楊曉滿，楊曉婷，趙可及，李加友，于建興

(嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

生物胺是一類具有生物活性、含氨基的低分子質(zhì)量有機(jī)化合物的總稱，包括腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、酪胺、苯乙胺、組胺、色胺等[1]，廣泛存在于食品中，過量的生物胺會(huì)使人體中毒，引起頭疼、血壓變化、呼吸紊亂、心悸、嘔吐等嚴(yán)重反應(yīng)[2]，其中組胺和酪胺的生物毒性最大，控制食品中組胺和酪胺的形成是酒類食品的重要安全問題[3]。釀酒過程中原料所含游離氨基酸、可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物以及適合該微生物生長和氨基酸脫羧酶分泌的外界環(huán)境都會(huì)對最終產(chǎn)品的生物胺含量產(chǎn)生重要影響[4]。在酸性環(huán)境中，氨基脫羧酶活性提高，但產(chǎn)生氨基酸脫羧酶細(xì)菌的生長會(huì)受到抑制，所以pH值對生物胺含量的影響是pH值對氨基脫羧酶和產(chǎn)氨基酸脫羧酶細(xì)菌共同作用的結(jié)果[5]。溫度和酵母菌用量對產(chǎn)氨基酸脫羧酶有顯著影響[6-7]。

降低蜂蜜酒中生物胺的含量、提高蜂蜜酒的品質(zhì)和安全性具有重要意義。本試驗(yàn)通過考察蜂蜜酒釀造中的幾個(gè)關(guān)鍵因子對組胺和酪胺形成的影響，確定不同工藝條件與組胺和酪胺形成的關(guān)系，以優(yōu)化工藝條件來實(shí)現(xiàn)控制蜂蜜酒中生物胺的目的，為蜂蜜酒的開發(fā)利用和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蜂蜜(嘉興市泌蜜園蜂產(chǎn)品有限公司)；帝伯仕果膠酶(食品級果膠酶，法國進(jìn)口)；釀酒高活性干酵母(安琪酵母)；檸檬酸和磷酸氫二胺為市售食品級。高氯酸、1，7-二氨基庚烷、丹磺酰氯、NaHCO3、氨水、乙醚均為分析純；乙腈、丙酮為色譜純。

VBR90 A手持糖度計(jì)(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司)，AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，UB-7 pH計(jì)(美國丹佛公司)，戴安U-3000高效液相色譜儀(美國戴安公司)。

1.2 方法

1.2.1 蜂蜜酒的釀造

蜂蜜與水混合均勻→調(diào)節(jié)糖度→蜂蜜水滅菌(80 ℃)→添加果膠酶(50 ℃)→取干酵母活化(40 ℃)→添加活化的酵母(30 ℃)→裝瓶進(jìn)行蜂蜜酒釀造。

根據(jù)前期研究，試驗(yàn)過程將對溫度、糖度、pH值、酵母用量等幾個(gè)因子進(jìn)行比較，確定其對蜂蜜酒釀造過程中的組胺和酪胺形成的影響。

1.2.2 生物胺含量的測定[8]

樣品的衍生。取1 mL待測酒樣于15 mL離心管中，加20 mg·L-11，7-二氨基庚烷內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加入0.2 mL 2 mol·L-1NaOH溶液使之呈堿性，再加入0.3 mL飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，然后加入10 mg·mL-1DNS-Cl溶液2 mL進(jìn)行柱前衍生，在40 ℃水浴黑暗反應(yīng)45 min，反應(yīng)結(jié)束后加入0.1 mL氨水終止反應(yīng)，靜置30 min。

萃取。加入3 mL乙醚于以上試樣中，再加入適量NaCl，振蕩分層后抽取上層液體于15 mL離心管中，重復(fù)3次，將3次取出的上層液體合并于小燒瓶中，加入適量無水硫酸鈉。在100 r·min-1的R-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，蒸干得固體顆粒。取下小燒瓶，加入1 mL乙腈振蕩清洗，倒出清洗液體，重復(fù)3次，合并液體，過0.22 μm微孔濾膜，濾液可直接進(jìn)HPLC測定。

高效液相色譜分析。采用戴安U-3000高效液相色譜儀，其中色譜柱C18柱(4.6 mm×250 mm內(nèi)徑，5 μm，Acclaim 120)，紫外檢測波長230 nm，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫30 ℃，流動(dòng)相B為超純水，C為乙腈溶液，流速1.0 mL·min-1，時(shí)間控制在30 min。梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜的洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 釀造溫度對蜂蜜酒中組胺和酪胺形成的影響

釀造溫度對蜂蜜酒的品質(zhì)有重要的影響，一般釀造溫度在18～25 ℃。圖1～2可以看出，隨著釀造溫度的升高，蜂蜜酒中組胺和酪胺的含量顯著增加，溫度越高則增加越多?？赡苁轻勗鞙囟仍礁?，酵母及其他微生物在醪液中的生長代謝速度越快的原因。在第7天時(shí)，釀造溫度為22 ℃和24 ℃條件下的組胺含量明顯高于其他溫度，同時(shí)發(fā)酵溫度越高，酵母的自溶速度也快，引起發(fā)酵液中氨基酸含量升高。酒液中組胺的終濃度受溫度的影響并不顯著，而酪胺的終濃度受釀造溫度的影響非常明顯。24 ℃時(shí)的酪胺濃度高達(dá)11.23 mg·L-1，是18 ℃時(shí)酪胺濃度(5.55 mg·L-1)的2倍?？梢姴捎玫蜏蒯勗煊欣诳刂品涿劬浦薪M胺和酪胺的形成。

