李娟 羅阿麗 秦莉

作者單位：710004 陜西省西安市，西安市第四醫(yī)院眼科(李娟)；710100 陜西省西安市，西安市胸科醫(yī)院病理科(羅阿麗)；710061 陜西省西安市，西安交通大學(xué)一附院眼科(秦莉)

許多種角膜疾病都可能導(dǎo)致視力完全喪失，目前角膜移植是治療不可逆性角膜盲的最重要手段[1]。它不僅能夠提高視力，還有助于控制急性感染性炎癥，保持眼球的完整性。角膜移植術(shù)雖是目前最成功的器官移植手術(shù)，但移植排斥反應(yīng)仍是移植失敗的首要原因[2]。盡管常規(guī)應(yīng)用免疫抑制劑，但仍有近一半的排斥反應(yīng)不可逆轉(zhuǎn)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是參與基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)分子，文獻(xiàn)報(bào)道其是參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等多種反應(yīng)的調(diào)控者，在器官移植排斥反應(yīng)中起著中心調(diào)控者的作用[3-4]。本文探討NF-κB抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)對角膜移植大鼠角膜組織的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取健康清潔級SD(Sprague Dawley)大鼠及Wistar大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量200～250 g，鼠齡2～3個(gè)月。SD大鼠28只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Wistar大鼠14只，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠均置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(室溫25 ℃±1 ℃，濕度60%±10%)，12 h明暗交替周期(早上800到晚上800)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用及實(shí)驗(yàn)條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1PDTC滴眼液的配制PDTC濃度參考Yoshida等[5]應(yīng)用于玻璃體內(nèi)的濃度，文獻(xiàn)中認(rèn)為1 mg·mL-1PDTC是抑制視網(wǎng)膜新生血管的最低有效濃度，且該濃度對眼無毒副作用。取200 mg PDTC溶于200 mL雙蒸水中配制成PDTC滴眼液，調(diào)pH值為6.8～7.2，微孔濾膜過濾除菌。避光置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2主要儀器與試劑裂隙燈前節(jié)照相系統(tǒng)(蘇州六六視覺科技股份有限公司)，光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus BX41)，石蠟切片機(jī)(德國 Leica RM2235)，眼科手術(shù)顯微鏡(日本 TOPCON)，無損傷縫合線10-0(美國 Alcon公司)，NF-κB p65單克隆抗體血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)單克隆抗體(美國 SANTA CRUZ，小鼠抗大鼠)，小鼠抗大鼠CD4 FITC、小鼠抗大鼠CD8 FITC、小鼠IgG1陰性對照FITC(英國 Serotec)，SABC免疫組織化學(xué)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，100 g·L-1水合氯醛溶液(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科)，PDTC(美國Sigma Aldrich公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大鼠同種異體角膜移植模型的建立參照Williams等[6]方法建立模型。供體鼠提供雙眼角膜，受體鼠均以左眼為術(shù)眼。術(shù)前散瞳充分后，水合氯醛溶液4 mL·kg-1腹腔注射，倍諾喜滴眼液表面麻醉，常規(guī)無菌操作，手術(shù)全程在顯微鏡下進(jìn)行。供體角膜植片制作：用3.25 mm直徑環(huán)鉆在供體鼠角膜中央鉆切，直到某象限穿通，取下角膜植片，置于黏彈劑Healon中備用。植床制備：作上下瞼牽引線，直徑3.0 mm環(huán)鉆鉆取中央?yún)^(qū)角膜，將植片置于植床，以10-0尼龍絲線間斷縫合8針，線結(jié)暴露不包埋。術(shù)畢涂紅霉素眼膏，縫合瞼緣。大鼠同種異體角膜移植術(shù)后，其中有麻醉意外等原因發(fā)生，按排除標(biāo)準(zhǔn)剔除出組，并及時(shí)補(bǔ)充相等數(shù)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，觀察期內(nèi)無受體鼠死亡，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型總數(shù)恒定。按照排斥反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)[6]確定角膜植片的存活時(shí)間。

1.3.2動(dòng)物分組14只Wistar大鼠均為供體鼠，提供雙眼角膜；28只SD大鼠為受體鼠，均以左眼為術(shù)眼，右眼設(shè)為正常對照。手術(shù)完成后將28只SD大鼠隨機(jī)分為3組，對照組(10只)以生理鹽水滴左眼，實(shí)驗(yàn)組(10只)以1 mg·mL-1PDTC滴左眼，均為每天3次，每次1滴，空白組(8只)不做任何處理。以上治療均從術(shù)后第1天開始，至取標(biāo)本或?qū)嶒?yàn)觀察期結(jié)束為止。

1.3.3角膜新生血管評分術(shù)后第1天起，分別在術(shù)后第5天、第15天、第25天在裂隙燈下觀察各組大鼠角膜新生血管的情況并以混濁、水腫及新生血管三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評分。觀察期終點(diǎn)設(shè)定為術(shù)后25 d。每次測定并記錄從角鞏膜緣長出的新生血管長度，由2人同時(shí)觀察并記錄、測量，參照Holland等[7]文獻(xiàn)進(jìn)行評分。

