宋德勝 錢晶 陳志鈞

作者單位：210029 江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院眼科

弱視為視覺發(fā)育相關(guān)性疾病，是視覺發(fā)育期由于單眼斜視、屈光參差、形覺剝奪或雙眼高度屈光不正等異常視覺經(jīng)驗(yàn)，造成單眼或雙眼最佳矯正視力低于正常，或雙眼視力相差2行以上，臨床檢查無可見的器質(zhì)性病變，經(jīng)恰當(dāng)治療后視力可以提高或完全恢復(fù)[1]。形覺剝奪為弱視的成因之一，多見于先天性白內(nèi)障、角膜混濁、完全性上瞼下垂、醫(yī)源性眼瞼縫合或遮蓋等情況。由于形覺刺激不足，剝奪了黃斑形成清晰物像的機(jī)會(huì)而形成弱視[1]，而且視覺發(fā)育關(guān)鍵期單側(cè)的形覺剝奪會(huì)導(dǎo)致視覺環(huán)路眾多位置發(fā)生可塑性變化。視覺可塑性也已成為大腦可塑性的重要組成部分，視覺可塑性的研究不僅能為弱視的治療提供光明的前景，更能豐富大腦神經(jīng)可塑性的內(nèi)容。目前關(guān)于視覺可塑性的研究包括長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑制(long-term depression，LTD)，穩(wěn)態(tài)突觸縮放(homeostasis synaptic scaling)，脈沖時(shí)間依賴的突觸可塑性(spike timing dependent plasticity，STDP)[2-5]，且發(fā)生機(jī)制均與N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methy-D-aspartate，NMDA)的生化代謝相關(guān)，NMDA受體是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的3種離子型受體之一。NMDA受體在視覺轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)及突觸可塑性變化中發(fā)揮重要作用，并與視覺發(fā)育有密切的關(guān)系，它在弱視形成中的作用及其作用機(jī)制一直是眼科醫(yī)生及視覺科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。NMDA受體第二亞單位 (NMDA-NR2)是NMDA受體復(fù)合物的調(diào)節(jié)亞單位，通過多種方式調(diào)節(jié)受體復(fù)合物的功能活性，不同NR2的參與可賦予通道復(fù)合物不同的電生理學(xué)和藥理學(xué)特性[6]。而NR2中NR2A亞基與NR2B亞基又因其本身的功能特性及其與突觸可塑性與再可塑性的密切關(guān)系成為目前神經(jīng)科學(xué)研究的一大熱點(diǎn)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)NR2A亞基與NR2B亞基發(fā)育性表達(dá)與視覺發(fā)育關(guān)鍵期的開啟與結(jié)束有關(guān)[7-9]，并且外界視覺經(jīng)驗(yàn)對(duì)兩種亞基的轉(zhuǎn)換至關(guān)重要，出生后早期，NR2B亞基占優(yōu)勢(shì)，發(fā)育過程中，逐漸被NR2A亞基取代[10]。Guo等[11]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，暗飼養(yǎng)能延長(zhǎng)兩種亞基轉(zhuǎn)換的時(shí)間，使功能性NR2B亞基型NMDA受體在突觸部位增加，其為暗飼養(yǎng)小鼠STDP整合時(shí)間窗拓寬(可塑性增強(qiáng))的內(nèi)在機(jī)制，并且研究發(fā)現(xiàn)NR2B亞基特異性受體阻斷劑艾芬地爾能使暗飼養(yǎng)對(duì)小鼠視皮層NR2B亞基/NR2A亞基相互轉(zhuǎn)換時(shí)間造成的影響恢復(fù)正常。

單眼形覺剝奪可導(dǎo)致弱視，對(duì)視覺可塑性的影響較暗飼養(yǎng)更為嚴(yán)重，而關(guān)于單眼形覺剝奪后視皮層NR2A亞基和NR2B亞基表達(dá)及NR2B亞基阻斷劑對(duì)其表達(dá)影響的研究未檢索到相關(guān)文獻(xiàn)，這就限制了此種形式可塑性研究的發(fā)展。本研究以單眼形覺剝奪小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，從蛋白和mRNA兩個(gè)途徑觀察雙側(cè)視皮層NR2A亞基和NR2B亞基的表達(dá)并探索NR2B亞基受體阻斷劑艾芬地爾對(duì)兩種亞基表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料出生后3～4周C57BL/6J小鼠(野生型)15只，雌雄不限，無特定病原體動(dòng)物，12 h12 h晝夜循環(huán)飼養(yǎng)(光亮?xí)r間在0700至1900)。飼養(yǎng)溫度為23 ℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將健康小鼠隨機(jī)分3組，每組5只，分組均以出生后24 d為基準(zhǔn)：正常對(duì)照組、單眼形覺剝奪組和聯(lián)合組。單眼形覺剝奪組和聯(lián)合組右眼褥式縫合6 d，建立單眼形覺剝奪模型。

