人微小纖溶酶原cDNA在畢赤酵母中的高效表達及活性檢測

王 娜，何成霞，鄒 強，茍興華，陳 松，吳昊俁，蔡心析，許天恒

(成都大學，四川 成都 610106)

【研究意義】人纖溶酶原由791個氨基酸被分子內(nèi)24個二硫鍵折疊形成多結(jié)構(gòu)域的糖蛋白，其分子量約92～94 kDa。人纖溶酶原包含3個結(jié)構(gòu)域：N端肽鏈、五環(huán)結(jié)構(gòu)域和絲氨酸活性中心[1]。人纖溶酶原是絲氨酸類酶人纖溶酶的前體，主要在肝臟中合成，進而分泌到血液和細胞外液中[2]。人纖溶酶原的激活是纖溶級聯(lián)的中心事件，纖溶酶原被激活劑高效切割R561～V562的肽鍵激活形成纖溶酶，該物質(zhì)可以分解體內(nèi)的血塊[3]。纖溶酶還在金屬蛋白酶激活、傷口的愈合、器官移植、血管再生術(shù)、病原體和腫瘤細胞的侵襲等反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[4-8]。人纖溶酶原是一條氨基酸鏈組成而人纖溶酶是由兩條鏈組成；重鏈包含N端肽鏈、五環(huán)結(jié)構(gòu)域，輕鏈包含絲氨酸活性中心[9]。人微小纖溶酶原不僅分子量小、擴散快、易于大批制備、可長期貯存，并可避免交叉污染，對于眼科疾病及其并發(fā)癥的治療有很好的效果。【前人研究進展】尿激酶和葡激酶都可以作為纖溶酶原激活劑，這些激活劑本身就可以作為治療溶栓障礙的藥物[10]。而纖溶酶治療血栓疾病的效果最好。近期發(fā)現(xiàn)纖溶酶原在治療人玻璃體后脫落有很大的效果。由于栓塞局部血流阻斷，纖溶酶原不能持續(xù)補充，所以效率不高。如果注射人微小纖溶酶原到視網(wǎng)膜靜脈，可以使靜脈血栓溶解，血管再通，而達到治療效果。【本研究切入點】本文中通過去除人纖溶酶原的N端多肽及5個三角區(qū)，形成的人微小纖溶酶原是PlgC端549～790位間的241個氨基酸殘基組成的肽鏈(包含絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域)，分子量約29 kDa，有6對二硫鍵，沒有PlgN端5個三角區(qū)，但是被激活后能夠形成具有纖溶活性的mplm。由于人微小纖溶酶原含有二硫鍵，在大腸桿菌中翻譯后，不能進一步加工折疊，分離純化后需要對人微小纖溶酶原進行復性，最高復性率為50 %，該過程繁瑣且具有不定性，而在動物細胞中表達成本非常高?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文選擇pPICZαA作為載體，其含有α-factor可以將人微小纖溶酶原分泌至胞外，用畢赤酵母作為宿主菌可以對人微小纖溶酶原進行正常折疊。甲醇誘導人微小纖溶酶原的表達，從而實現(xiàn)人微小纖溶酶原在畢赤酵母中的高效表達，為眼科疾病治療的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒E.coliJM109、pPICZαA、PichiaSMD1168。

1.1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及相關(guān)試劑耗材 限制性內(nèi)切酶XhoI和NotI，SacI, ligation試劑盒，PCR片段純化試劑盒均購置于Takara；氨芐青霉素和博來霉素；質(zhì)粒DNA小抽試劑盒購置于QIAUGEN。其它化學試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 DNA電泳儀、PCR儀、超凈工作臺、離心機、恒溫培養(yǎng)箱、溫控搖床、蛋白電泳系統(tǒng)、脫色搖床、恒溫金屬浴鍋和紫外分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 人微小纖溶酶原基因序列的設(shè)計及擴增 從NCBI數(shù)據(jù)庫中調(diào)取已知人微小纖溶酶原氨基酸序列，然后通過Sequence Quickie-Calc軟件根據(jù)畢赤酵母密碼偏愛性獲得人微小纖溶酶原的基因序列并在兩端加入NotI和XhoⅠ內(nèi)切酶識別的基因序列，然后委托生物工程公司合成。

