納米藥物載體的結(jié)構(gòu)修飾實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸

李成龍，李榮燁，云 鵬，張冠宏，郗來(lái)順，王元斗，宿 烽

(1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)(2.勝利油田中心醫(yī)院，山東 東營(yíng)，257000)

1 前 言

納米載體作為一種亞微粒輸送系統(tǒng)，能大大提高藥物的吸收度和穩(wěn)定性，改善藥物性質(zhì)和靶向性，加快基因轉(zhuǎn)染速率，延長(zhǎng)作用時(shí)間，增加療效，已廣泛應(yīng)用于腫瘤、血管疾病的治療[1, 2]。目前廣泛應(yīng)用的納米載體主要包括膠束、脂質(zhì)體、樹(shù)枝狀大分子、聚合物納米顆粒等[1, 3, 4]，其包載藥物進(jìn)入機(jī)體，通過(guò)調(diào)節(jié)載體的表面電荷、粒徑大小或與相應(yīng)配體結(jié)合等方式突破細(xì)胞膜[5, 6]；在跨膜過(guò)程中形成內(nèi)涵體，隨著內(nèi)涵體被溶酶體內(nèi)吞，進(jìn)入到溶酶體[3, 4, 7]。一般載體會(huì)因?yàn)樵趦?nèi)體中的長(zhǎng)時(shí)間停留，由于內(nèi)涵體/溶酶體內(nèi)酸性環(huán)境(pH約4.0～6.0)及大量酶的存在導(dǎo)致載體水解，造成包載物質(zhì)的滲漏，改變其結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性，嚴(yán)重影響所包載藥物的治療效果[8, 9]，如圖1所示。因此，針對(duì)內(nèi)體逃逸的機(jī)制，研究人員對(duì)藥物載體材料進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而達(dá)到內(nèi)體逃逸的目的，提高藥物療效，降低藥物毒副作用[10]。

2 藥物載體內(nèi)體逃逸的方式

藥物載體經(jīng)過(guò)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，由于內(nèi)吞胞質(zhì)的pH值從早期內(nèi)涵體(pH 5.5～6.5)到晚期內(nèi)涵體(pH 4.5～5.5)，最后到溶酶體(pH<5)，呈現(xiàn)出逐漸降低的過(guò)程[11]，因此，藥物載體可通過(guò)與內(nèi)體逃逸劑結(jié)合實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸。常用內(nèi)體逃逸劑如表1所示。

圖1 胞吞及內(nèi)體逃逸示意圖[7]：通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞的粒子被包裹在小泡中，形成早期內(nèi)涵體、晚期內(nèi)涵體，最后發(fā)展為溶酶體。在此過(guò)程中胞內(nèi)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸，發(fā)揮作用；反之，在溶酶體中被酶降解Fig.1 Schematic of endocytosis and endosomal escape[7]:particles entered the cells via the endocytic pathway become entrapped in the visicles, the vesicles matured form early endosomes and late endosomes and eventually end up in the lysosome, the particles are effective by achieving the endosome escape; otherwise, enzymatic degradation processes take place

2.1 利用質(zhì)子化效應(yīng)脹破內(nèi)體膜

質(zhì)子化效應(yīng)是通過(guò)具有高緩沖能力的質(zhì)子化劑介導(dǎo)，在質(zhì)子化時(shí)，能夠自由膨脹，使得內(nèi)體內(nèi)滲透壓升高，引起大量的水和離子內(nèi)流進(jìn)入內(nèi)體，導(dǎo)致內(nèi)體膜脹破，從而將內(nèi)體內(nèi)包裹的物質(zhì)釋放，實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸[12]，如圖2所示。有研究表明，叔胺基團(tuán)能在酸性條件下吸附質(zhì)子，使物質(zhì)免受酸性環(huán)境的影響，同時(shí)其質(zhì)子化介導(dǎo)能力會(huì)增大內(nèi)體滲透壓，脹破內(nèi)體膜，將物質(zhì)從內(nèi)體中釋放出來(lái)[13]。另有研究表明，富含組氨酸的分子由于咪唑基的存在，具有很好的質(zhì)子介導(dǎo)作用，也會(huì)導(dǎo)致內(nèi)體膜的破裂[14]。