1.2.2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽鋯窝坌斡X剝奪模型制備：?jiǎn)窝坌斡X剝奪組和聯(lián)合組小鼠均選擇右眼進(jìn)行干預(yù)，于出生后24 d，實(shí)驗(yàn)小鼠稱質(zhì)量后，七氟烷麻醉，剪除右眼瞼緣周圍毛發(fā)，碘伏消毒上下眼瞼局部皮膚，距上下瞼緣各1.0 mm處，剪去皮膚和瞼板組織，用6-0絲線間斷縫合實(shí)驗(yàn)眼3～4針。術(shù)后每天涂抗生素眼膏及檢查創(chuàng)口情況，避免感染造成的縫線脫落。這兩組小鼠均共同在自然光線環(huán)境下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至生后30 d。聯(lián)合組小鼠稱質(zhì)量后，于造模后第1、3、5天腹腔注射艾芬地爾，給藥劑量為10 mg·kg-1。

1.2.3qRT-PCR法檢測(cè)視皮層NR2A亞基和NR2B亞基mRNA的表達(dá)NR2A上游引物：5’-ACGTGACAGAACGCGAACTT-3’，下游引物：5’-TCAGTGCGGTTCATCAATAACG-3’；NR2B上游引物：5’-GCCATGAACGAGACTGACCC-3’，下游引物：5’-GCTTCCTGGTCCGTGTCATC-3’；GAPDH上游引物：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物：5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’；引物序列來自PrimerBank，由北京賽百盛基因技術(shù)公司合成。采用Trizol法提取組織mRNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度并計(jì)算RNA濃度，參照SYBR Green試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性15 s；95 ℃變性 15 s，57 ℃退火30 s，74 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCT法計(jì)算NR2A mRNA和NR2B mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4Westernblot法檢測(cè)視皮層NR2A亞基和NR2B亞基蛋白的表達(dá)采用細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒提取帶有NR2A亞基和NR2B亞基的膜蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，取新管做好標(biāo)記，加入適量膜蛋白，相對(duì)應(yīng)蛋白中加入對(duì)應(yīng)的5倍上樣緩沖液，渦旋振蕩后短暫離心。用96 ℃金屬浴加熱10 min后迅速離心，快速置于冰上，-20 ℃保存待用。聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜；5 g·L-1脫脂奶粉中封閉1 h，分別加入相應(yīng)一抗，搖床4 ℃孵育過夜；TBST緩沖溶液漂洗5次，每次10 min，加入緩沖溶液稀釋的二抗室溫下?lián)u床緩慢孵育1 h，TBST緩沖溶液漂洗5次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，X線顯影。使用Image Pro-Plus軟件測(cè)量各蛋白條帶的吸光度(absorbance，A)值。目的蛋白的相對(duì)灰度=A目的蛋白/A相應(yīng)內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果

2.1.1各組內(nèi)左右側(cè)視皮層NR2AmRNA、NR2BmRNA相對(duì)表達(dá)量比較正常對(duì)照組左右側(cè)視皮層NR2A mRNA、NR2B mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.454、0.484)。單眼形覺剝奪組與聯(lián)合組左側(cè)視皮層，即剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層，NR2A mRNA相對(duì)表達(dá)量較右側(cè)視皮層減少(均為P=0.000)；單眼形覺剝奪組左側(cè)視皮層NR2B mRNA表達(dá)較右側(cè)視皮層增多(P=0.000)，聯(lián)合組左右側(cè)視皮層NR2B mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.431；見表1和表2)。

2.1.2各組間左側(cè)視皮層NR2AmRNA、NR2BmRNA相對(duì)表達(dá)量比較與正常對(duì)照組相比，單眼形覺剝奪組左側(cè)視皮層NR2A mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯減少(F=117.332，P=0.000)，NR2B mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加(F=55.506，P=0.000)；與單眼形覺剝奪組相比，聯(lián)合組左側(cè)視皮層NR2A mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.661，P=0.061)，NR2B mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯減少(F=173.044，P=0.000；見表1和表2)。

2.1.3各組間右側(cè)視皮層NR2AmRNA、NR2BmRNA相對(duì)表達(dá)量比較與正常對(duì)照組相比，單眼形覺剝奪組右側(cè)視皮層NR2A mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加(F=8.591，P=0.026)，NR2B mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯減少(F=515.238，P=0.000)；與單眼形覺剝奪組相比，聯(lián)合組右側(cè)視皮層NR2A mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.072，P=0.798)、右側(cè)視皮層NR2B mRNA相對(duì)表達(dá)量增加(F=37.308，P=0.001；見表1和表2)。

