潘文秋，喬朋放，侯炳旭，張浩彬，游 銀，郝佳敏，陳曉杰，胡銀崗,3，陳 亮,3

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.河南省科學(xué)院 同位素研究所有限責(zé)任公司/河南省核農(nóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450015；3.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

株高是影響小麥產(chǎn)量的重要因素，矮稈基因的利用，為小麥單產(chǎn)的不斷提升做出巨大貢獻(xiàn)。目前，已推廣的小麥品種中應(yīng)用的矮稈基因主要是Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8，存在矮源單一化問題，加強(qiáng)研究和改良現(xiàn)有矮源，尋找和發(fā)掘新矮源，對(duì)小麥高產(chǎn)育種具有重要意義[1]。20世紀(jì)60年代，小麥矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b的應(yīng)用引發(fā)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的“綠色革命”[2]，揭開小麥、水稻等作物的矮化育種序幕，同時(shí)也為育種家提供新的育種思路。小麥作為中國(guó)主要糧食作物，在其生產(chǎn)中引入矮稈基因，可顯著提高小麥的抗倒伏性和收獲指數(shù)，同時(shí)其耐高肥水能力也有明顯提高，使小麥的產(chǎn)量大幅度增加[3]。目前，已經(jīng)報(bào)道并命名的主效矮稈基因有25 個(gè)[4]，但生產(chǎn)上推廣的主要小麥品種，攜帶Rht-B1b或Rht-D1b基因的至少占70%[5]。楊芳萍等[6]對(duì)來自14 個(gè)國(guó)家的100 份代表性小麥品種的矮稈基因分析表明，Rht-B1b和Rht-D1b基因的分布頻率分別為43.0%和35.0%。許琦等[7]對(duì)中國(guó)冬麥區(qū)210個(gè)小麥品種的矮稈基因分析表明，攜帶Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8基因的品種比例分別為24.3%、19.0%和44.8%。張德強(qiáng)等[8]對(duì)黃淮麥區(qū)20世紀(jì)及近年來新育成的129份小麥品種所含矮稈基因分析表明，含Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8基因的比例分別為28.7%、56.6%和69.0%，僅有4.7%的品種不含有上述3 種基因。孫樹貴等[9]對(duì)美國(guó)的67份小麥品種以及唐娜等[10]對(duì)中國(guó)主麥區(qū)小麥品種的檢測(cè)結(jié)果也表明小麥矮稈基因應(yīng)用較為單一。因此，小麥矮稈基因在生產(chǎn)中的應(yīng)用單一化，使遺傳背景較為狹窄，導(dǎo)致育成品種的遺傳多樣性降低，可能會(huì)成為小麥產(chǎn)量繼續(xù)提升的瓶頸，不利于小麥生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[11]。因此，要提高小麥產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)矮化、抗倒伏育種的新突破，就必須要發(fā)現(xiàn)或創(chuàng)造新的矮源，并進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)已知矮稈基因的研究及利用[12]。本研究以小麥品種‘邯6172’和‘邯6172’矮稈突變體為材料，對(duì)株高、分蘗數(shù)、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量、產(chǎn)量等相關(guān)農(nóng)藝性狀進(jìn)行測(cè)定，以明確‘邯6172’矮稈突變體的矮化效應(yīng)。同時(shí)，對(duì)‘邯6172’和‘邯6172’矮稈突變體進(jìn)行小麥35 K SNP芯片篩查，分析其突變位點(diǎn)及效應(yīng)。以期為‘邯6172’矮稈突變體的育種應(yīng)用及致矮機(jī)制解析提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以小麥品種‘邯6172’和‘邯6172’矮稈突變體(“實(shí)踐八號(hào)”太空搭載選育，由河南省科學(xué)院同位素研究所提供)為試驗(yàn)材料。田間試驗(yàn)在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)節(jié)水農(nóng)業(yè)研究院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。

1.2 赤霉酸(GA3)反應(yīng)