圖1 溫度對蜂蜜中組胺形成的影響

圖2 溫度對蜂蜜中酪胺形成的影響

2.2 糖度對蜂蜜酒中組胺和酪胺形成的影響

蜂蜜酒釀造過程中的主要營養(yǎng)物來源于添加的蜂蜜，通過控制蜂蜜的用量，調(diào)整蜂蜜酒釀造中醪液的糖度和其他營養(yǎng)物的濃度。蜂蜜用量過低，所生產(chǎn)的蜂蜜酒酒體單薄，因而適量蜂蜜用量是蜂蜜酒品質(zhì)的關(guān)鍵控制因素之一[9]。

圖3～4表明，糖度對蜂蜜酒中組胺和酪胺的形成有顯著影響，當(dāng)醪液的糖度為30%(Brix)時(shí)，組胺和酪胺含量高達(dá)3.48和13.01 mg·L-1，分別為低糖度(21%)時(shí)的2.8和2.0倍。因此，綜合平衡蜂蜜酒的口感和生物胺含量，選擇適當(dāng)濃度的糖度對產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要。

圖3 糖度對蜂蜜中組胺形成的影響

圖4 糖度對蜂蜜中酪胺形成的影響

2.3 pH值對蜂蜜酒中組胺和酪胺形成的影響

pH值是影響食品中生物胺生成重要的發(fā)酵條件。酸性環(huán)境有利于氨基脫羧酶活性的提高，但會(huì)抑制產(chǎn)氨基酸脫羧酶細(xì)菌的生長，pH值對生物胺含量的影響是對氨基脫羧酶和產(chǎn)氨基酸脫羧酶細(xì)菌共同作用的結(jié)果[10]。

圖5～6表明，從所考察的pH值(3.3～3.9)對組胺和酪胺形成的影響來看，低pH時(shí)，組胺和酪胺含量高；高pH值時(shí)，組胺和酪胺含量低。醪液起始pH值3.0時(shí)，組胺和酪胺的最高值均超過起始pH值3.9的2倍，但醪液起始pH值超過3.5時(shí)，通常會(huì)有發(fā)酵污染的危險(xiǎn)；pH值3.0的醪液對雜菌的生長有抑制作用，采用高pH值生產(chǎn)工藝時(shí)，需保證良好的生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生。

圖5 pH值對蜂蜜中組胺形成的影響

圖6 pH值對蜂蜜中酪胺形成的影響

2.4 酵母用量對蜂蜜酒中組胺和酪胺形成的影響

酵母在酒精發(fā)酵過程中會(huì)改變蜂蜜水中含氮化合物的組成，可利用某些氨基酸，也能通過酵母的自溶作用釋放一些氨基酸，被乳酸菌等具有氨基酸脫羧酶活性的微生物利用生產(chǎn)生物胺。增加酵母菌的使用量會(huì)加快酒精發(fā)酵速度，縮短釀造時(shí)間，但酵母菌也會(huì)產(chǎn)生更多的氨基酸，增加生物胺產(chǎn)生的危險(xiǎn)性。

由圖7～8可知，不同酵母菌用量的蜂蜜酒中組胺和酪胺生成量有顯著區(qū)別。當(dāng)酵母用量為0.20%時(shí)，酒中組胺的量明顯比其他處理要高；當(dāng)酵母用量達(dá)到0.25%時(shí)，組胺的量又顯著下降。在考察的酵母用量范圍內(nèi)，隨著酵母用量的增加，酪胺的含量同步增加。當(dāng)酵母用量為0.25%時(shí)，酪胺含量為13.23 mg·L-1；而酵母用量為0.10%時(shí)，酪胺含量只有8.32 mg·L-1。

圖7 酵母用量對蜂蜜酒中組胺形成的影響

圖8 酵母用量對蜂蜜酒中酪胺形成的影響

3 小結(jié)

通過單因素分析法研究了蜂蜜酒生產(chǎn)過程中溫度、糖度、pH值、酵母量等主要工藝參數(shù)對組胺和酪胺產(chǎn)生量的影響。不同處理?xiàng)l件下的結(jié)果表明，起始階段組胺的含量先高后低，可能是因?yàn)榫w生長旺盛，代謝速度過快造成的。而釀造28 d后，蜂蜜酒中的組胺和酪胺的含量趨于穩(wěn)定，增量不明顯，可能是因?yàn)獒勗旌笃诘臓I養(yǎng)物消耗和酒精度過高的雙重作用使酒液中的生物轉(zhuǎn)化作用變?nèi)酰被崦擊让傅幕盍κ艿絿?yán)重影響造成的。不同處理?xiàng)l件下的組胺和酪胺的變化趨勢并不完全相同，表明蜂蜜酒釀造過程中組胺和酪胺產(chǎn)生的機(jī)理有所不同。研究結(jié)果表明，不同蜂蜜酒釀造工藝會(huì)導(dǎo)致組胺和酪胺產(chǎn)生量的不同。當(dāng)醪液起始pH值較高、酵母用量較少、糖度和釀造溫度均較低時(shí)，組胺和酪胺的含量處于較低水平。