吳秀秀,蔣 順,于 峰,曹建中,汪 龍,*

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410004;2.湖南大學(xué)生物學(xué)院,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410082)

類受體蛋白激酶FERONIA(FER)是CrRLK1-L亞家族的成員之一,能夠調(diào)控?cái)M南芥生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)方面[1],為近年來植物研究領(lǐng)域的“明星分子”。FER最早被發(fā)現(xiàn)參與擬南芥花粉管發(fā)育,在擬南芥fer突變體中,花粉管的生長(zhǎng)不能停止且不將其內(nèi)容物遞送到胚囊中,使雙受精過程受到影響[2]。FER主要參與的功能有調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)[3～4]、免疫反應(yīng)[5～6]、響應(yīng) ABA(abscisic acid)反應(yīng)[7～9]、參與JA(jasmonic acid)信號(hào)調(diào)控[10]等。水稻中有16個(gè)具有完整胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)域的類受體蛋白激酶FERONIA-like receptor(FLR)家族成員,其中與擬南芥FER同源性最高的成員為FLR1。目前發(fā)現(xiàn)FLR1能夠通過赤霉素途徑來影響水稻株高[11],同時(shí)參與調(diào)節(jié)花粉育性[11～12]。鑒于類受體蛋白激酶FLR在水稻中的研究處于起步階段,我們將FLR1基因的胞外(FLR1-BW)和胞內(nèi)(FLR1-BN)結(jié)構(gòu)域分段克隆到不同的蛋白質(zhì)表達(dá)載體上,比較其表達(dá)情況,并通過對(duì)誘導(dǎo)條件的篩選,選出最優(yōu)的蛋白質(zhì)表達(dá)及純化策略,以期獲得較高濃度及純度的FLR1的N端和C端蛋白質(zhì),以便用于抗體制備及后續(xù)功能研究。本研究為類受體激酶的蛋白質(zhì)純化和抗體制備提供了思路,也為后續(xù)機(jī)制探索提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

植物材料日本晴以及原核表達(dá)載體pET-32a、pGEX-4T-1、pET-22b 由湖南大學(xué)生物學(xué)院提供;pTriEx-4表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌菌株DH5α和BL21(DE3)購(gòu)自湖南擎科生物技術(shù)有限公司;293細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;SPF級(jí)雄性SD大鼠(250～270 g)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所提供。

1.1.2 主要設(shè)備

T100TMThermal Cycler PCR儀、凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司);酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司);JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);渦旋振蕩器(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司);暗箱紫外三用紫外分析儀(上海越眾儀器設(shè)備有限公司);電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ-HF、EcoRⅠ-HF、SalⅠ、NcoⅠ、XhoⅠ購(gòu)自 New England BioLabs公司(美國(guó));2×Taq Master Mix購(gòu)自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司;dNTP、2× Phanta Max Buffer、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、ExnaseⅡ、5× CEⅡbuffer購(gòu)自諾唯贊生物有限公司;蛋白質(zhì)marker購(gòu)自 Thermo Scientific公司(美國(guó));DNA marker、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司;Ni-NTA柱購(gòu)自徐州溥博生物科技有限公司。GST單克隆抗體(CSBMA000031M0m)購(gòu)自華美生物工程有限公司;Anti-6×His Rabbit多克隆抗體(D110002-0100)、HRP-conjugated Goat Anti-mouse IgG(D110087-0025)購(gòu)自BBI Life Sciences Corporation;HRP-conjugated Goat Anti-rabbit IgG(HS101-01)購(gòu)自Transgen Biotech 公司;ECL(enhanced chemiluminescence)購(gòu)自Bio-Rad公司(美國(guó));DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司(美國(guó));FBS(fetal bovine serum)購(gòu)自 BI公司(以色列);PS(penicillin-streptomycin)、trypsin、OPTIMEM購(gòu)自Gibco公司(美國(guó));protease inhibitors cocktail(410044)購(gòu)自Bimake公司(美國(guó));完全佐劑(1002260171)、不完全佐劑(1002679386)購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))。引物合成及測(cè)序均由擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息分析

進(jìn)化樹分析：通過BLAST找出水稻FLR家族成員,整合其蛋白質(zhì)序列,將蛋白質(zhì)序列文件存為.fasta格式,導(dǎo)入MEGA 7軟件進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析,得到進(jìn)化樹雛形,保存為.nwk格式,隨后于FigTree v1.4.3軟件中對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行修飾,即得出進(jìn)化樹分析結(jié)果。