1.3.4各組角膜病理學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察處死受體大鼠，摘取大鼠左眼球，將各組大鼠左眼球分別固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液內(nèi)[8-9]，梯度酒精脫水，浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片，片厚4 μm，取每一個(gè)角膜標(biāo)本的部分切片進(jìn)行HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變；剩余部分切片分別進(jìn)行NF-κB及細(xì)胞因子VEGF免疫組織化學(xué)染色。采用SABC法，依說明書步驟進(jìn)行，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，免疫組織化學(xué)結(jié)果數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；角膜植片存活時(shí)間，采用單因素方差分析，并建立Kaplan-Meier生存曲線，采用Log Rank法檢驗(yàn)對比組間的差異，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組角膜移植排斥反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間對照組、實(shí)驗(yàn)組、空白組角膜移植排斥反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間分別為(10.80±1.40)d、(23.40±2.30)d、(11.20±2.06)d，實(shí)驗(yàn)組排斥反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間較對照組明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2術(shù)后不同時(shí)間各組角膜植片新生血管數(shù)、新生血管面積、排斥反應(yīng)指數(shù)對照組新生血管一般術(shù)后第3～5天出現(xiàn)，并很快進(jìn)入植片周邊，沿縫線處向角膜植片中央粗大生長。實(shí)驗(yàn)組新生血管一般術(shù)后第5～7天出現(xiàn)，生長速度較慢，血管稀疏。術(shù)后不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組新生血管數(shù)、新生血管面積及排斥反應(yīng)指數(shù)均小于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 術(shù)后各組角膜植片新生血管數(shù)、新生血管面積及排斥反應(yīng)指數(shù)

2.3各組大鼠術(shù)后角膜組織病理學(xué)觀察結(jié)果正常大鼠角膜上皮由5～6層細(xì)胞構(gòu)成，上皮結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列大致正常；角膜基質(zhì)層膠原排列整齊(圖1A)。角膜移植術(shù)后，實(shí)驗(yàn)組大鼠角膜上皮基底細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多空泡，角膜基質(zhì)層內(nèi)出現(xiàn)間質(zhì)水腫(圖1B)；炎癥細(xì)胞浸潤，并見新生的毛細(xì)血管(圖1C)；縫線及切口周圍見大量淋巴細(xì)胞浸潤，部分植片中央發(fā)生散在的炎癥細(xì)胞浸潤、角膜上皮部分脫落(圖1D)。對照組角膜植片水腫及炎癥細(xì)胞的浸潤程度較實(shí)驗(yàn)組明顯增加，且對照組角膜植片顯著增厚，基質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松、紊亂；實(shí)驗(yàn)組角膜植片相對基質(zhì)板層結(jié)構(gòu)排列有序，新生血管數(shù)在相同時(shí)間內(nèi)明顯減少。

2.4NF-κB及VEGF在角膜植片的表達(dá)

2.4.1NF-κB在角膜植片的表達(dá)情況免疫組織化學(xué)染色顯示，NF-κB陽性細(xì)胞為細(xì)胞核呈棕黃色或棕黑色的細(xì)胞。對照組(圖2A)、實(shí)驗(yàn)組(圖2B)角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)層細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)均有NF-κB陽性表達(dá)。NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)組

圖1 正常大鼠及實(shí)驗(yàn)組大鼠角膜上皮顯微鏡下觀察結(jié)果。A：正常大鼠角膜上皮結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列大致正常(三角)；B：實(shí)驗(yàn)組大鼠角膜基質(zhì)層內(nèi)出現(xiàn)間質(zhì)水腫(三角)；C：實(shí)驗(yàn)組大鼠角膜上皮內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，新生毛細(xì)血管形成(三角)；D：實(shí)驗(yàn)組大鼠角膜上皮部分脫落，僅殘留少許角膜上皮細(xì)胞(三角)

為每400倍視野(4.236±0.856)個(gè)，較對照組[(18.451±1.234)個(gè)]明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻捉M大鼠角膜內(nèi)鮮有陽性表達(dá)(圖2C)。

圖2 各組大鼠角膜植片NF-κB免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。A：對照組出現(xiàn)較多陽性細(xì)胞；B：實(shí)驗(yàn)組內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少；C：空白組大鼠角膜內(nèi)少見陽性細(xì)胞

2.4.2VEGF在角膜植片的表達(dá)情況免疫組織化學(xué)染色顯示，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿呈棕黃色或棕黑色者為VEGF陽性細(xì)胞。VEGF在對照組(圖3A)、實(shí)驗(yàn)組(圖3B)大鼠角膜植片的上皮層及基質(zhì)層均有表達(dá)，新生血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)亦有陽性表達(dá)；VEGF陽性細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)組為每400倍視野(2.631±0.238)個(gè)，較對照組[(6.254±0.721)個(gè)]明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。空白組大鼠角膜內(nèi)鮮有陽性表達(dá)(圖3C)。

