謝慧 唐成林 趙丹丹 羅翱 吳夢(mèng)佳 安薈羽 邱麗

1重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院（重慶 400016）

2中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（重慶 400016）

骨骼肌是人體主要的運(yùn)動(dòng)器官，在周圍神經(jīng)的支配下通過肌纖維的收縮和舒張調(diào)控機(jī)體的運(yùn)動(dòng)功能。不論是外部損傷（車禍傷、切割傷、凍傷、燒傷等）還是內(nèi)源性疾病（糖尿病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髓性肌萎縮癥等）[1]均可造成周圍神經(jīng)損傷，而周圍神經(jīng)受損則可導(dǎo)致骨骼肌失去神經(jīng)支配。骨骼肌的這種長(zhǎng)期的失神經(jīng)狀態(tài)會(huì)引起肌容量喪失、肌纖維重構(gòu)、肌衛(wèi)星細(xì)胞減少等病理改變[2，3]，最終造成不可逆的失神經(jīng)性肌萎縮，給患者的日常生活和工作帶來嚴(yán)重影響。然而，目前對(duì)失神經(jīng)肌萎縮發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍十分有限，并且缺少有效的治療方法[4]。肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化水平異常在失神經(jīng)肌萎縮的發(fā)展中扮演著重要角色[5]。肌衛(wèi)星細(xì)胞是骨骼肌的多能干細(xì)胞，對(duì)骨骼肌損傷后的修復(fù)再生起著重要作用。而成肌分化抗原（Myogenic differentiation antigen，Myod1）是肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的標(biāo)志性分子，其表達(dá)的高低受多種因子和信號(hào)通路調(diào)節(jié)。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是長(zhǎng)約20～22 nt的非編碼RNA，具有組織特異性。近年來在對(duì)多種肌肉特異性miRNA[5]的深入研究后發(fā)現(xiàn)，這些非編碼RNA可以參與調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星肌細(xì)胞的增殖、分化，肌細(xì)胞的融合及凋亡等多種生命活動(dòng)，如微小RNA 206（MicroRNA 206，Mir-206）[6]可以通過調(diào)控組蛋白去乙?；?（Histone Deacetylase 4，HDAC4）的表達(dá)促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（Tansforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad3 信號(hào)通路可通過調(diào)控HDAC4的表達(dá)參與肌組織的發(fā)育、修復(fù)和再生等過程[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)電針可能通過促進(jìn)失神經(jīng)大鼠腓腸肌中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（Insulin like growth factor，IGF-1）的表達(dá)，抑制肌肉生長(zhǎng)抑制素（Myostatin）的表達(dá)，從而促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖[8]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)通過予以失神經(jīng)肌萎縮大鼠電針干預(yù)，判斷電針干預(yù)是否能通過調(diào)控TGF-β1/Smad3信號(hào)通路及Mir-206、Myod1和HDAC4的表達(dá)水平，從而影響骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化，減輕骨骼肌細(xì)胞容量和質(zhì)量的喪失，延緩失神經(jīng)肌萎縮的發(fā)展。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量250±50 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。醫(yī)學(xué)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK渝2012-0002。代養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，分籠飼養(yǎng)，室溫22±2℃，相對(duì)濕度50% ±5%，明暗12 h交替，自由飲水、攝食。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（n=8）、模型組（n=8）和電針組（n=8）。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物的處置均符合重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol總RNA提取液、RR037A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Mir-X miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TM II、Myod1、HDAC4、Mir-206、TGF-β1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體 1（Transforming growth factor-β receptor 1，TGF-βr1）、TGF-βr2、Smad3、Smad7和肌動(dòng)蛋白（β-Actin）引物合成（日本TAKARA公司）、漢醫(yī)牌無菌針灸針（北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心）、SDZ-II型電子針治療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司）、柔軟型實(shí)驗(yàn)大鼠固定器（溫州原上草醫(yī)療科技有限公司）、AL204型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）、低溫高速離心機(jī)（德國(guó)西格瑪公司）、Thermo ND2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）、T100TMPCR儀、CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）、BX53普通正置顯微鏡、CellSens Standard圖像采集軟件（日本奧林巴斯公司）、Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件。