1.2.2 人微小纖溶酶原基因與pPICZαA質(zhì)粒的連接 培養(yǎng)含有pPICZαA的E.coliJM109到對數(shù)生長期時提取質(zhì)粒，用限制酶NotⅠ和XhoⅠ雙酶切分別處理pPICZαA和mPlg基因后純化，用DNA連接酶連接形成pPICZαA-mPlg后轉(zhuǎn)化至E.coliJM109。篩選重組子，提取陽性轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒，直接用BglⅡ37 ℃，1 h，酶切之后跑核酸電泳看其核酸片段大小是否符合要求。

1.2.3 重組質(zhì)粒pPICZαA-mPlg的擴增及構(gòu)建多拷貝 取單菌落的E.coliJM109將其接種到LB培養(yǎng)基中進行活化至對數(shù)生長期，用化學法提取重組質(zhì)粒pPICZαA-mPlg。用BglⅡ和BamHⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，獲得包含AOX1啟動子、α信號肽和微小纖溶酶原基因的片段，同時BamHⅠ處理含有目的基因的重組質(zhì)粒，用連接酶將含有目的基因元件連接到線性化的重組質(zhì)粒中，最后用BglⅡ和BamHⅠ來消除頭頭相連和尾尾相連的多拷貝，依次重復兩次以上操作，獲得4拷貝的pPICZαA-mPlg重組質(zhì)粒。然后用bstXⅠ酶切重組的多拷貝質(zhì)粒，苯酚-氯仿溶液沉淀蛋白，之后用3M的CH3COONa、無水乙醇濃縮多拷貝pPICZαA-mPlg。同時用0 ℃無菌1M的山梨醇和無菌水制備感受態(tài)畢赤酵母。

1.2.4 人微小纖溶酶原基因在畢赤酵母中的表達 使用電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒導入感受態(tài)畢赤酵母中，在含有博來霉素的YPDS中培養(yǎng)，用菌落PCR鑒定陽性重組子，將其命名為PCP4PLG。然后把PCP4PLG接種到 BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600在2～5之間時加入終濃度為0.5 %的無水甲醇，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每24 h取菌液，2000 r/min離心，取適量上清液跑十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，鑒定是否有目的蛋白的表達。

1.2.5 人微小纖溶酶原的活性檢測 使用發(fā)色底物法S-2403(pyroGlu-Phe-Lys-pNA·HCl)在波長為405 nm處檢測發(fā)色底物S-2403的吸光度，從而達到檢測人微小纖溶酶原的活性效果，將甲醇誘導4 d后的畢赤酵母菌液離心獲得的上清液作為樣品，長白山白眉蝮蛇蛇毒中提取的蛋白分解酶為標品，尿激酶作為人微小纖溶酶原激活劑，50 mM Tris-HCl pH7.4作為緩沖液，37 ℃在96孔板中反應(yīng)。S-2403使用的濃度是0.3 mM，人微小纖溶酶原的檢測終濃度在1～10 nM。

圖1 人微小纖溶酶原多拷貝基因構(gòu)建Fig.1 Constructing the mutiple copy expression vectors

1.2.6 甲醇添加比對人微小纖溶酶原表達的影響 選取上述實驗得到最高活性的PCP4PLG，將其接種至BMGY培養(yǎng)基中，待其生長至對數(shù)生長期，以0.25 %、0.5 %、1 %、2 %、4 %的甲醇終濃度進行誘導培養(yǎng)，每培養(yǎng)24 h分別加入同樣量的甲醇，連續(xù)培養(yǎng)4 d后收集發(fā)酵液，取1 mL發(fā)酵液離心后跑SDS-PAGE電泳，并檢測其活性，分析實驗結(jié)果得到甲醇的最適添加比。

1.2.7 pH對人微小纖溶酶原表達的影響 配制磷酸鉀緩沖液pH梯度為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的BMGY培養(yǎng)基，將工程菌接種至培養(yǎng)基中，待其生長至對數(shù)生長期，加入上述實驗得到的最佳甲醇添加比的甲醇溶液進行誘導培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)4 d后收集發(fā)酵液，取1 mL發(fā)酵液離心后跑SDS-PAGE電泳，并檢測其活性，分析實驗結(jié)果得到最適pH值。

1.2.8 溫度對人微小纖溶酶原表達的影響 選取上述實驗得到最高活性的PCP4PLG，將其接種至BMGY培養(yǎng)基中，待其生長至對數(shù)生長期后加入甲醇，然后在溫度梯度為25、30、35 ℃的搖床恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后收獲發(fā)酵液，取1 mL發(fā)酵液離心后跑SDS-PAGE電泳，并檢測其活性，分析實驗結(jié)果得到最佳培養(yǎng)溫度。