參照唐娜等[13]的測(cè)定方法，‘邯6172’和‘邯6172’矮稈突變體各取 40 粒大小一致的種子，分別播入 2 個(gè)鋪有濾紙直徑 10 cm的培養(yǎng)皿中(各 20 粒)，其中一個(gè)培養(yǎng)皿澆 5 mg/L的外源GA3溶液，另一個(gè)培養(yǎng)皿澆相同數(shù)量的蒸餾水作為對(duì)照。保持濕潤(rùn)，在 24 ℃ 室溫下暗室培養(yǎng)，待第 1 葉完全展開時(shí)，用直尺測(cè)量各品系的胚芽鞘及第 1 葉長(zhǎng)度(精確到 1 mm)，取平均值并進(jìn)行方差分析，以確定‘邯6172’矮稈突變體對(duì)外源GA3的反應(yīng)類型。

1.3 ‘邯6172’矮稈突變體的主要農(nóng)藝性狀鑒定

2016年10月和2017年10月，將小麥品種邯‘6172’和‘邯6172’矮稈突變體的種子按行距 20 cm 、株距 6 cm 播種，生育期間進(jìn)行田間主要農(nóng)藝性狀的觀察與統(tǒng)計(jì)，成熟后按單株收獲，并進(jìn)行差異顯著性分析。根據(jù)小麥生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，在灌漿后期測(cè)量各單株的株高、莖節(jié)長(zhǎng)度、分蘗數(shù)、小穗數(shù)和穗粒數(shù)等主要農(nóng)藝性狀；在收獲后，測(cè)定單株產(chǎn)量、千粒質(zhì)量、生物量和收獲指數(shù)。

1.4 SNP芯片分析

利用小麥 35 K SNP芯片(Axioma Wheat Breeder Genotyping Array)對(duì)‘邯6172’和‘邯6172’矮稈突變體進(jìn)行差異SNP分析，以分析突變頻率及突變位點(diǎn)，并為后續(xù)初步定位矮稈相關(guān)基因或其他優(yōu)異基因提供參考。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘邯6172’矮稈突變體的赤霉酸(GA3)反應(yīng)

用外源GA3分別對(duì)小麥品種‘邯6172’和‘邯6172’矮稈突變體進(jìn)行外源GA3反應(yīng)鑒定。結(jié)果表明(表1)：外源GA3處理后，‘邯6172’及‘邯6172’矮稈突變體的胚芽鞘長(zhǎng)度和第1葉長(zhǎng)度均有增加，但都未達(dá)到顯著水平；不施加外源GA3時(shí)，‘邯6172’矮稈突變體的胚芽鞘長(zhǎng)度較‘邯6172’縮短11.4%，外源GA3處理后，‘邯6172’矮稈突變體的胚芽鞘長(zhǎng)度較‘邯6172’沒有顯著差異；不施加外源GA3時(shí)，‘邯6172’矮稈突變體的第 1 葉長(zhǎng)較‘邯6172’縮短24.0%，外源GA3處理后，第 1 葉長(zhǎng)較‘邯6172’縮短20.0%。雖然‘邯6172’矮稈突變體對(duì)外源GA3敏感性不顯著，但GA3處理不同程度地恢復(fù)‘邯6172’矮稈突變體的野生型表型，與‘邯6172’的差異縮小?！?172’矮稈突變體對(duì)外源GA3敏感性較弱，應(yīng)為GA3遲鈍型矮化類型，其矮化可能不是由內(nèi)源GA3合成代謝缺陷導(dǎo)致的。同時(shí)，在不施加外源GA3時(shí)，‘邯6172’突變體的胚芽鞘長(zhǎng)度和第 1 葉長(zhǎng)度均較‘邯6172’顯著縮短，可能會(huì)影響‘邯6172’突變體的苗期活力。

表1 GA3對(duì)‘邯6172’矮稈突變體及‘邯6172’胚芽鞘及第1葉長(zhǎng)度的效應(yīng)Table 1 Effect of gibberellic acid treatment on length coleoptile and first leaf of wheat lines‘Han 6172’ and ‘Han 6172 mutant’

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Different lowercase letters within columns indicate statistically significant differences(P<0.05).The same below.