表1 各組小鼠視皮層NR2A mRNA相對(duì)表達(dá)量

表2 各組小鼠視皮層NR2B mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2Westernblot法檢測(cè)視皮層NR2A亞基和NR2B亞基的表達(dá)在相對(duì)分子質(zhì)量220 000與 105 000 之間可見目的條帶NR2A亞基、NR2B亞基。在相對(duì)分子質(zhì)量71 000與50 000之間可見內(nèi)參條帶β-tubulin。

2.2.1各組內(nèi)左右側(cè)視皮層NR2A蛋白、NR2B蛋白相對(duì)表達(dá)量比較正常對(duì)照組左右側(cè)視皮層NR2A蛋白、NR2B蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.890、0.606)，單眼形覺剝奪組與聯(lián)合組左側(cè)視皮層，即剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層NR2A蛋白相對(duì)表達(dá)量均較右側(cè)視皮層減少(P=0.014、0.013)；單眼形覺剝奪組左側(cè)視皮層NR2B蛋白表達(dá)較右側(cè)視皮層增多(P=0.023)，聯(lián)合組左右側(cè)視皮層NR2B蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.234；見表3和表4)。

2.2.2各組間左側(cè)視皮層NR2A蛋白、NR2B蛋白相對(duì)表達(dá)量比較與正常對(duì)照組相比，單眼形覺剝奪組左側(cè)視皮層NR2A蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯減少(F=42.829，P=0.003)，NR2B蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加(F=15.027，P=0.018)；與單眼形覺剝奪組相比，聯(lián)合組左側(cè)視皮層NR2A蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.117，P=0.219)，NR2B蛋白相對(duì)表達(dá)量減少(F=15.984，P=0.016；見表3和表4)。

2.2.3各組間右側(cè)視皮層NR2A蛋白、NR2B蛋白相對(duì)表達(dá)量比較與正常對(duì)照組相比，單眼形覺剝奪組右側(cè)視皮層NR2A蛋白相對(duì)表達(dá)量增加(F=8.514，P=0.043)，NR2B蛋白相對(duì)表達(dá)量減少(F=8.514，P=0.043)；與單眼形覺剝奪組相比，聯(lián)合組右側(cè)視皮層NR2A蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.603，P=0.131)，右側(cè)視皮層NR2B蛋白相對(duì)表達(dá)量增加(F=10.816，P=0.025；見表3和表4)。

表3 各組小鼠視皮層NR2A 蛋白相對(duì)表達(dá)量

表4 各組小鼠視皮層NR2B 蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

單眼形覺剝奪是異常視覺經(jīng)驗(yàn)的重要形式之一。眾多研究表明，視覺發(fā)育關(guān)鍵期單側(cè)的形覺剝奪會(huì)導(dǎo)致視覺環(huán)路中眾多位置發(fā)生可塑性變化。鼠類90%～95%的視纖維在視交叉中交叉到對(duì)側(cè)[12]，因此這種影響具有半腦選擇性，也就是主要影響被剝奪眼的對(duì)側(cè)半腦，故單眼形覺剝奪對(duì)被剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層所產(chǎn)生的影響遠(yuǎn)大于剝奪眼同側(cè)視皮層。小鼠出生后3～5周為視覺發(fā)育關(guān)鍵期[13]，在此期間進(jìn)行單眼形覺剝奪已成為一個(gè)成熟的弱視模型，自從20世紀(jì)60年代創(chuàng)建此模型以來，就成為了視覺發(fā)育及可塑性研究的典型模型。

本研究從分子遺傳學(xué)及蛋白組學(xué)水平發(fā)現(xiàn)：(1)關(guān)鍵期內(nèi)單眼形覺剝奪6 d剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層中NR2A mRNA及蛋白表達(dá)減少，NR2B mRNA及蛋白表達(dá)增多；(2)剝奪眼同側(cè)視皮層中，NR2A mRNA及蛋白表達(dá)增加，NR2B mRNA及蛋白表達(dá)減少；(3)NR2B受體阻斷劑艾芬地爾能顯著降低NR2B受體的表達(dá)，并阻斷單眼形覺剝奪對(duì)NR2B表達(dá)的影響，但對(duì)NR2A表達(dá)無影響。

