李英梅，楊苗苗，劉 晨，陳志杰，張 鋒，任 平，洪 波

(1. 陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所,西安 710043；2. 陜西學(xué)前師范學(xué)院，生命科學(xué)與食品工程學(xué)院生物工程研究院, 西安 710100；3.陜西省酶工程技術(shù)中心，陜西臨潼 710600)

由番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)引起的番茄黃化曲葉病毒病(Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD)是為害番茄生產(chǎn)的重要病害，被稱之為番茄“SARS”， “植物界癌癥” 。近年來，已成為番茄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的嚴(yán)重威脅因素[1-2]。煙粉虱(Bemisiatataci)作為該病的唯一傳播媒介，通過刺吸式口器對病毒進(jìn)行持久性傳播，且傳毒能力非常強(qiáng)[3]。煙粉虱可從感病植株中快速獲毒，然后在其種群內(nèi)通過水平和垂直傳毒方式保持種群極高的帶毒率[4]。此外，煙粉虱寄主廣泛、適應(yīng)能力和繁殖能力強(qiáng)，一旦入侵，會快速形成龐大的種群，成為TYLCV的有效攜帶者和傳播者[5]。陜西是番茄種植大省，常年種植面積約3.4萬hm2，其中設(shè)施面積約2萬hm2[6]，2009年TYLCD零星發(fā)生，2010年大爆發(fā)以來每年持續(xù)發(fā)生，發(fā)病田病株率一般在30%～40%，重的達(dá)60%～80%，甚至絕收，嚴(yán)重制約番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

在植物病毒病的防控策略中，“殺蟲防病”、切斷病毒傳播途徑是防治“蟲傳病”的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，例如條紋葉枯病、南方水稻黑條矮縮病的防治[7-8]。施用吡蟲啉和丙森鋅防治蚜蟲能有效防治辣椒病毒病，吡蟲啉防治蚜蟲能有效抑制黃瓜花葉病毒，煙草病毒病切實可行的方法亦是“治蟲防病”[9]。在對番茄黃化曲葉病毒病的防治策略中，有效切斷煙粉虱的傳播同樣是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，阿維菌素、菊酯類、新煙堿類、有機(jī)磷類等化學(xué)殺蟲劑對煙粉虱均具有很高的毒殺作用[10-13]。也有研究報道指出，TYLCD發(fā)病初期，采用吡蟲啉、烯啶蟲胺、啶蟲脒乳油、噻嗪酮可濕性粉劑、吡丙醚乳油等藥劑可以降低番茄發(fā)病率[14]；或者苗期噴施鹽酸嗎啉胍、醋酸銅、三唑酮混劑可以避免苗期感病[15-17]。但是，筆者在連續(xù)2 a的田間觀察中發(fā)現(xiàn)，按照常規(guī)藥劑防治措施并不能有效控制TYLCD的發(fā)生，考慮到煙粉虱在化學(xué)防治后短時間就能快速恢復(fù)種群數(shù)量[13]，加之煙粉虱對番茄黃化曲葉病毒超高的帶毒率[18-20]，探索通過單純使用藥劑防治煙粉虱對番茄黃化曲葉病毒病的可行性意義重大。為此，于2012-2014年開展超常規(guī)化學(xué)防治條件下，利用殺蟲劑滅殺煙粉虱防控TYLCD的試驗研究，以期為該病的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在陜西省科學(xué)院渭南科技示范基地進(jìn)行，基地位于渭南市大荔縣馮村鎮(zhèn)，北緯34°56′，東經(jīng)109°43′，無霜期199～255 d，年均氣溫12～14 ℃，年雨量600 mm左右，年日照2 200～2 500 h。試驗在2個塑料大棚進(jìn)行(長度90 m，跨度12 m，高度5 m)，1號塑料大棚煙粉虱密度較低(三葉蟲口10頭左右/株)，2號塑料大棚煙粉虱密度較高(三葉蟲口50頭左右/株)。后者僅進(jìn)行不同處理煙粉虱蟲口及番茄黃化曲葉病毒病發(fā)病率、發(fā)病程度調(diào)查。