蛋白質(zhì)序列比對(duì)：利用DNAMAN 8.0比對(duì)FER及其同源性較高的FLR,并采用BioEdit 7.0軟件進(jìn)行圖片美化。

結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)：從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得FLR1(LOC_Os03g21540.1)基因序列,利用TMHMM Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)FLR1胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 載體構(gòu)建

采用酶切連接法或Infusion連接法設(shè)計(jì)相應(yīng)引物(表1)。以野生型水稻日本晴幼苗提取的DNA為模板,PCR擴(kuò)增目的片段,將PCR產(chǎn)物用Infusion或酶切連接法連接到相應(yīng)載體上,熱擊轉(zhuǎn)化入宿主菌DH5α,挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)后,用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)及雙酶切檢測(cè),將檢測(cè)結(jié)果為陽性的重組質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 重組融合蛋白質(zhì)的表達(dá)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)：將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21(DE3),挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基,37℃、150 r/min培養(yǎng)過夜,分別吸取10 μL(摸索表達(dá)條件時(shí)取10 μL,確定條件后大量表達(dá)時(shí)取1 mL)菌液接種于5 mL(大量表達(dá)時(shí)50 mL)LB/AMP液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí)取誘導(dǎo)前菌液200 μL(大量表達(dá)時(shí)取1 mL)用于后續(xù)檢測(cè)。加入0.5 mmol/L IPTG,然后分別于不同溫度和時(shí)間(16℃/16 h、28℃/8 h、37℃/4 h)條件下振蕩培養(yǎng),再取誘導(dǎo)后的菌液200 μL(大量表達(dá)時(shí)取 1 mL)用于 SDS-PAGE檢測(cè)。選取最優(yōu)溫度和時(shí)間后,摸索不同IPTG濃度(0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L)對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。

動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(6孔板)：取9 μL Lipofectamine 2000于150 μL OPTI-MEM中稀釋,另取3.5 μg質(zhì)粒 DNA 于 175 μL OPTI-MEM 中稀釋,然后將兩者按1︰1比例各取150 μL混合制成轉(zhuǎn)染液,室溫孵育 5 min。每孔取(0.25～1)×106個(gè)293細(xì)胞接種于2 mL不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基中,同時(shí)加入250 μL孵育后的轉(zhuǎn)染液,輕輕搖勻,37℃培養(yǎng)4～6 h后更換為完全培養(yǎng)基,1～3 d后在冰上或4℃裂解細(xì)胞[取適當(dāng)量的裂解液,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入最終濃度為1 mmol/L的苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)和protease inhibitors cocktail備用,而后去除細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS洗一遍,每孔加入150～250 μL現(xiàn)配的RIPA裂解液,使裂解液和細(xì)胞充分接觸],10 000～14 000 g離心 3～5 min,取上清,隨后即可進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western-blot等檢測(cè)。

SDS-PAGE檢測(cè)：誘導(dǎo)前后200 μL(或1 mL)菌液離心去上清,隨后加入10 μL(或15 μL)ddH2O重懸菌體,再加入 15 μL(或 20 μL)2× SDS loading buffer混勻,95℃加熱10 min(至樣品不黏稠)。采用10%SDS-PAGE膠進(jìn)行檢測(cè),每孔上樣10 μL,設(shè)置電壓70 V過濃縮膠后改為90 V電泳至溴酚藍(lán)指示劑到膠底部附近即可停止。

Western-blot檢測(cè)：將蛋白質(zhì)上清經(jīng)SDSPAGE電泳后恒流轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,然后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,棄封閉液,一抗(His-tag/GST-tag)室溫孵育1 h(或4℃過夜),TBST洗膜3次,二抗(羊抗鼠IgG,HRP)室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,TBS洗膜1次后顯影。

1.2.4 蛋白質(zhì)的純化及檢測(cè)

表1 FLR1胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)域連在不同載體上的引物信息及構(gòu)建方法Table 1 Primer sequences and cloning methods used in this study

