xué)等方面都極其相似,常規(guī)檢測方法很難及時有效的對其分離鑒定。岳凱等[18]建立的多重PCR體系對細(xì)菌性條斑病菌和白葉枯病菌的檢測靈敏度分別為104、105CFU/mL,節(jié)省了細(xì)菌DNA提取,可對兩種病菌精準(zhǔn)、快速檢測。同時,李云飛等[19]建立的多重 PCR技術(shù)也實現(xiàn)了對不同國家的水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌進(jìn)行同時準(zhǔn)確檢測。

大豆根腐病是影響大豆減產(chǎn)的重要病害,由多種鐮孢菌引起。不同地區(qū)的致病鐮孢菌群體存在一定差異,而傳統(tǒng)的鐮孢菌鑒定方法費時費力且準(zhǔn)確度差?；诖?有學(xué)者建立了大豆根腐病鐮孢菌的多重PCR檢測方法,結(jié)果表明該法對4種鐮孢菌(尖孢鐮孢菌、腐皮鐮孢菌、禾谷鐮孢菌和木賊鐮孢菌)混合DNA的檢測靈敏度達(dá)0.1 ng/μL,可對1種或多種大豆根腐病鐮孢菌快速、特異檢測,且操作簡便,成本較低[20]。

2.4 食源性致病微生物的檢測

在我國食源性疾病事件中,微生物性食物中毒事件和患者數(shù)最多,分別占40.09%和61.92%[21]。大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、阪崎桿菌等食源性致病微生物是食源性疾病發(fā)生的主要原因之一。

2.4.1 單一致病微生物的檢測 多重PCR技術(shù)已廣泛用于單一病原微生物檢測,且能有效鑒別不同血清型。杜琳等[22]建立了生鮮乳中布魯氏桿菌的多重PCR檢測方法,靈敏度可達(dá)105CFU/mL。Ryu等[23]建立的多重PCR技術(shù)同時檢測肉類食品中6種李斯特氏菌的方法效果十分顯著。李云等[24]、李慧等[25]分別建立的快速檢測13種金黃色葡萄球菌腸毒素(SE)和產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR方法,均可靈敏、特異、快速有效檢測SE的基因和產(chǎn)黃曲霉毒素真菌。陳金龍等[26]建立的大腸桿菌O26、O45、O121 3種血清群的多重PCR檢測方法檢測靈敏度最低可達(dá)10 pg細(xì)菌基因組DNA。在8種血清型腸出血性大腸埃希氏菌高特異、高靈敏度的同步、快速檢測中,多重PCR方法彌補了傳統(tǒng)方法耗時費力、步驟繁瑣等問題[27]。

2.4.2 多種致病微生物的檢測 目前,國內(nèi)外有很多學(xué)者研究利用多重PCR同時檢測乳品、肉品、果蔬中多種致病微生物,所建立的多重PCR檢測高效快速、敏感度高、特異性強、穩(wěn)定性好,為食品質(zhì)量安全的監(jiān)控提供強有力的依據(jù)。

2.4.2.1 乳品致病微生物檢測 在奶牛養(yǎng)殖及乳品生產(chǎn)、銷售等過程中,牛乳的致病菌污染情況不容忽視,因此需采用高效的方法快速檢測和分析致病微生物,特別是在多種致病微生物共同存在的情況下,如何特異、靈敏、準(zhǔn)確的鑒別致病微生物顯得十分重要。Wei等[28]建立了同時檢測培養(yǎng)基和牛奶中的大腸埃希菌O15∶H7、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等食源性病原體的多重PCR方法,其檢測靈敏度為103CFU/mL,檢測限與食品樣品中的單重PCR法一致,但更加高效。苗小草等[29]建立了四重PCR方法,可同時檢出初始菌濃度為1 CFU/mL的4種乳品中檢出率較高的食源性致病菌,對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的靈敏度分別為10-6、10-2ng/μL,對單核細(xì)胞增生李斯特菌、克羅諾桿菌屬的靈敏度均達(dá)10-3ng/μL。另外,用6種致病微生物(金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、大腸埃氏菌、黑曲霉菌等)污染牛奶樣品后,采用多重PCR技術(shù)對此6種致病菌的檢測限可達(dá)1.2 CFU/mL,較Ge XP-PCR技術(shù)提高了至少50～350倍,同時該法檢測成本較生物傳感器和免疫學(xué)方法更低,穩(wěn)定性更好,并可增加同時檢測的菌株數(shù)[30]。因此,在對乳品中多種常見致病菌的檢測上,多重PCR技術(shù)從檢測靈敏度、菌株數(shù)及成本控制上提供了行之有效的解決方法。