2.2 通過(guò)膜的融合實(shí)現(xiàn)跨膜

另一種內(nèi)體逃逸機(jī)制是實(shí)現(xiàn)膜的融合，降低內(nèi)體膜的穩(wěn)定性[12]。對(duì)細(xì)胞而言，細(xì)胞膜由磷脂雙分子層構(gòu)成，膜內(nèi)是疏水環(huán)境，而膜兩側(cè)為水環(huán)境。而α-螺旋類似于DNA雙螺旋，具有NCCNCCNCC骨架結(jié)構(gòu)，能夠?qū)⑹杷鶊F(tuán)放在骨架外側(cè)，將親水基團(tuán)置于內(nèi)側(cè)，膜蛋白能夠以α-螺旋實(shí)現(xiàn)單次或多次跨膜[15]。

2.3 通過(guò)形成膜孔穿過(guò)內(nèi)體膜

通常，孔的形成是基于膜張力和線張力之間的相互作用(圖3)。膜張力大形成孔，線張力大關(guān)閉孔。多肽的一些組件和孔的邊緣具有較高的親和力，故將多肽結(jié)合到聚合物表面可以減少線張力，從而增加孔的形成數(shù)量，保持孔徑的穩(wěn)定[16]。如將陽(yáng)離子兩親性多肽(AMPs)與脂質(zhì)雙分子層結(jié)合即會(huì)導(dǎo)致其內(nèi)部應(yīng)力和內(nèi)膜張力的增加，足夠使膜形成孔隙[17]。Kim等[18]報(bào)道了一種細(xì)胞質(zhì)穿透抗體TMab4，其在酸性環(huán)境下會(huì)發(fā)生構(gòu)象的變化，導(dǎo)致內(nèi)體膜孔的形成，從而實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸。為研究其內(nèi)體逃逸行為，用TMab4脈沖Hela細(xì)胞，隨后用不同內(nèi)體標(biāo)記物進(jìn)行染色，結(jié)果表明在內(nèi)吞2 h后，TMab4出現(xiàn)在內(nèi)體中，在6 h后，逃逸到細(xì)胞質(zhì)中，實(shí)現(xiàn)逃逸。

表1 內(nèi)體逃逸劑及其機(jī)制[7, 10]

圖2 質(zhì)子化效應(yīng)機(jī)理示意圖[10]: 1：質(zhì)子化制劑通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用內(nèi)化形成內(nèi)小體；2：由于質(zhì)子緩沖作用，伴隨氯離子的注入，質(zhì)子通過(guò)ATP酶內(nèi)流；3：內(nèi)小體離子濃度高，可從胞漿中吸水，導(dǎo)致滲透膨脹；4：內(nèi)小體破裂，釋放內(nèi)容物Fig.2 Schematic of proton sponge mechanism[10]: 1: cell internalization of proton sponge agent via endocytosis to form endosome; 2: influx of protons by ATPase due to proton buffering action of the agent with concomitant influx of chloride ions; 3: high ionic concentration in endosome attracts water from cytosol leading to osmotic swelling; 4: rupture of endosome to release the endocytosed material

圖3 多肽在內(nèi)體膜上自組裝形成膜孔[10]Fig.3 Peptides self-assemble to form pores in endosomal membrane[10]

2.4 光化學(xué)內(nèi)化破壞內(nèi)體膜

利用光化學(xué)作用激活進(jìn)入細(xì)胞的光敏分子，產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，破壞內(nèi)體膜的過(guò)程稱之為光化學(xué)內(nèi)化(photochemical internalization, PCI)。光敏分子通過(guò)附著、包載等方式進(jìn)入細(xì)胞，在光的照射下，釋放ROS，使內(nèi)體膜氧化破裂，釋放內(nèi)容物[19, 20](圖4)。Selbo等[21]將光敏劑TPCS2a(紅色熒光)與Alexa-488(綠色熒光)標(biāo)記的AC133皂草素和WiDr細(xì)胞共孵育18 h后，觀察到熒光共定位于內(nèi)體中。曝光1 h后，在整個(gè)胞質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)有彌散的熒光顯影，說(shuō)明PCI誘導(dǎo)的皂草素成功實(shí)現(xiàn)逃逸。