按已優(yōu)化的條件大量(50 mL)表達(dá)蛋白質(zhì),在離心下來的菌體中加5 mL PBS清洗,離心去上清,再加入7 mL lysis buffer(His標(biāo)簽蛋白質(zhì)：50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L 咪唑,GST標(biāo)簽蛋白質(zhì)：50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、150 mmol/L NaCl)、0.1 mmol/L PMSF、0.1 mmol/L溶菌酶重懸;25%功率下超聲20 min(開5 s、停10 s)后,4℃條件下3 900 r/min離心10 min,收集上清至10 mL管;取300 μL鎳珠/GST珠子,用lysis buffer清洗3次后轉(zhuǎn)入10 mL管,4℃結(jié)合過夜;4℃條件下1 000 r/min離心5 min后去上清,加3 mL wash buffer 1(His標(biāo)簽蛋白質(zhì)：50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑,GST標(biāo)簽蛋白質(zhì)：50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、0.5%Triton X-100)洗滌珠子兩次,每次 15 min;離心去上清,加3 mL wash buffer 2(His標(biāo)簽蛋白質(zhì)：50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑,GST標(biāo)簽蛋白質(zhì)：50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、200 mmol/L NaCl)洗滌珠子兩次,每次15 min;離心去上清,加3 mL wash buffer 3(His標(biāo)簽蛋白質(zhì)：50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、100 mmol/L咪唑)洗滌珠子一次,每次15 min;離心去上清,加300 μL elution buffer(His標(biāo)簽蛋白質(zhì)：50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、200 mmol/L 咪唑,GST標(biāo)簽蛋白質(zhì)：50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、20 mmol/L GSH)洗3～4 h,離心后上清液即含目的蛋白質(zhì)。取部分上清進(jìn)行10%SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè),剩余樣品凍于-80℃。

1.2.5 抗體的制備及驗(yàn)證

準(zhǔn)備高濃度和高純度的目的蛋白質(zhì),分3次(每次約150 μg蛋白質(zhì))腹腔注射免疫大鼠。初次免疫采用完全佐劑乳化蛋白質(zhì),之后每隔一周用不完全佐劑乳化蛋白質(zhì)分別進(jìn)行第二、三次免疫。然后從大鼠眼周取血檢測(cè)抗體效價(jià),達(dá)標(biāo)后對(duì)大鼠進(jìn)行終放血,12 000 r/min離心后取血清凍于-80℃。

將制備的抗體分別與GST-FLR1-BW蛋白和從日本晴水稻的根、莖、葉提取的內(nèi)源蛋白質(zhì)樣品(取適量水稻根、莖、葉于1.5 mL EP管,加液氮充分研磨后每管加100～200 μL RIPA裂解液混勻,冰上放置30 min,每管加SDS loading buffer于95℃加熱10 min,12 000 r/min離心10 min,上清即含內(nèi)源目的蛋白質(zhì))進(jìn)行雜交,通過Western-blot檢測(cè)抗體效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息分析

為了探究FER和FLR家族的同源性,我們構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹,由系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出：FER與FLR1、LOC_Os01g56330.1在同一個(gè)分支上,說明這3個(gè)蛋白質(zhì)的親緣關(guān)系更近(圖1A)。將這3個(gè)蛋白質(zhì)的序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果如圖1B所示：紅色區(qū)域是相同序列,藍(lán)色區(qū)域是相似序列。綜合比對(duì)紅色區(qū)域和藍(lán)色區(qū)域可得出FLR1與FER高度同源,故在水稻材料中,我們選取了FLR1蛋白進(jìn)行研究,并預(yù)測(cè)繪制了FLR1蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖(圖 1C)。

2.2 載體構(gòu)建

分別將目的片段PCR克隆后連在pET-32a、pGEX-4T-1、pET-22b載體上(FLR1-BN另連p-TriEx-4載體),連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,每個(gè)樣品挑單菌落做PCR及酶切鑒定。結(jié)果顯示：菌落PCR出現(xiàn)陽性,雙酶切也切出了相應(yīng)的載體片段和目的片段。此外,由于FLR1-BW中含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn),所以FLR1-BW-pET-32a和FLR1-BW-pET-22b分別切出了兩條目的帶(871 bp、501 bp,845 bp、502 bp),這與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。上述結(jié)果表明7個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。同時(shí),測(cè)序結(jié)果顯示序列均無誤,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