1.2 材 料

1.2.1 藥劑 4.5%高效氯氰菊酯乳油1 000倍液、5%吡蟲啉乳油1 500倍液、1.8%阿維菌素1 000 倍液。

1.2.2 番茄品種 選擇感病品種‘圣帝’ ，在50目防蟲網(wǎng)室內(nèi)50孔育苗盤育苗，確保種苗無病毒感染。栽植密度1 800株/666.7m2，以不用殺蟲劑作為空白對照，同期定植抗病品種‘金鵬8號’作為生物對照。

1.3 試驗設(shè)計

1號塑料大棚4月15日定植，2號塑料大棚5月15日定植，定植后除試驗用藥外，未設(shè)置防蟲網(wǎng)，也不采取其他煙粉虱防治措施。2個試驗大棚均在定植1周番茄緩苗后開始噴施藥劑，每種藥劑分別間隔3 d、6 d噴施1次，以噴施清水為對照，當(dāng)對照發(fā)病率達(dá)到100%時，停止噴藥。試驗小區(qū)面積54 m2(6 m×9 m)，3次重復(fù)。

1.4 調(diào)查方法及時間

1.4.1 蟲口數(shù)量 每次噴藥前及噴藥后24 h、72 h，每處理小區(qū)5點取樣法選取5個樣點，每樣點依次選取10株番茄，每株選取上、中、下各1片葉，統(tǒng)計成蟲數(shù)量。計算蟲口減退率。

蟲口減退率=(處理前蟲口數(shù)-處理后蟲口數(shù))/處理前蟲口數(shù)×100%

1.4.2 發(fā)病調(diào)查及病毒病檢測方法 自番茄定植緩苗后，每小區(qū)5點取樣法選取5個樣點，每樣點依次選取10株，每隔7 d調(diào)查1次，分別記錄植株發(fā)病數(shù)、發(fā)病等級、計算發(fā)病率、病情指數(shù)。

病毒病分級參照周一萬等[21]的分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。0級:無癥狀；1級：明脈，輕度矮化，株高為健株株高的4/5左右，結(jié)果期有3穗以上的果實；3級：心葉及中部葉片花葉，株高為健株株高的2/3，結(jié)果期有2穗果；5級：心葉及中部葉片花葉，少數(shù)葉片畸形，皺縮或植株輕度矮化；7級：重花葉，多數(shù)葉片畸形、皺縮，植株明顯矮化，一般為健株株高的1/2左右，頂部典型黃化曲葉，結(jié)果期下部有1穗果；9級：重花葉，葉片明顯畸形，線葉，植株嚴(yán)重矮化，株高低于健株1/3。

發(fā)病率=發(fā)病數(shù)/調(diào)查總數(shù)×100%

病情指數(shù)=∑(各級發(fā)病數(shù)×極值)/(調(diào)查總數(shù)×最高極值)×100

1.4.3 番茄帶毒率檢測 采樣方法：采用5點采樣法采樣；從第1次噴藥后每隔6 d采集番茄頂部三葉1次，共采7次。番茄植株帶毒率檢測：采用CTAB法提取番茄植株DNA[22]；參考李常保等[23]設(shè)計的引物(表1)進(jìn)行檢測。

表1 番茄黃化曲葉病毒PCR檢測特異引物Table 1 Primers used in PCR for tomato yellow leaf curl virus

1.4.4 不同藥劑處理后番茄果實生物量計算 每處理隨機(jī)選取4個點，每點固定5株，記載單株番茄果實總質(zhì)量，待試驗結(jié)束后，將單株所有果實和完整單株番茄分別置于105 ℃烘箱殺青30～40 min，然后分別在65 ℃下烘干至恒質(zhì)量時稱量，得到樣本生物量；最終以15株完整番茄植株和果實生物量平均值代表不同處理的生物量。

1.4.5 藥劑防治后番茄帶毒率的動態(tài)變化 該研究采用熒光定量PCR檢測法進(jìn)行。

采樣和植株DNA提?。喊凑?點采樣法分別采集第1次噴藥后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d后的番茄植株頂部三葉；采用CTAB法提取番茄植株DNA[22]。