圖4 光誘導(dǎo)內(nèi)體逃逸示意圖[20]：1：光敏劑定位在內(nèi)體膜；2：光照激發(fā)光敏劑產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)；3：ROS破壞內(nèi)膜釋放內(nèi)容物Fig.4 Schematic illustration of photo induced endosomal release[20]: 1: localization of photosensitizer (PS) in endosomal membrane; 2: illumination of light exciting photosensitizer to generate reactive oxygen species (ROS); 3: disruption of endosomal membrane by ROS to release cargo in cytoplasm

2.5 免疫響應(yīng)的屏蔽

仿生粒子的引入，可以達(dá)到屏蔽免疫系統(tǒng)響應(yīng)的效果，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，同時(shí)使納米粒子具有生物特性，對(duì)特定組織、細(xì)胞具有靶向作用。Zhang等[22]從血液中分離出血小板，由于血小板外側(cè)膜為負(fù)電性，聚乳酸-羥基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)納米粒子也為負(fù)電性，利用靜電排斥理論使體系構(gòu)成“right-side-out”結(jié)構(gòu)，血小板上的各種蛋白得以保留并朝向外側(cè)，使得最終的體系既有納米粒子載體特性，又有血小板活性。結(jié)果表明，血小板膜覆蓋的納米粒子，能有效結(jié)合人膠原蛋白，并對(duì)孤立血管的損傷區(qū)域具有靶向作用。

3 藥物載體為實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸的結(jié)構(gòu)修飾

3.1 聚合物修飾

3.1.1 胺類聚合物

胺類聚合物如聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)、聚酰胺-胺、氯化銨及甲胺等，其結(jié)構(gòu)中含有大量的胺基，能夠吸附質(zhì)子，避免藥物受酸性環(huán)境影響，還能增大內(nèi)體內(nèi)滲透壓，使離子內(nèi)流，造成膜的脹破，實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸[23, 24]。Behr等[25]首先提出將PEI作為“質(zhì)子海綿”，其緩沖能力在pH7.2～5.0，他的研究小組假設(shè)這種聚合物可以通過(guò)滲透壓失衡來(lái)破壞內(nèi)體。Borchard等[26]將PEI加入到PLGA溶液，得到PLGA-PEI納米顆粒，對(duì)該納米顆粒負(fù)載DNA后其在細(xì)胞內(nèi)分布及表達(dá)進(jìn)行定位。用羅丹明標(biāo)記DNA，6 h后DNA進(jìn)入內(nèi)體，隨后一段時(shí)間在Calu-3細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到蛋白表達(dá)，表明納米顆粒逃離內(nèi)體。

Jiang等[27]用富含胺的熒光碳納米粒子(FCNs)，攜帶能夠減少polo樣激素(polo-like Kinase 1,Plk1)表達(dá)的小干擾RNA(siPlk1)，制備得到帶有Plk1調(diào)節(jié)基因的碳納米粒子-基因復(fù)合物(C-siPlk1)，用于癌癥治療。研究者用熒光染料Cy5(紅色熒光)對(duì)C-siPlk1進(jìn)行標(biāo)記，得到C-Cy5 siPlk1；在37 ℃下將人類黑色素瘤A375細(xì)胞與Lysotracker(綠色熒光)共孵育2 h，熒光標(biāo)記內(nèi)體；隨后將含Lysotracker探針的A375細(xì)胞與C-Cy5 siPlk1在37 ℃下共孵育1 h。通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)觀察發(fā)現(xiàn)，A375細(xì)胞與C-Cy5 siPlk1共孵育后，細(xì)胞能夠?qū)-Cy5 siPlk1持續(xù)攝取；在3～6 h內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Cy5的紅色熒光與Lysotracker的綠色熒光共定位，表明C-Cy5 siPlk1被內(nèi)體攝取；進(jìn)一步孵育9 h后，紅色熒光與綠色熒光逐漸分離，表明C-Cy5 siPlk1開(kāi)始內(nèi)體中成功逃逸，12 h后，僅有少數(shù)C-Cy5 siPlk1未從內(nèi)體逃逸(圖5)。