2.3.1 溫度條件優(yōu)化

將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3),并在LB平板上挑選單個(gè)菌落于LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),然后在37℃下加入0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果表明FLR1-BW可以表達(dá),而FLR1-BN沒有表達(dá)。為了探明表達(dá)的最優(yōu)條件,將FLR1-BN和FLR1-BW分別置于16℃/16 h、28℃/8 h和37℃/4 h條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果顯示：3個(gè)FLR1-BN 蛋白(分別對(duì)應(yīng) pET-32a、pGEX-4T-1、pET-22b表達(dá)載體)與1個(gè)FLR1-BW蛋白(pET-22b表達(dá)載體)均未誘導(dǎo)成功。通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3個(gè)未表達(dá)的FLR1-BN會(huì)對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生毒性(圖3A),而FLR1-BN(pTriEx-4表達(dá)載體)在293細(xì)胞中能夠表達(dá)。此外,兩個(gè)FLR1-BW蛋白(分別對(duì)應(yīng)pET-32a、pGEX-4T-1表達(dá)載體)于16℃、28℃、37℃都能成功表達(dá),其中FLR1-BW-His蛋白(pET-32a表達(dá)載體)于16℃表達(dá)量最大;GSTFLR1-BW蛋白(pGEX-4T-1表達(dá)載體)在3個(gè)不同溫度/時(shí)間下表達(dá)效果差別不明顯,因此后續(xù)選擇16℃/16 h表達(dá)這兩個(gè)蛋白質(zhì)(圖3B、3C)。

2.3.2 IPTG濃度優(yōu)化

圖1 生物信息分析(A)擬南芥FER與水稻FLR家族的進(jìn)化樹分析;(B)FER和同源性較高的FLR蛋白的序列比對(duì);(C)FLR1蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖。序列相似程度：紅色＞藍(lán)色＞灰色。Fig.1 Biological information analysis(A)Phylogenetic tree of AtFER and OsFLR family;(B)Sequence alignment of FER and high-homology FLR;(C)Schematic diagram of FLR1 protein structure.Degree of sequence similarity：Red＞blue＞gray.

選擇最佳溫度/時(shí)間后,設(shè)置不同IPTG濃度(0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá) FLR1-BW-His(pET-32a表達(dá)載體)和GST-FLR1-BW(pGEX-4T-1表達(dá)載體),結(jié)果顯示：不同IPTG濃度對(duì)這兩個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)效果影響不大(圖4)。綜合考慮成本和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?我們擇優(yōu)選取0.5 mmol/L IPTG進(jìn)行后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)。

圖2 目的片段PCR克隆及重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果(A)FLR1-BN、FLR1-BW連接pET-32a載體后的PCR結(jié)果;(B)FLR1-BN、FLR1-BW連接pGEX-4T-1載體后的PCR結(jié)果;(C)FLR1-BN、FLR1-BW連接pET-22b載體后的PCR結(jié)果;(D)FLR1-BN連接pTriEx-4載體后的PCR結(jié)果;(E)FLR1-BN-pET-32a和FLR1-BW-pET-32a的酶切圖;(F)FLR1-BN-pGEX-4T-1和FLR1-BW-pGEX-4T-1的酶切圖;(G)FLR1-BN-pET-22b和FLR1-BW-pET-22b的酶切圖;(H)FLR1-BN-pTriEx-4的酶切圖。M泳道均為marker 3。Fig.2 PCR cloning of the inserts and double restriction enzyme digestion of the recombinant plasmids(A)PCR results of FLR1-BN and FLR1-BW(cloned in pET-32a);(B)PCR results of FLR1-BN and FLR1-BW(cloned in pGEX-4T-1);(C)PCR results of FLR1-BN and FLR1-BW(cloned in pET-22b);(D)PCR result of FLR1-BN(cloned in pTriEx-4);(E)Digestion of FLR1-BN-pET-32a and FLR1-BW-pET-32a;(F)Digestion of FLR1-BN-pGEX-4T-1 and FLR1-BW-pGEX-4T-1;(G)Digestion of FLR1-BN-pET-22b and FLR1-BW-pET-22b;(H)Digestion of FLR1-BN-pTriEx-4.Lane M in the(A)～(H)is marker 3.

圖3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與不同溫度和時(shí)間誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的結(jié)果(A)將FLR1-BN-pTriEx-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α,涂布于加有AMP和(AMP+IPTG)的平板中測(cè)試其細(xì)胞毒性;(B)FLR1-BW-His蛋白(pET-32a載體)在16℃/16 h、28℃/8 h、37℃/4 h條件下的表達(dá)結(jié)果。M：蛋白質(zhì)marker 26614;(C)GST-FLR1-BW蛋白(pGEX-4T-1表達(dá)載體)在16℃/16 h、28℃/8 h、37℃/4 h條件下的表達(dá)結(jié)果。M：蛋白質(zhì)marker 26614。Fig.3 Cytotoxicity test and protein expression at different temperatures and induction times(A)FLR1-BN-pTriEx-4 was transformed into DH5α and the bacterial cells were incubated on AMP and(AMP+IPTG)plates to test its toxicity to cells;(B)Expression of FLR1-BW-His(pET-32a vector)under conditions of 16℃/16 h,28℃/8 h and 37℃/4 h,respectively.M：Protein marker 26614;(C)Expression of GST-FLR1-BW(pGEX-4T-1 vector)under conditions of 16℃/16 h,28℃/8 h and 37℃/4 h,respectively.M：Protein marker 26614.