1.3 造模方法

通過手術(shù)橫斷坐骨神經(jīng)的造模方法制備大鼠失神經(jīng)性肌萎縮模型[8，9]：予以模型組和電針組大鼠4%水合氯醛（0.8 mL/100 g）腹腔注射麻醉，將大鼠固定后進(jìn)行右側(cè)后肢手術(shù)區(qū)域的備皮，于右側(cè)股后正中行一長(zhǎng)約6～8 mm的手術(shù)切口，顯露股二頭肌，鈍性分離并暴露坐骨神經(jīng)，剪斷坐骨神經(jīng)并制備1.5 cm的缺口，將兩神經(jīng)斷端翻轉(zhuǎn)180°后縫合于鄰近肌組織，之后逐層縫合肌肉和皮膚。假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng)但不行神經(jīng)截?cái)嘈g(shù)。

1.4 針刺方法

造模后電針組大鼠予以柔軟型實(shí)驗(yàn)大鼠固定器固定[10]，并參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]的方法，用0.25 mm×13 mm的一次性無菌針灸針對(duì)其右側(cè)足三里、環(huán)跳穴進(jìn)行2 Hz、1.0 mA連續(xù)波的電針干預(yù)，進(jìn)針5～7 mm，每次10 min，每日1次，每周6次，連續(xù)干預(yù)4周。假手術(shù)組和模型組大鼠每日予以相同方法固定但不予電針干預(yù)。

1.5 檢測(cè)方法觀察指標(biāo)

1.5.1 取材

在第4周干預(yù)結(jié)束后，予以各組大鼠4%水合氯醛（0.8 mL/100 g）腹腔注射麻醉，完整剝離雙側(cè)腓腸肌，吸干其表面殘留液體并稱重；之后將腓腸肌組織分為兩份，一份放入液氮罐中速凍后轉(zhuǎn)移至- 80℃冰箱儲(chǔ)存待測(cè)，另一份置于4%多聚甲醛溶液中固定，待包埋后進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)，取材結(jié)束后處死全部大鼠。

1.5.2 腓腸肌濕重比檢測(cè)

取材時(shí)首先大體觀察腓腸肌的飽滿度。觀察后完整剝離雙側(cè)腓腸肌并置于電子天平上稱取肌濕重，以自身非電針側(cè)作為對(duì)照，計(jì)算各組大鼠的腓腸肌濕重比。肌濕重比=術(shù)側(cè)腓腸肌濕重/非術(shù)側(cè)腓腸肌濕重[12，13]。

1.5.3 腓腸肌纖維橫截面積檢測(cè)

腓腸肌經(jīng) 4%多聚甲醛固定后，經(jīng)酒精梯度脫水、浸蠟、包埋后制備石蠟切片并進(jìn)行HE染色。石蠟包埋、切片及HE染色均由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織切片室完成。每組選取8張不同組織的切片進(jìn)行400倍光學(xué)顯微鏡觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，每個(gè)視野隨機(jī)選取4個(gè)細(xì)胞，經(jīng)Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算各組大鼠腓腸肌纖維橫截面積。

1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PPCCRR法檢測(cè)腓腸肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞相關(guān)分化因子 mmRRNNAA的相對(duì)表達(dá)量

取各組大鼠冰凍保存的腓腸肌組織樣本約50 mg，用Trizol法提取總RNA；檢測(cè)總RNA濃度及純度后按RR037A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Mir-X miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟分別配置普通RNA和MirRNA的反應(yīng)體系，置于T100TMPCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照SYBR Green法配制Mix及反應(yīng)體系后上機(jī)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。通過CFX manager 3.1軟件讀取Ct值。以Folds=2-ΔΔCt表示模型組、電針組與假手術(shù)組目的基因表達(dá)的倍比關(guān)系，公式如下：ΔΔCt=[Ct（target gene）- Ct（β-Actin）]模型組/電針組- [Ct（target gene）-Ct（β-Actin）]假手術(shù)組，重復(fù)8次試驗(yàn)，計(jì)算平均值。上下游引物序列分別如下：