圖3 各組大鼠角膜植片VEGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。A：對照組內(nèi)出現(xiàn)較多陽性細(xì)胞；B：實(shí)驗(yàn)組內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少；C：空白組大鼠角膜內(nèi)少見陽性細(xì)胞

3 討論

同種異體之間進(jìn)行角膜移植是治療角膜疾病致盲最為有效的方法，研究表明[10]角膜移植排斥反應(yīng)是一個(gè)由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)并參與的復(fù)雜過程，受很多因素調(diào)節(jié)。近年來越來越多的研究試圖闡明以NF-κB為核心的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在器官移植排斥反應(yīng)中的作用[11]。

目前，排斥反應(yīng)仍是角膜移植失敗的主要原因，動(dòng)物模型可以更好地幫助人們了解角膜移植排斥反應(yīng)的病理過程。研究人員制作了多種動(dòng)物角膜移植模型[10，12-13]。早期多采用兔子、羊等較大的動(dòng)物以求手術(shù)上的成功率，但由于其供體和受體組織相容性差異難以控制，且缺乏常用的相應(yīng)免疫試劑，逐漸趨于淘汰。由于大鼠角膜MHC抗原的表達(dá)與人類角膜相似且移植手術(shù)難度小于小鼠，所以大鼠角膜移植模型仍為許多研究者首選。本實(shí)驗(yàn)從模型建立的可行性及動(dòng)模模型的特點(diǎn)出發(fā)，采用遠(yuǎn)交群SD和Wistar大鼠建立同種異體角膜移植模型，利用保留縫線等來保證異體移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，提高動(dòng)物模型的成功率。移植后各組大鼠角膜植片混濁、水腫及新生血管發(fā)生及發(fā)展規(guī)律一致，在實(shí)驗(yàn)觀察終點(diǎn)時(shí)除一只尚未發(fā)生排斥外(術(shù)后27 d發(fā)生排斥)，各移植組均在相對應(yīng)的植片存活時(shí)間范圍內(nèi)發(fā)生排斥反應(yīng)。動(dòng)物模型的成功建立為本實(shí)驗(yàn)后續(xù)的實(shí)施奠定了穩(wěn)定且可信的研究基礎(chǔ)。

移植術(shù)后角膜新生血管是角膜移植發(fā)生排斥反應(yīng)的主要危險(xiǎn)因素[14]。目前研究表明，角膜新生血管的出現(xiàn)是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，受多種因素的調(diào)節(jié)，并且有許多細(xì)胞因子、黏附分子參與了角膜新生血管形成[15]。生理情況下，新生血管生長有一套嚴(yán)密的調(diào)節(jié)體系加以控制，抗血管生成因子(血管抑素[16]、內(nèi)皮抑素[17]等)和血管生成因子(VEGF[18]、成纖維細(xì)胞生長因子等)處于一種平衡狀態(tài)。當(dāng)這種平衡被破壞時(shí)，即可導(dǎo)致新生血管出現(xiàn)。研究表明[18-19]，VEGF是眼部新生血管生成過程中最關(guān)鍵、最重要的細(xì)胞因子。NF-κB在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控著多種血管生成因子的表達(dá)如VEGF，并且VEGF可在上游以NF-κB為靶點(diǎn)起到調(diào)控作用[20-22]，但尚未見靶向抑制NF-κB與角膜移植術(shù)后角膜新生血管的相關(guān)研究。所以本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PDTC特異性抑制NF-κB活性而調(diào)節(jié)其下游某些在新生血管形成中起重要作用的因子，以期達(dá)到抑制大鼠術(shù)后新生血管生成的作用。本研究也證實(shí)了通過抑制NF-κB活性可以下調(diào)VEGF的表達(dá)，抑制同種異體角膜移植術(shù)后角膜新生血管的發(fā)生，NF-κB及其下游調(diào)控的VEGF在角膜新生血管的形成過程中發(fā)揮著較為關(guān)鍵的作用。

有研究表明[23]，活化的NF-κB介導(dǎo)其他多種促血管生成因子表達(dá)，如IL-8、ICAM-1、VCAM-1等，上述促血管生成因子又影響上調(diào)VEGF基因的表達(dá)。VEGF反過來又能增強(qiáng)NF-κB結(jié)合能力，形成一正反饋環(huán)路，共同促進(jìn)新生血管的形成。此外，NF-κB對于新生血管形成的調(diào)節(jié)作用，還表現(xiàn)為NF-κB可以促進(jìn)MMP2、MMP9的表達(dá)[24]，從而加速血管下基底膜的降解及角膜新生血管的形成。Joyce等[25]證實(shí)，NF-κB還能增強(qiáng)細(xì)胞周期蛋白D的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖。因此，活化的NF-κB通過直接與間接的多種途徑，有效地促進(jìn)新生血管的生成[26]，可能對新生血管形成具有核心的調(diào)節(jié)作用。對該靶點(diǎn)的阻斷可能較單一阻斷新生血管形成中某一作用因子(如單一拮抗VEGF或VEGF受體，負(fù)向調(diào)控VEGF或其受體表達(dá))更為有效地抑制新生血管的生成。