2.2 矮化效應(yīng)對(duì)株高及相關(guān)性狀的影響

田間試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：‘邯6172’矮稈突變體的株高較‘邯6172’顯著降低，2 a 試驗(yàn)株高分別降低 12.3 cm(15.3%)和12.5 cm(14.6%)，但矮化效應(yīng)并沒有減少莖節(jié)個(gè)數(shù)，而是通過減少各莖節(jié)的長(zhǎng)度來降低株高(表2)?！?172’矮稈突變體第1莖長(zhǎng)度較‘邯6172’分別降低 2.3 cm(46.0%)和2.1 cm(33.8%)；第 2 莖長(zhǎng)度分別降低 1.8 cm(18.9%)和1.7 cm(17.5%)，第 3 莖長(zhǎng)度分別降低 0.7 cm(4.6%)和1.2 cm(7.8%)，第 4 莖長(zhǎng)度分別降低 4.2 cm(25.6%)和4.2 cm(24.6%)，穗下莖長(zhǎng)度分別降低 3.1 cm(11.8%)和2.5 cm(10.1%)；各莖節(jié)長(zhǎng)度降幅表明植株矮化的主要原因是第 4 莖及穂下莖長(zhǎng)度降低?！?172’矮稈突變體的穗長(zhǎng)、旗葉長(zhǎng)寬和旗葉面積相比于‘邯6172’沒有負(fù)面效應(yīng)。但是，矮稈突變體在降低株高的同時(shí)，推遲抽穗期和開花期，矮稈材料的抽穗期比高稈材料晚3 d，開花期推遲3 d(表3)，在育種應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意生育期變化對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育及最終產(chǎn)量的影響。

表2 ‘邯6172’矮稈突變體和‘邯6172’的株高及相關(guān)性狀Table 2 Plant height and related traits of wheat lines ‘Han 6172’ and ‘Han 6172’ mutant

表3 ‘邯6172’矮稈突變體及‘邯6172’的發(fā)育進(jìn)程Table 3 Heading and flowering growth stages of wheat lines ‘Han 6172’and ‘Han 6172’ mutant

2.3 ‘邯6172’矮稈突變體產(chǎn)量性狀鑒定

研究發(fā)現(xiàn)，與‘邯6172’相比，‘邯6172’矮稈突變體的小穗數(shù)和穗粒數(shù)沒有顯著變化，‘邯6172’矮稈突變體的有效分蘗數(shù)和千粒質(zhì)量顯著降低，有效分蘗數(shù)分別降低 1 個(gè)(14.3%)和 1 個(gè)(11.1%)，千粒質(zhì)量分別降低 3.3 g(6.7%)和 2.1 g(4.5%)，從而使其單株產(chǎn)量顯著降低；由于‘邯6172’矮稈突變體的生物量顯著降低，分別降低 6.8 g(14.7%)和 8.4 g(18.8%)，使其收獲指數(shù)較‘邯6172’顯著增加，分別增加12.2%和12.8%(表4)。

表4 ‘邯6172’矮稈突變體及‘邯6172’產(chǎn)量組成性狀Table 4 Yield composition traits of wheat lines ‘Han 6172’and ‘Han6172’ mutant

2.4 ‘邯6172’和‘邯6172’矮稈突變體的SNP差異分析

通過 35 K 芯片掃描分析，在‘邯6172’與‘邯6172’突變體中共發(fā)現(xiàn) 3 613 個(gè)純合差異SNP，變異豐富，平均 4.1 Mb就有1個(gè)突變。其中2B、2D、5B和6B染色體上的差異SNP最多，4B、4D和7A染色體上的差異SNP最少，另外有 14 個(gè)SNP未定位到已知的染色體(圖1)。