表1 引物序列

（續(xù)表1）

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果均用x±s表示。不同組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，方差齊時(shí)多重組間兩兩比較均采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腓腸肌濕重比

大體觀察可見：與假手術(shù)組相比，模型組、電針組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌飽滿度明顯減低，彈性減弱，色澤欠佳，且呈進(jìn)行性肌萎縮。各組大鼠腓腸肌濕重比結(jié)果如圖1所示，模型組大鼠腓腸肌濕重比低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），電針組腓腸肌濕重比高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示電針干預(yù)能有效延緩腓腸肌質(zhì)量的喪失。

圖1 各組大鼠腓腸肌濕重比比較（n n=8）

2.2 各組腓腸肌形態(tài)學(xué)比較

各組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌病理結(jié)果及肌纖維橫截面積結(jié)果如圖2所示，各組大鼠腓腸肌橫截面結(jié)構(gòu)清晰，顏色及形態(tài)均正常。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌纖維萎縮變小，而纖維間隙擴(kuò)大，且電針組肌纖維橫截面積略大于模型組。各組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌纖維橫截面積結(jié)果比較如圖3所示，模型組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌纖維橫截面積小于假手術(shù)組（P＜0.05），而電針組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌纖維橫截面積大于模型組（P＜0.05），提示電針干預(yù)可有效增加失神經(jīng)萎縮肌纖維的橫截面積。

圖2 各組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌纖維的HE染色結(jié)果

圖3 各組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌纖維橫截面積比較（n n=8）

2.3 各組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞分化相關(guān)因子mRNAmRNA的相對(duì)表達(dá)量

各組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞分化相關(guān)因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如圖4所示：造模后第4周，模型組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌中HDAC4、TGF-β1、TGF-βr1、TGF-βr2、Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），電針組的HDAC4、TGF-β1、TGF-βr1、TGF-βr2、Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組術(shù)側(cè)腓腸肌中Myod1、Mir-206 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于假手術(shù)組（P＜0.05），而電針組腓腸肌中Myod1、Mir-206 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組術(shù)側(cè)腓腸肌中Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于假手術(shù)組（P＜0.05），而電針組的Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這提示電針可能通過抑制 TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，抑制 HDAC4，促進(jìn)Myod1和Mir-206的表達(dá)，促進(jìn)失神經(jīng)肌萎縮大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化。

圖4 各組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞分化相關(guān)因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較（n n=8）

3 討論

失神經(jīng)性肌萎縮是指靶肌肉失去神經(jīng)支配后所發(fā)生的肌纖維變細(xì)甚至消失的病理狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)中通常使用肌濕重比、肌纖維橫截面積的減小[14]判斷肌萎縮的程度。本實(shí)驗(yàn)通過橫斷大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)制備右下肢失神經(jīng)性肌萎縮模型，觀察電針干預(yù)對(duì)大鼠失神經(jīng)肌萎縮的延緩作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電針干預(yù)“足三里”、“環(huán)跳”穴能有效延緩該側(cè)腓腸肌濕重比和纖維橫截面積的下降，提示電針干預(yù)能有效延緩失神經(jīng)肌萎縮。中醫(yī)學(xué)將失神經(jīng)性肌萎縮歸為“痿癥”范疇，并提出“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”的治療大法，針灸對(duì)其療效顯著[15]。足陽(yáng)明胃經(jīng)為五臟六腑之海，有潤(rùn)養(yǎng)宗筋的作用，而宗筋有束骨利關(guān)節(jié)之功，足三里為陽(yáng)明經(jīng)合穴，功善舒筋活絡(luò)、養(yǎng)筋活血，為下肢痿痹之臨床要穴；環(huán)跳為足少陽(yáng)膽經(jīng)穴位，功善疏通經(jīng)絡(luò)、活血止痛，為活絡(luò)下肢氣血之臨床常用穴。本實(shí)驗(yàn)電針干預(yù)足三里、環(huán)跳穴延緩大鼠的失神經(jīng)肌萎縮可能是通過疏通氣血、活絡(luò)宗筋實(shí)現(xiàn)的。