圖5 Cy5標(biāo)記的siPlk1在A375細(xì)胞中的內(nèi)體逃逸，用激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察12 h,紅箭頭顯示為完成逃逸的siPlk1,黃色箭頭為未逃逸的siPlk1[27]Fig.5 Cellular endosome/lysosome escape of C-Cy5 siPlk1 in A375 cells.The medium was replaced with optimen reduced serum medium and observed by CLSM for 12 h. The red arrows indicate the escaped siPlk1, while the yellow one indicates the encapsulated siPlk1 in endosome/lysosome[27]

PEI作為目前藥物遞送研究最成功的聚陽(yáng)離子之一，能夠大大提高轉(zhuǎn)染效率，但其質(zhì)子化作用越強(qiáng)，其細(xì)胞毒性也隨著增大[28, 29]。因此，研究者們通過(guò)在聚合物上引入聚乙二醇(PEG)、聚氧胺等非離子親水基團(tuán)或直接添加陰離子來(lái)屏蔽陽(yáng)離子電荷，或通過(guò)交聯(lián)可降解基團(tuán)等，減少其對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞作用，降低細(xì)胞毒性[30]。Guan等[31]設(shè)計(jì)合成醛基修飾的PEG，對(duì)PEI/DNA復(fù)合物的正電荷進(jìn)行屏蔽化；復(fù)合物進(jìn)入微酸性腫瘤區(qū)，在席夫堿鍵的pH響應(yīng)下，PEG脫落，發(fā)揮PEI的高效轉(zhuǎn)染作用。研究表明，在pH 7.4條件下，PEI/DNA復(fù)合物的細(xì)胞存活率為83.2%，經(jīng)過(guò)PEG屏蔽化后，細(xì)胞毒性明顯減輕。PEG屏蔽化作用在提高穩(wěn)定性和實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)的同時(shí)，降低了PEI的細(xì)胞毒性。Wang等[32]設(shè)計(jì)具有負(fù)電荷和疏水基團(tuán)的樹(shù)突狀PEG端粒大分子包封蛋白質(zhì)-PEI復(fù)合物，最大限度減少聚陽(yáng)離子誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，同時(shí)端粒分子屏蔽層在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)傳遞過(guò)程中能夠與納米復(fù)合物分離，恢復(fù)高轉(zhuǎn)染特性。另有研究者將陰離子聚合物硫酸葡聚糖(DS)引入PEI/DNA復(fù)合物，得到粒徑200 nm、分散系數(shù)0.2的復(fù)合物微粒，隨著DS用量的增大，毒性降低[33]。

3.1.2 咪唑類聚合物

咪唑是分子結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)間位氮原子的五元芳雜環(huán)化合物。咪唑基在pH小于6時(shí)，會(huì)被質(zhì)子化[34]。由于內(nèi)體的內(nèi)環(huán)境pH較低，咪唑基團(tuán)具有很好的質(zhì)子化介導(dǎo)作用，促使“質(zhì)子海綿效應(yīng)”的發(fā)生。與胺類聚合物相比，聚組氨酸或聚咪唑類載體的轉(zhuǎn)染效率要更高，這可能與咪唑基能破壞內(nèi)體膜的融合活性有關(guān)[35]。