2.4.2.2 肉品、果蔬致病微生物檢測 針對低溫肉制品中較易污染的沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌3種有害微生物,也有學(xué)者建立了可同時快速、靈敏、特異、簡便的檢測這3種食源性致病菌的多重PCR方法[31]。在果蔬病原菌檢測方面,多重PCR方法同時檢測鮮切哈密瓜中的單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌O157∶H7時,靈敏度可分別達(dá)到2.7×104、3.8×104、3.3×104CFU/g[32]。

2.4.2.3 與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法比較 有學(xué)者對多重PCR法和傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法檢測致病菌進(jìn)行了對比研究(表2)。吳科明等[33]研究表明多重PCR法檢出率顯著高于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法(p<0.05),這對食源性致病菌的及時判定,預(yù)防食物中毒具有十分重要的現(xiàn)實意義。馮可等[34]建立的多重PCR方法在鮮切果蔬4種致病菌同時檢測時間上較傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法明顯縮短,這對企業(yè)或分析檢驗中心大批量樣品的監(jiān)測具有指導(dǎo)意義。

表2 多重PCR法和傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法檢測對比Table 2 The comparison between multiplex PCR and traditional isolating culture method

2.5 結(jié)合其他方法對病原微生物的檢測

采用多重PCR技術(shù)結(jié)合其他方法來檢測病原微生物已有報道。Feng等[35]采用優(yōu)化的多重PCR系統(tǒng)和疊氮溴化丙錠(PMA)結(jié)合的方法檢測鮮切哈密瓜中的所有活病原體。結(jié)果顯示PMA-mPCR對單核細(xì)胞增生性李斯特菌的靈敏度為2.6×103CFU/g,對大腸桿菌O157∶H7的靈敏度為43 CFU/g,對金黃色葡萄球菌的靈敏度為310 CFU/g。同時用不同濃度的3種病原體接種鮮切哈密瓜在富集培養(yǎng)6 h后,病原體的檢測靈敏度明顯提高到1 CFU/g。這對采用PMA快速處理病原體以有效去除膜不完整細(xì)胞的DNA,進(jìn)而聯(lián)合mPCR方法快速檢測復(fù)雜樣本中的活菌數(shù)量是一個很好的應(yīng)用實例。

此外,多重PCR技術(shù)與SSEL增菌、變性高效液相色譜(DHPLC))等方法聯(lián)合檢測病原微生物的研究也已有報道(表3),其高特異性、靈敏度為多重PCR的聯(lián)合應(yīng)用和高效檢測提供更多途徑。

表3 多重PCR結(jié)合其他方法檢測病原微生物Table 3 The detection of multiplex PCR combined with other methods on pathogenic microorganisms

3 問題與展望

3.1 存在問題及改善措施

多重PCR方法可快速、準(zhǔn)確、靈敏的同時檢測多個目的基因或借助其交叉限制進(jìn)行確認(rèn)。但其同樣存在不足之處,如擴增條件需要探索與協(xié)調(diào)。多對引物同時擴增,可能出現(xiàn)引物間干擾,且各種試驗條件控制不當(dāng),引物的設(shè)計及靶序列的選擇不當(dāng)都可能降低其靈敏度和特異性,很容易導(dǎo)致擴增失敗或非特異性產(chǎn)物。對食品樣品進(jìn)行檢測時,增菌培養(yǎng)基選擇不當(dāng)易使有的細(xì)菌生長緩慢或被抑制,可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果;實際應(yīng)用中有少量外源性DNA污染,可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

在一個PCR反應(yīng)體系中,不同目的片段的擴增是相互競爭的,引物組合、引物濃度、退火溫度等都會影響多重PCR的結(jié)果,而反應(yīng)體積、不同延伸溫度、循環(huán)次數(shù)對其擴增效果影響較小。因此,在應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測前,制定嚴(yán)密周詳?shù)脑囼炘O(shè)計是十分重要的。合理設(shè)計引物,優(yōu)化最佳多重PCR體系及反應(yīng)條件可增加其靈敏度和特異性,減少非特異性擴增、假陰性、假陽性等結(jié)果。

3.2 前景展望

多重PCR技術(shù)對病原微生物的檢測具有適用性、有效性和通用性。隨著科技水平和生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,多重PCR技術(shù)的綜合應(yīng)用已成為一種趨勢,其高特異性、高敏感性和簡便快速為人類、動物病原微生物、農(nóng)作物病害、食源性致病微生物等檢測提供了準(zhǔn)確有效的方法與決策依據(jù),對及時判定和有效控制病原菌傳播、預(yù)防食物中毒等具有十分重要的現(xiàn)實意義。今后,更加簡便、快速、特異的多重PCR檢測技術(shù)將會得到廣泛的應(yīng)用。