TYLC Real-time PCR檢測：參照朱云聰?shù)萚24]方法進(jìn)行。樣品首先進(jìn)行常規(guī)PCR檢測，檢測呈陽性的DNA用Nanodrop分光光度計測定質(zhì)量濃度，10倍梯度稀釋，用稀釋后的DNA為模板；以朱云聰?shù)萚24]設(shè)計的定量引物和內(nèi)參引物進(jìn)行Real-time PCR檢測，每個樣品重復(fù)3次(引物見表2)；以DNA質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增效率=(E-1)×100%，E=10-1/slop，(slop為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)；Real-time PCR擴(kuò)增。用Real-time PCR法研究TYLCV在植株體內(nèi)的動態(tài)變化，2種處理的樣品均在第1次噴藥后第7天進(jìn)行第1次取樣，每隔7 d取樣1次，直至第42天，每個處理隨機(jī)選5點，每點固定5株，每株采集番茄頂葉1～2片葉，葉片混合后稱質(zhì)量0.1 g，提取葉片總DNA。定量葉片DNA質(zhì)量濃度在1.0～10 ng/μL，采用朱云聰?shù)萚24]方法定量植株體內(nèi)病毒DNA的相對量，設(shè)噴施清水的為對照，病毒DNA相對量用△△Ct法計算，相對量=2-△△Ct，3次重復(fù)。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理 用單因素方差分析(ANOVA)法對不同處理之間的生物量進(jìn)行差異顯著性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑處理后煙粉虱種群動態(tài)變化

研究結(jié)果表明(表3)，在煙粉虱低密度情況下，對其采用3 d/次和6 d/次不間斷高強(qiáng)度施藥后煙粉虱數(shù)量會快速下降，藥后24 h，4.5%高效氯氰菊酯乳油1 000倍液效果最明顯，3 d/次和6 d/次的蟲口減退率分別為90.2%和89.3%，吡蟲啉1 500倍夜在藥后24 h 3 d/次和6 d/次的蟲口減退率分別為84.8%和83.0%，阿維菌素1 000倍夜在藥后24 h的蟲口減退率達(dá)到83.9%。但在藥后72 h，高效氯氰菊酯、吡蟲啉、阿維菌素3種藥劑3 d施藥處理后的蟲口減退率分別降低至12.5%、22.8%、23.5%；6 d施藥1次的處理蟲口減退率分別為21.3%、26.4%、22.1%，說明煙粉虱種群迅速恢復(fù)。在煙粉虱高密度情況下，表現(xiàn)出類似規(guī)律。但單株煙粉虱絕對殘留蟲口數(shù)量顯著高于低密度煙粉虱試驗棚。6 d施藥1次的番茄植株在第7次施藥后，由于煙粉虱與病毒病的雙重為害，已瀕于死亡，因此無有效調(diào)查數(shù)據(jù)。說明對煙粉虱僅采取化學(xué)防治，沒有其他防治措施相結(jié)合，不論其種群高或者低，短期防治效果較好，但持效性很低，且因煙粉虱十分活躍，種群龐大，繁殖快，加之棚室內(nèi)番茄種植密度大等原因使得煙粉虱種群數(shù)量恢復(fù)迅速。

2.2 不同處理番茄帶毒率、發(fā)病率及病情指數(shù)

表4顯示，在煙粉虱低密度條件下，試驗第6天，番茄帶毒率達(dá)到100%，第18天后番茄出現(xiàn)癥狀，隨后發(fā)病程度不斷加重。至第36天，所有處理番茄發(fā)病率均達(dá)到100%；病情指數(shù)66.1～70.3，番茄帶毒率、發(fā)病率、病情指數(shù)與對照無明顯差異。在煙粉虱高密度條件下，表現(xiàn)出與低密度類似的規(guī)律性，且癥狀表現(xiàn)時間較煙粉虱低密度提前6～8 d，第24天前高密度區(qū)發(fā)病率略高于低密度區(qū)，第30天后，二者無顯著差異。結(jié)果表明噴施化學(xué)藥劑對降低番茄帶毒率、發(fā)病率、病情指數(shù)均無明顯效果。