Zhang等[36]合成了mPEG-PLA-Phis共聚物膠束，使用吖啶橙定位測(cè)定和鈣黃綠素?cái)z取研究共聚物對(duì)內(nèi)體膜的破壞作用。細(xì)胞核和內(nèi)體分別用Hoechst33258(藍(lán)色)和Lyso Tracker DND-26(綠色)標(biāo)記。負(fù)載阿霉素(DOX)的基于Phis的共聚物膠束被MCF-7細(xì)胞快速吸收，并在15 min后封裝于內(nèi)體內(nèi)。隨孵化時(shí)間增加，在細(xì)胞中橙色熒光(Lyso Tracker和DOX的重疊)增強(qiáng)，表明膠束在內(nèi)體中聯(lián)系積累。4 h后，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈的紫色熒光(DOX與Hoechst重疊)，表明DOX從內(nèi)體逃逸到細(xì)胞核中。

聚(4-乙烯基咪唑)(poly(4-vinylimidazole)，P4V)分子結(jié)構(gòu)中含有大量咪唑環(huán)，在酸性條件下可接受質(zhì)子，具有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”。Jong等[37]研究了P4V作為非病毒基因遞送載體，研究表明，P4V結(jié)合DNA在進(jìn)入內(nèi)體的酸性環(huán)境后會(huì)發(fā)生電荷的反轉(zhuǎn)，發(fā)生質(zhì)子化作用，與PEI作用機(jī)理類似，可實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸。

3.2 多肽的融合

部分兩性分子多肽中含有酸性氨基酸，如谷氨酸，其帶有負(fù)電荷的羧基在中性條件下破壞多肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而在酸性環(huán)境中，促進(jìn)親水親油的兩性螺旋結(jié)構(gòu)的形成，通過(guò)與內(nèi)體內(nèi)膜的融合破壞內(nèi)體。攜帶此種多肽序列的載體具有很強(qiáng)的內(nèi)體逃逸能力[38]。蜂毒肽、聚精氨酸等堿性多肽能夠在酸性環(huán)境中形成α-螺旋，此類構(gòu)象的轉(zhuǎn)變能夠提高多肽與膜結(jié)構(gòu)的親和性。目前用于加強(qiáng)載體內(nèi)體逃逸能力的多肽有蜂毒肽、KALA、GALA[39-41]等。

Yeom等[42]將KALA多肽與PEG綴合以防止PEI-DNA復(fù)合物自聚集，通過(guò)該配方得到穩(wěn)定的PEI/KALA-PEG復(fù)合物。以PEI為參照，通過(guò)熒光素標(biāo)記的寡核苷酸和C3細(xì)胞中的Cy3標(biāo)記的質(zhì)粒DNA，研究了PEI/KALA的內(nèi)體逃逸能力，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染24 h后，使用PEI/KALA的一組，細(xì)胞內(nèi)的熒光復(fù)合物明顯高于PEI，且熒光染色是在核內(nèi)而非核外。這表明，KALA的加入明顯增強(qiáng)PEI的質(zhì)子化介導(dǎo)作用，增強(qiáng)載體內(nèi)體逃逸能力。

Yu及其研究小組[43]得到二硫鍵修飾的富含樹(shù)枝狀精氨酸的陽(yáng)離子肽?；驈?fù)合物可用熒光染料Cy5標(biāo)記，熒光照射下顯紅色，而酸性內(nèi)體可被LysoSensor Yellow/Blue DND-160染成綠色。研究表明(圖6)，與PEI相比，

圖6 Cy5標(biāo)記的基因復(fù)合物在孵育2 h和4 h后內(nèi)體逃逸情況：(1)Cy5通道，(2)LysoSensor Yellow/Blue DND-160通道，(3)通道合并，(4)局部視野放大[43]Fig.6 Images of endosomal disruption of gene complexes containing Cy5-labeled plasmid (red) in cells with LysoSensor Yellow/Blue DND-160 (green) after 2 and 4 h incubation: Cy5 channel (1), LysoSensorYellow/Blue DND-160 channel (2), overlay (3) and enlarged view (4)[43]