失神經(jīng)肌萎縮的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。研究表明，肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化水平異常是導(dǎo)致失神經(jīng)肌萎縮的重要病理機(jī)制之一[16]。肌衛(wèi)星細(xì)胞[17，18]是骨骼肌的多能干細(xì)胞，對(duì)骨骼肌的損傷后修復(fù)具有重要作用。骨骼肌在失去神經(jīng)支配后[19]，肌衛(wèi)星細(xì)胞由原來的靜息態(tài)進(jìn)入激活態(tài)，在多種因子的作用下增殖、分化，最終發(fā)育為成熟肌細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)作用。Myod1是生肌調(diào)節(jié)因子（Myogenic regulatory factors，MRFs）的一員[20]，參與肌衛(wèi)星細(xì)胞的初級(jí)分化，是肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的重要標(biāo)志物。Mir-206是骨骼肌的特異性miRNA，對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化起著重要的調(diào)控作用。Su等[21]認(rèn)為連續(xù)電針干預(yù)可能通過上調(diào)腓腸肌中Myod1和Mir-206的表達(dá)，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化，延緩失神經(jīng)肌萎縮。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在失神經(jīng)支配的第4周，大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌中Myod1、Mir-206 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而電針干預(yù)足三里、環(huán)跳穴則能進(jìn)一步上調(diào)其表達(dá)水平，故推斷電針干預(yù)足三里、環(huán)跳穴可能通過上調(diào)腓腸肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化水平延緩失神經(jīng)肌萎縮。

HDAC4目前被認(rèn)為是肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的抑制因子[22，23]，通過抑制 MRFS 家族成員（如 Myf5、MRF4 和myogeinn）的表達(dá)抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞分化。而TGF-β1/Smad3信號(hào)通路對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化起著重要的調(diào)控作用：TGF-β1與其下游受體TGF-βr1/TGF-βr2結(jié)合后，通過Smad2/3蛋白將信號(hào)從細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)傳遞到細(xì)胞核，之后可與其他核內(nèi)因子協(xié)同激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，而Smad7則是這一通路的抑制蛋白。研究表明TGF-β1可通過影響Smad3的表達(dá)調(diào)控HDAC4的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化[24]，而抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路則可以促進(jìn)小鼠萎縮骨骼肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化。Huang等[25]認(rèn)為，TGF-β1/Smad3/HDAC4信息軸在失神經(jīng)肌萎縮的發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用，而過表達(dá)Mir-206則可能通過抑制TGF-β1/Smad3/HDAC4信息軸上關(guān)鍵因子的表達(dá)，上調(diào)肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化水平，延緩失神經(jīng)肌萎縮。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在失神經(jīng)支配的第4周，大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌HDAC4、TGF-β1、TGF-βr1、TGF-βr2、Smad3 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)，電針干預(yù)能有效下調(diào)其表達(dá)水平；而術(shù)后4周大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌中Smad7 mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)，而電針干預(yù)能有效上調(diào)其表達(dá)，故推斷電針干預(yù)足三里、環(huán)跳穴可能通過抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，抑制HDAC4的表達(dá)，促進(jìn)腓腸肌Myod1和Mir-206的表達(dá)，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化水平，延緩骨骼肌質(zhì)量和體積的減少，進(jìn)而延緩失神經(jīng)肌萎縮的發(fā)展。

4 總結(jié)

綜上所述，我們推斷電針干預(yù)大鼠足三里、環(huán)跳穴能有效延緩腓腸肌的失神經(jīng)肌萎縮，這一機(jī)制可能是電針通過抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，抑制HDAC4的表達(dá)，并促進(jìn)腓腸肌Myod1和Mir-206的表達(dá)，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化，使失去神經(jīng)支配的骨骼肌的質(zhì)量和體積得以維持，最終延緩失神經(jīng)肌萎縮。