2.3 不同藥劑處理后番茄生物量變化

試驗結(jié)果表明(表5)，3種不同施藥時間處理后，番茄果實和全株生物總量與空白對照組的果實及全株生物量之間差異不顯著，并且由于被煙粉虱為害及番茄黃化曲葉病毒的侵染，植株矮小、結(jié)果量少，6 d施藥1次的處理組在第7次噴藥后大部分瀕于死亡，抗病品種‘金鵬8號’的果實生物量與全株生物量均顯著高于對照組及防治組。結(jié)合表3結(jié)果進(jìn)行分析，即殺蟲劑可有效降低煙粉虱種群數(shù)量，但對番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生無明顯抑制效果，對番茄的產(chǎn)量及生物量也無有效提高作用。

表4 不同藥劑不同施藥方法后番茄植株帶毒率、發(fā)病率及病情指數(shù)Table 4 Plant toxicity, morbidity and disease index by applying pesticide on different application methods

注：符號“*”代表番茄帶毒率100%、發(fā)病率100%。

Note:* 100% poisoning rate and 100% incidence rate of tomato.

表5 不同藥劑不同施藥方法后植株生物量變化Table 5 Variation of plant biomass by applying pesticide on different application methods

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.05).

2.4 不同處理番茄帶毒率的動態(tài)變化

圖1顯示，6個處理和空白對照組番茄葉片的帶毒率動態(tài)變化呈現(xiàn)出相同的規(guī)律性，0～21 d不斷增長，21～27 d緩慢下降，27～35 d再次呈現(xiàn)增長趨勢，第35天達(dá)到最高值后開始下降，其原因主要植物體內(nèi)不斷積累起來的針對“外源”的核酸抗體引起的[25]。3種化學(xué)藥劑不同施藥時間和對照之間處理后番茄TYLCV變化無顯著差異，病毒增殖動態(tài)趨于一致。也就是說，當(dāng)植物通過帶毒煙粉虱將TYLCV接種到植株體內(nèi)后，藥劑無法抑制病毒在植株體內(nèi)的增殖。

A1.高效氯氰菊酯1 000倍液3 d施1次 1 000 times liquid of Cypermethrin 3 days at a time；A2.高效氯氰菊酯1 000倍液6 d 施1次 1 000 times liquid of Cypermethrin 6 days at a time；B1.吡蟲啉1 500倍液3 d施1次 Imidacloprid 1 500 times liquid 3 days at a time；B2.吡蟲啉1 500倍液6 d施1次 Imidacloprid 1 500 times liquid 6 days at a time；C1.阿維菌素1 000倍液3 d 施1次 Avermectin 1 000 times liquid 3 days at a time；C2.阿維菌素1 000倍液6 d施1次 Avermectin 1 000 times liquid 6 days at a time;CK.對照 Control

圖1不同藥劑處理后番茄植株病毒的熒光定量PCR檢測結(jié)果
Fig.1FluorescencequantitativePCRdetectionresultsofTYLCVafterdifferenttreatments

3 討 論

本研究采用超常規(guī)高強(qiáng)度的施藥手段，旨在評價藥劑防治傳播媒介煙粉虱對番茄黃化曲葉病毒病的控制效果與可行性，從而為該病的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。研究結(jié)果表明，在無其他煙粉虱防治措施的條件下，使用45%高效氯氰菊酯乳油1 000倍液、5%吡蟲啉乳油1 500倍液和1.8%阿維菌素1 000倍液3種殺蟲劑，采用間隔3 d、6 d 不間斷施藥防治，在短期內(nèi)對煙粉虱有較好的滅殺效果，但72 h后的種群數(shù)量恢復(fù)速度很快，并且對番茄TYLCD的發(fā)病率、病情指數(shù)、病毒在植株體內(nèi)的擴(kuò)繁均無降低或抑制作用，番茄生物量以及植株體內(nèi)病毒的含量與空白對照無顯著差異。