2.4 蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化

將含有目的蛋白質(zhì)的上清液與鎳珠(GSH瓊脂糖珠)結(jié)合并最終用200 mmol/L的咪唑(20 mmol/L GSH)進(jìn)行洗脫,通過10%SDS-PAGE電泳及Western-blot檢測(cè),結(jié)果顯示：FLR1-BW-His(pET-32a表達(dá)載體)和GST-FLR1-BW成功純化,得到了濃度及純度均較好的蛋白質(zhì)(圖5A、5C)。同時(shí),FLR1-BN-His(pTriEx-4表達(dá)載體)通過轉(zhuǎn)染到動(dòng)物細(xì)胞293中也實(shí)現(xiàn)了成功表達(dá)(圖5B)。

圖4 不同IPTG濃度誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的結(jié)果(A)FLR1-BW-His(pET-32a載體)在0.5/1/2 mmol/L IPTG條件下的表達(dá)結(jié)果。M：蛋白質(zhì)marker 26614;(B)GST-FLR1-BW在0.5/1/2 mmol/L IPTG條件下的表達(dá)結(jié)果。M：蛋白質(zhì)marker 26614。Fig.4 Protein expression with different IPTG concentrations(A)Expression of FLR1-BW-His(pET-32a vector)at 0.5/1/2 mmol/L IPTG.M：Protein marker 26614;(B)Expression of GSTFLR1-BW at 0.5/1/2 mmol/L IPTG.M：Protein marker 26614.

圖5 蛋白質(zhì)表達(dá)純化的檢測(cè)結(jié)果(A)FLR1-BW-His純化后的考馬斯亮藍(lán)染色(M：蛋白質(zhì)marker 26614)及Western-blot檢測(cè)(His抗體1︰5 000稀釋,M：蛋白質(zhì)預(yù)染marker 26616)。FT：FLR1-BW-His未純化上清;W1-1：用wash buffer 1洗滌第一次的上清;W1-2：用wash buffer 1洗滌第二次的上清;W2-1：用wash buffer 2洗滌第一次的上清;W2-2：用wash buffer 2洗滌第二次的上清;W3：用wash buffer 3洗滌的上清;(B)293細(xì)胞表達(dá)FLR1-BN-His的Western-blot檢測(cè)(His抗體1︰5 000稀釋)。M：蛋白質(zhì)預(yù)染marker 26616,Control：293細(xì)胞的總蛋白質(zhì);(C)GST-FLR1-BW純化后的考馬斯亮藍(lán)染色(M：蛋白質(zhì)marker 26614)及Western-blot檢測(cè)(GST抗體1︰5 000稀釋,M：蛋白質(zhì)預(yù)染marker 26616）。FT：GST-FLR1-BW未純化上清;W1-1：用wash buffer 1洗滌第一次的上清;W1-2：用wash buffer 1洗滌第二次的上清;W2-1：用wash buffer 2洗滌第一次的上清;W2-2：用wash buffer 2洗滌第二次的上清。Fig.5 Protein expression and purification(A)Coomassie brilliant blue staining(lane M is protein marker 26614)and Western-blot identification(anti-His 1︰5 000,lane M is protein marker 26616)of FLR1-BW-His after purification.FT：The supernatant of unpurified FLR1-BW-His.W1-1：The first time supernatant of washed beads with wash buffer 1.W1-2：The second time supernatant of washed beads with wash buffer 1.W2-1：The first time supernatant of washed beads with wash buffer 2.W2-2：The second time supernatant of washed beads with wash buffer 2.W3：The supernatant of washed beads with wash buffer 3;(B)Western-blot identification of FLR1-BNHis expressed in 293 cells(anti-His 1︰5 000).M：Protein marker 26616.Control：Total proteins of 293 cells;(C)Coomassie brilliant blue staining(lane M is protein marker 26614)and Western-blot identification(anti-GST 1︰5 000,lane M is protein marker 26616)of GST-FLR1-BW after purification.FT：The supernatant of unpurified GST-FLR1-BW.W1-1：The first time supernatant of washed beads with wash buffer 1.W1-2：The second time supernatant of washed beads with wash buffer 1.W2-1：The first time supernatant of washed beads with wash buffer 2.W2-2：The second time supernatant of washed beads with wash buffer 2.