NR2A和NR2B型NMDA受體在視皮層中占絕大部分，出生后早期，NR2B亞基占優(yōu)勢(shì)，發(fā)育過程中，逐漸被NR2A亞基取代[14-16]。外界視覺經(jīng)驗(yàn)對(duì)兩種亞基的轉(zhuǎn)換至關(guān)重要，異常的視覺刺激能使NR2A/NR2B比值朝著錯(cuò)誤的方向發(fā)展，如暗飼養(yǎng)能延長(zhǎng)兩種亞基轉(zhuǎn)換的時(shí)間[14，17-18]，視覺經(jīng)驗(yàn)通過不同的調(diào)控水平調(diào)節(jié)NR2A/NR2B比值。有一種觀點(diǎn)認(rèn)為，NR2A亞基的發(fā)育性表達(dá)增加是視覺經(jīng)驗(yàn)在轉(zhuǎn)錄水平起作用的結(jié)果，而NR2B亞基則是在翻譯水平緩慢下降[19]，同時(shí)MIb-2泛素化也可增強(qiáng)NR2B亞基降解[20]。剝奪雙眼視覺經(jīng)驗(yàn)后，NR2A mRNA合成減慢，NR2B翻譯抑制消除，NR2B降解減弱。因此，視覺剝奪可降低NR2A水平，同時(shí)增加NR2B水平，進(jìn)而NR2A/NR2B值出現(xiàn)明顯下降[21]。本研究顯示，關(guān)鍵期內(nèi)單眼形覺剝奪6 d剝奪，眼對(duì)側(cè)視皮層中NR2A mRNA及蛋白表達(dá)減少，NR2B mRNA及蛋白表達(dá)增多，NR2A/NR2B比值降低，轉(zhuǎn)錄與翻譯結(jié)果一致，證明視覺經(jīng)驗(yàn)可能在轉(zhuǎn)錄水平抑制了NR2B的翻譯，而剝奪眼同側(cè)視皮層中NR2A mRNA及蛋白表達(dá)增加，NR2B mRNA及蛋白表達(dá)減少，NR2A/NR2B比值升高，表明剝奪眼同側(cè)視皮層NR2A/NR2B比值不僅會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性增加，而且比正常情況下更加明顯(F=117.332，P=0.000)，單眼形覺剝奪可能會(huì)導(dǎo)致剝奪眼同側(cè)視皮層可塑性關(guān)鍵期縮短。尚需電生理學(xué)方法來證實(shí)此假設(shè)。

艾芬地爾作為選擇性作用于NMDA受體NR2B亞型的阻滯劑受到越來越多的關(guān)注，其在治療神經(jīng)病理性疼痛、藥物依賴、腦卒中、帕金森病中具有很大的潛力[22-24]。隨著NR2A亞基與NR2B亞基研究的深入及其在突觸可塑性中發(fā)揮的重要作用，艾芬地爾作為特異的NR2B亞基阻斷劑在視覺可塑性方面的應(yīng)用越來越廣泛。艾芬地爾能使暗飼養(yǎng)對(duì)小鼠視皮層NR2B亞基/NR2A亞基相互轉(zhuǎn)換時(shí)間造成的影響恢復(fù)正常，阻斷NR2B亞基介導(dǎo)的興奮性突觸后電流，并且這種阻斷作用明顯較單眼形覺剝奪組增強(qiáng)，艾芬地爾能使暗飼養(yǎng)拓寬的脈沖時(shí)間依賴的突觸可塑性時(shí)間窗恢復(fù)正常，進(jìn)而解釋了STDP整合時(shí)間窗拓展的機(jī)制[11]。但是關(guān)于NR2B亞基受體阻斷劑對(duì)受體亞基具體表達(dá)的影響至今仍未見報(bào)道。我們的研究表明，艾芬地爾能顯著降低剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層NR2B mRNA和蛋白的表達(dá)量，并且降低作用要比單眼形覺剝奪組明顯，而剝奪眼同側(cè)視皮層NR2B mRNA和蛋白反而有所增高，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是艾芬地爾使剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層NR2B亞基表達(dá)減少，消除兩側(cè)視皮層之間的競(jìng)爭(zhēng)抑制的結(jié)果。而艾芬地爾對(duì)NR2A亞基的表達(dá)并沒有影響，也說明NMDA受體NR2A亞基和NR2B亞基的總量并不是不變的，兩者的表達(dá)可能有不同的調(diào)節(jié)路徑。

另外，本實(shí)驗(yàn)的缺陷在于：(1)沒有對(duì)兩種亞基的表達(dá)進(jìn)行連續(xù)性的檢測(cè)，進(jìn)而繪制發(fā)育關(guān)鍵期NR2A亞基和NR2B亞基表達(dá)曲線；(2)視皮層定位采用小鼠腦解剖圖譜，并參照特定的解剖標(biāo)志，未能在高倍顯微鏡下通過神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)等確定視皮層邊界，取材難免存在誤差。