煙粉虱介體傳播是TYLCD流行的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，切斷病毒的介體傳播是控制該病的有效途徑。本研究結(jié)果表明在番茄棚內(nèi)一旦發(fā)現(xiàn)帶毒煙粉虱，不論采用內(nèi)吸性殺蟲劑還是觸殺性殺蟲劑進(jìn)行煙粉虱的防治，無法實現(xiàn)TYLCD的有效防治，本研究結(jié)果與龔愛君[15]、宋建軍等[16]、周濤等[17]、王富等[18]、孫作文等[26]的研究結(jié)果不完全相同。綜合分析通過藥劑防治煙粉虱對TYLCD無法有效防控的主要原因有以下幾點：

煙粉虱繁殖能力和環(huán)境適應(yīng)能力極強(qiáng)，施藥時，一部分煙粉虱受到侵?jǐn)_后會遷飛到附近寄主上，在藥后72 h回遷及殘留蟲口共同導(dǎo)致種群快速恢復(fù)到施藥前的水平，在中國種植單元小、種植區(qū)分散的實際情況下，對煙粉虱的大范圍防控異常困難[27]。

煙粉虱帶毒率非常高，5-6月帶毒率高達(dá)100%[19]，即使在氣溫較低的10月份種群帶毒率最低也在40%以上。且煙粉虱能通過水平(交配)和垂直(產(chǎn)卵)方式快速、持久性在種群內(nèi)傳播病毒，一旦少數(shù)帶毒，短期內(nèi)種群帶毒率會大幅度增長[3-4]。

獲毒和傳毒速度快，煙粉虱在帶毒植株上獲毒5～10 min 就可在其體內(nèi)檢測到番茄黃化曲葉病毒 DNA的存在；獲毒后潛伏期僅8 h，傳毒5 min 后即可在傳毒位點處檢測到番茄黃化曲葉病毒DNA 的存在[28]。煙粉虱在刺吸感病番茄1 h 后，中腸內(nèi)便可檢測到番茄黃化曲葉病毒，8 h后就能將病毒傳給健康植株[4]。一旦種群中有一定數(shù)量的煙粉虱帶毒或番茄帶毒，煙粉虱在被滅殺之前已經(jīng)成功獲毒和傳毒。

藥劑發(fā)揮作用需要一定時間，從化學(xué)藥劑對煙粉虱的有效殺滅時間看，至少需要30 min以上，這些化學(xué)藥劑大多為觸殺型和內(nèi)吸型，由于煙粉虱十分活躍，觸殺型藥劑接觸蟲體幾率大大降低；而內(nèi)吸型殺蟲劑在防治煙粉虱的同時也為病毒傳播提供了途徑。

煙粉虱傳毒效能高，單頭帶毒成蟲即可實現(xiàn)病毒的傳播，引起 18.5%的植株染病；當(dāng)蟲口密度增加到每株 10頭時，番茄染病率升至100%[29]。本研究中，在3 d 施1次的高強(qiáng)度頻率時，單株番茄煙粉虱蟲口密度常在5頭左右。

4 結(jié) 論

結(jié)合前人眾多研究成果和本研究結(jié)果分析后認(rèn)為，在使用殺蟲劑防治傳播介體煙粉虱對控制TYLCD無效情況下，應(yīng)結(jié)合農(nóng)藝措施進(jìn)行綜合防控：首先應(yīng)選擇栽培抗病品種，尤其是在大田栽培區(qū)域；其次在育苗和定植時，錯開煙粉虱高發(fā)期以避免番茄黃化曲葉病毒的侵染；最后在設(shè)施內(nèi)栽植時，通風(fēng)口和出入口均設(shè)置50目防蟲網(wǎng)，可以有效防控?zé)煼凼膫魅?，同時應(yīng)在棚室內(nèi)懸掛黃板，對少量傳入的煙粉虱進(jìn)行誘殺，降低煙粉虱的蟲口密度，減輕病毒病的發(fā)生。