圖6 FLR1抗體的驗(yàn)證結(jié)果按照1︰4 000的效價(jià)來檢測(cè)FLR1抗體識(shí)別純化蛋白質(zhì)(A)和內(nèi)源性蛋白質(zhì)(B)的效果;M均為蛋白質(zhì)預(yù)染marker 26616。Fig.6 Validation of anti-FLR1 antibodyThe purified protein(A)and endogenous proteins(B)were recognized by FLR1 antibody(1︰4 000).Lane M is protein marker 26616.

2.5 抗體驗(yàn)證

大量表達(dá)并純化GST-FLR1-BW以用于制備抗體,得到抗體后利用純化的蛋白質(zhì)和水稻根、莖、葉內(nèi)源蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示：用FLR1多克隆抗體檢測(cè)GST-FLR1-BW蛋白只有單一的條帶,特異性較好,與GST抗體效果相當(dāng)(圖6A);用FLR1多克隆抗體檢測(cè)水稻根、莖、葉內(nèi)源蛋白質(zhì)時(shí),能夠在130 kD附近檢測(cè)到FLR1蛋白(圖6B),表明FLR1多克隆抗體制備成功,可用于后續(xù)FLR1蛋白功能等方面的研究。

3 小結(jié)與討論

FER基因在雙子葉植物擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。單子葉植物水稻中的FER同源基因FLR可能也參與調(diào)控水稻的生長(zhǎng)發(fā)育。文中通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析和序列比對(duì)選取FLR1進(jìn)行研究,以期為后續(xù)探討FLR1在調(diào)控水稻方面的作用奠定基礎(chǔ)。將FLR1分段連接于不同載體后進(jìn)行表達(dá)純化并制備抗體,發(fā)現(xiàn)FLR1-BN-His或GST-FLR1-BN蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)中均未有效表達(dá),這可能是由于胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?qū)儆诩っ腹δ芙Y(jié)構(gòu)域,蛋白質(zhì)表達(dá)后具有一定的細(xì)胞毒性,會(huì)使得大腸桿菌的存活率下降,而換用293細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)則能夠有效地表達(dá)FLR1-BN-His,說明在細(xì)菌難以表達(dá)得到的蛋白質(zhì)可以采用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)作為備選策略。與此同時(shí),構(gòu)建到pET-22b載體上的FLR1-BWHis和FLR1-BN-His蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)中也均未表達(dá)出來,這可能是由于pET-22b載體含有PelB信號(hào)肽序列,會(huì)將表達(dá)的目的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外。與上述蛋白質(zhì)的表達(dá)結(jié)果不同,FLR1-BW-His(構(gòu)于pET-32a載體)或GST-FLR1-BW在100 r/min、16℃/16 h條件下可實(shí)現(xiàn)較好的誘導(dǎo)表達(dá),說明在低溫和較低轉(zhuǎn)速下能夠有效表達(dá)某些受體激酶的胞外結(jié)構(gòu)域。此外,本研究結(jié)果顯示蛋白質(zhì)表達(dá)后能夠純化出較純的目的蛋白質(zhì),說明純化條件適宜。進(jìn)一步的抗體制備也得到了較高質(zhì)量的抗體,說明高濃度及高純度的FLR1蛋白能夠有效地使大鼠免疫,獲得高質(zhì)量的抗體。

水稻和擬南芥分別屬于單子葉植物和雙子葉植物,兩者的形態(tài)結(jié)構(gòu)存在差異。在擬南芥中,已有相關(guān)研究闡明FER的一些重要功能,而水稻中FLR的功能還處于起步階段,因此亟待系統(tǒng)地挖掘FLR的功能。本研究以FLR家族成員的一個(gè)蛋白質(zhì)FLR1為研究目標(biāo),通過分段表達(dá)的策略將FLR1胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了有效的表達(dá),并獲得了高質(zhì)量的抗體,該策略為受體蛋白激酶的蛋白質(zhì)表達(dá)純化及抗體制備提供了參考,也為后續(xù)的深入研究提供了基礎(chǔ)。