脂質(zhì)-基因復(fù)合物組(RLS及RL)在轉(zhuǎn)染2 h，熒光即顯色為黃色熒光(紅色與綠色疊加)，表明進(jìn)入內(nèi)體環(huán)境；在轉(zhuǎn)染4 h時(shí)，PEI組出現(xiàn)黃色熒光斑點(diǎn)，表明PEI組也被內(nèi)體吞噬，而此時(shí)的脂質(zhì)-基因復(fù)合物組的有些熒光已經(jīng)開(kāi)始變?yōu)槌壬蚣t色，這表明紅色熒光量增加，證明更多的基因復(fù)合物逃離了內(nèi)體環(huán)境，同時(shí)也表明，精氨酸多肽的逃逸效率較PEI明顯增加。

Kalina等[44]設(shè)計(jì)了pH觸發(fā)的成孔肽，他們從pH不敏感的成孔肽MelP5序列的18 432個(gè)組合文庫(kù)中進(jìn)行高通量篩選，確定了兩性螺旋極性表面的5個(gè)氨基酸殘基，其在pH=7處為帶電、可溶狀態(tài)，在pH=5下與膜結(jié)合，螺旋成孔，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)體逃逸。

3.3 添加光化學(xué)誘導(dǎo)劑

采用光化學(xué)方法，使生物載體從內(nèi)體通路釋放到包漿的手段，現(xiàn)已被廣泛研究[45]。許多光敏劑，包括TPPS4、TPPS2a、AIPcS2a和基于樹(shù)枝狀大分子的光敏劑(DP)主要定位在內(nèi)體的膜表面，暴露于光下后，這些光敏劑會(huì)引起ROS的形成，短時(shí)間內(nèi)破壞內(nèi)體膜，而細(xì)胞內(nèi)容物仍能保持完整并被遞送至細(xì)胞質(zhì)中[7, 46]。

Yuan等[47]報(bào)道了具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)特征的光敏劑(PS)與胺基丙烯酸酯(AA)結(jié)合在光存在下，會(huì)產(chǎn)生ROS。通過(guò)共焦激光掃描電鏡評(píng)估復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)特征，用吖啶橙為指標(biāo)對(duì)ROS誘導(dǎo)的內(nèi)體損壞進(jìn)行評(píng)價(jià)，研究表明，Hela細(xì)胞在沒(méi)有ROS參與下，呈紅色熒光(內(nèi)體)和綠色熒光(細(xì)胞器細(xì)胞核)，而將其置于光照射下，紅色熒光顯著降低，表明內(nèi)體被破壞，在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到Y(jié)OYO-1標(biāo)記的DNA，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)體逃逸(圖7)。

圖7 ROS響應(yīng)性納米顆粒的轉(zhuǎn)基因表達(dá)及內(nèi)體逃逸過(guò)程[47]Fig.7 The transgene expression and endosomal escape of ROS-responsive nanoparticles[47]

Kun等[48]也報(bào)道了負(fù)載DOX和光誘導(dǎo)劑的聚合物膠束(D-LRPM)，用熒光分別標(biāo)記內(nèi)體和細(xì)胞核，有光照射下內(nèi)體熒光強(qiáng)度較無(wú)光照射明顯降低，且DOX在細(xì)胞核處的熒光強(qiáng)度增加，結(jié)果表明，D-LRPM中光誘導(dǎo)劑產(chǎn)生的ROS能夠成功破壞內(nèi)體膜，將包載物釋放至細(xì)胞質(zhì)中。

在研究過(guò)程中，PCI技術(shù)僅通過(guò)光強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)，無(wú)光區(qū)域不會(huì)受到損失，進(jìn)一步降低風(fēng)險(xiǎn)，是一種有效可控的逃逸方式[20]。