3 討 論

株高對(duì)小麥產(chǎn)量有著重要影響，矮稈基因的發(fā)現(xiàn)和利用引發(fā)第一次綠色革命并大幅度提高小麥產(chǎn)量，然而，目前生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的矮稈基因較為單一，主要是Rht-B1b和Rht-D1b，不利于拓寬遺傳基礎(chǔ)以及產(chǎn)量、品質(zhì)的持續(xù)提升；除此之外，Rht-B1b和Rht-D1b會(huì)縮短胚芽鞘長(zhǎng)度，影響苗期活力，尤其在干旱半干旱地區(qū)會(huì)影響出苗和幼苗群體的建成。因此，發(fā)掘新的矮源，促進(jìn)其合理利用，對(duì)于小麥矮化、抗倒伏育種具有重要的理論和實(shí)踐意義。

圖1 各染色體SNP數(shù)量Fig.1 Number of SNPs per chromosome

本研究利用‘邯6172’和‘邯6172’矮稈突變體為材料，進(jìn)行遺傳特性分析，發(fā)現(xiàn)該矮稈突變體對(duì)外源赤霉酸敏感性較弱，且對(duì)胚芽鞘長(zhǎng)度和苗期第 1 葉有負(fù)面效應(yīng)，可能會(huì)不利于苗期活力和幼苗形態(tài)建成，育種應(yīng)用時(shí)應(yīng)考慮改良該效應(yīng)。同時(shí)，‘邯6172’矮稈突變體的降稈效應(yīng)為15.0%，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗倒伏性，且對(duì)旗葉長(zhǎng)寬和旗葉面積沒有負(fù)面影響。劉秉華等[14]和Ellis等[15]研究表明，Rht-B1b和Rht-D1b的降稈強(qiáng)度約為20%，Rht-B1b+Rht-D1b的降稈強(qiáng)度則較強(qiáng)，可達(dá)48%。Ellis等[16]和Bonnett等[17]報(bào)道，Rht-B1b和Rht-D1b具有顯著降低小麥株高的能力，降稈效應(yīng)約為20%～30%，而Rht8的降稈效應(yīng)僅為10%?？梢姟?172’矮稈突變體的降稈效應(yīng)要比Rht-B1b和Rht-D1b低一些，但是高于Rht8的降稈強(qiáng)度。另外，降稈效應(yīng)較強(qiáng)的矮稈基因還有Rht12、Rht10、Rht5和Rht13，其降稈效應(yīng)分別為45%、69%、55%和34%[18]，但是這些矮稈基因的遺傳效應(yīng)和致矮機(jī)制還不清楚，應(yīng)用價(jià)值尚不明確，在生產(chǎn)上應(yīng)用并不廣泛。Rht13由于通常會(huì)延遲抽穗時(shí)間約1周左右，不利于籽粒的生長(zhǎng)發(fā)育；Rht10也會(huì)大幅度地延遲抽穗時(shí)間，從而對(duì)產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響[11, 19]。本研究中矮稈材料的抽穗期比高稈材料晚3 d，開花期推遲3 d，在一定程度上減少倒春寒的危害，但這種晚熟特性也可能縮短最佳的灌漿時(shí)間，導(dǎo)致矮稈材料千粒質(zhì)量降低。矮稈材料的小穗數(shù)和穗粒數(shù)較高稈材料沒有明顯變化，但由于其有效穗數(shù)和千粒質(zhì)量減小，導(dǎo)致單株產(chǎn)量降低。在生產(chǎn)上，可以通過增加基本苗數(shù)，彌補(bǔ)有效分蘗不足對(duì)穗數(shù)的影響。由于矮稈材料的生物量顯著減少，導(dǎo)致其收獲指數(shù)顯著增加。育種中可通過回交或與其他優(yōu)良品種雜交，進(jìn)一步改良‘邯6172’矮稈突變體的開花期、千粒質(zhì)量等農(nóng)藝性狀，為其育種利用奠定基礎(chǔ)。

小麥 35 K 芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該突變體突變位點(diǎn)較多，株高降低可能是多個(gè)位點(diǎn)突變的綜合效應(yīng)，而非簡(jiǎn)單的單基因突變。也表明太空誘變效應(yīng)較強(qiáng)，可獲得豐富的變異。本研究將構(gòu)建該突變體的定位群體，為挖掘主效株高調(diào)控位點(diǎn)提供材料。