3.4 pH敏感材料的結(jié)合

pH敏感型材料是一類能夠響應(yīng)所在環(huán)境pH值的微小變化，其分子結(jié)構(gòu)和物理性能發(fā)生一定變化的新型材料。在機(jī)體病變細(xì)胞，以腫瘤細(xì)胞為例，腫瘤微環(huán)境具有低O2、pH降低、間質(zhì)高壓、血管高滲透性等特點(diǎn)，生理狀態(tài)下，正常組織細(xì)胞外pH介于7.2～7.4，而惡性腫瘤細(xì)胞外pH介于6.5～6.9之間[49]。通過(guò)在藥物載體上引入pH敏感型材料，使其僅在靶點(diǎn)特定pH條件下完成藥物釋放，既實(shí)現(xiàn)了內(nèi)體逃逸，又能使藥物在靶點(diǎn)處有效釋放。ZnO納米顆粒在生理?xiàng)l件下(pH 7.4)保持良好的穩(wěn)定性，但在pH 5～6左右能夠快速分解[50]。Zhang等[51]利用這一特性，合成具有pH敏感特性的ZnO-MSNs，達(dá)到內(nèi)體逃逸效果，實(shí)現(xiàn)藥物釋放的可控性。Ma等[52]將半乳糖、葡聚糖與視黃醛進(jìn)行綴合，得到GDR綴合物，分別研究了pH為5.0，6.5和7的PBS緩沖液中GDR納米凝膠的流體動(dòng)力學(xué)尺寸。研究表明，其在pH=7.4下，粒徑保持不變；在pH=6.5下，粒徑有所增加；在pH=5.0時(shí)，粒徑增大為中性條件下的3倍，具有明顯的pH敏感效應(yīng)。通過(guò)熒光標(biāo)記示蹤可知，孵育6 h后，包載疫苗的GDR與內(nèi)體共定位，并觀察到有超過(guò)50%的內(nèi)含物從內(nèi)體中解離出來(lái)，實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸。研究推測(cè)，腙鍵的裂解消耗大量質(zhì)子，從而增加了質(zhì)子、氯離子和水的流入，從而引起內(nèi)體溶脹和損傷。

3.5 脂質(zhì)材料

二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)及其衍生物在環(huán)境中會(huì)發(fā)生相變，繼而破壞內(nèi)體膜，相關(guān)研究表明，磷脂酰乙醇胺連接不同種類的不飽和脂肪烴鏈在生理?xiàng)l件下為負(fù)電性，復(fù)合物表現(xiàn)為層狀，在pH下降時(shí)，PE質(zhì)子化使得復(fù)合物變?yōu)榱切蝃53]。六角形的復(fù)合物對(duì)膜具有較大的破壞性，能完成內(nèi)體逃逸。Safinya課題組[54]使用小角度X射線散射加速器將二油酰三甲基銨丙烷(DOTAP)-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的結(jié)構(gòu)與其轉(zhuǎn)染效率相關(guān)聯(lián)，DOPE被發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)DNA-脂質(zhì)復(fù)合物從多層結(jié)構(gòu)向個(gè)倒六角液晶相的轉(zhuǎn)變。反向六邊形結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)與陰離子膜之間的相互作用，導(dǎo)致膜融合和DNA釋放。

4 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，一系列具有良好的生物相容性、組織滲透性、高靶向性、無(wú)毒、易吸收的納米載體得到了廣泛的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，但內(nèi)體屏障的存在也限制了納米藥物的發(fā)展。目前，通過(guò)膜融合或形成膜孔的形式實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸的多肽、蛋白類材料逃逸效率高但具有一定免疫原性；而聚合物類逃逸材料在胞內(nèi)仍存在一定毒性；利用仿生粒子實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，一定程度避免免疫原性，又無(wú)細(xì)胞毒性，但其不具有普遍作用性，仍難以得到實(shí)際應(yīng)用。

在現(xiàn)有載體材料基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)內(nèi)體逃逸機(jī)制的進(jìn)一步了解，將會(huì)推動(dòng)藥物載體的發(fā)展和應(yīng)用。相信隨著對(duì)藥物載體在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝及內(nèi)體免疫等機(jī)理的進(jìn)一步揭示及新型藥物載體的開(kāi)發(fā)，內(nèi)體逃逸劑將會(huì)有更為廣闊的發(fā)展空間。