1.2.9 溶氧量對人微小纖溶酶原表達的影響 選取上述實驗得到最高活性的PCP4PLG，將其接種至BMGY培養(yǎng)基中，待其生長至對數(shù)生長期后加入甲醇，然后在150、200、250、300 r/min 的搖床恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后收獲發(fā)酵液，取1 mL發(fā)酵液離心后跑SDS-PAGE電泳，并檢測其活性，分析實驗結(jié)果得到最佳搖床轉(zhuǎn)速。

1.2.10 發(fā)酵周期對人微小纖溶酶原表達的影響 選取上述實驗得到最高活性的PCP4PLG，將其接種至BMGY培養(yǎng)基中，待其生長至對數(shù)生長期加入無水甲醇然后分別在誘導1、2、3、4、5、6 d收集發(fā)酵液，取1 mL發(fā)酵液離心后跑SDS-PAGE電泳，并檢測其活性，分析實驗結(jié)果得到最佳發(fā)酵周期。

1.2.11 純化 將工程菌在上述得到的最佳發(fā)酵條件中培養(yǎng)并收集，將發(fā)酵液在4 ℃、8000 r/min進行離心10 min。然后收集上清液用3 kDa超濾膜進行濃縮，使其體積為原來的1/10。SP-Sepharose FF 層析柱進行平衡，平衡時用pH 6.0，0.025 mol/L檸檬酸緩沖液，然后將超濾濃縮的發(fā)酵液用pH 6.0，0.025 mol/L檸檬酸緩沖液稀釋3倍后上樣。將上述溶液上樣后，用pH 6.0，0.025 mol/L檸檬酸緩沖液沖洗柱子到第1個峰結(jié)束。再用pH 6.0，0.025 mol/L檸檬酸緩沖液和pH 6.0，0.025 mol/L檸檬酸緩沖液含1 mol/L的NaCl溶液進行洗脫。將收集的各組分跑SDS-PAGE電泳，并檢測其活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 人微小纖溶酶原基因與pPICZαA質(zhì)粒的連接后用BglⅡ酶切

pPICZαA-mPlg質(zhì)粒被BglⅡ酶切后，1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物，人微小纖溶酶原基因為700 bp左右，pPICZαA為3.6 kb，重組的pPICZαA-mPlg為4.3 kb。在電泳膠上顯示有4000 bp多的電泳條帶，實驗結(jié)果與預測結(jié)果一致，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

康熙十四年十月十三日，幸盤山諸寺，皆賜金。 智樸和尚呈《接駕詩二首》。康熙二十五年十二月一日，康熙再次幸臨盤山盤谷寺，賜詩，智樸作《丙寅季冬一日駕幸青溝應(yīng)制詩》如下：

2.2 多拷貝載體雙酶切后核酸電泳結(jié)果

pPICZαA-4mPlg被BglⅡ和BamHⅠ雙酶切后，1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物。一個人微小纖溶酶原的表達元件是2436 bp，4拷貝的人微小纖溶酶原為9744 bp。1～4號樣品中，都有一條接近10 000 bp的4拷貝條帶和3.6 kb的載體條帶。實驗結(jié)果與預測結(jié)果一致，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖3)。

M: DNA marker DL10000;1：pPICZαA-mPlg digested with BglⅡ圖2 重組蛋白表達載體構(gòu)建Fig.2 Construction of expression vector of the recombinant protein

M:DNA marker DL10000; 1～4：BglⅡ和BamHⅠ雙酶切后的4拷貝重組蛋白表達載體圖3 4拷貝重組蛋白表達載體構(gòu)建Fig.3 Construction of 4 copys expression cassette vector of the recombinant protein

2.3 轉(zhuǎn)化到酵母中的菌落PCR鑒定

pPICZαA-4mPlg轉(zhuǎn)化到酵母后，1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。從圖4可知，1、3、4、6-15都有條帶，2號為pPICZαA所 PCR的產(chǎn)物，1號為pPICZαA-4mPlg的PCR產(chǎn)物，除5號其他樣品跑出來的電泳條帶均與1號相同為1400 bp，實驗結(jié)果與預測結(jié)果一致，轉(zhuǎn)化成功。

2.4 SDS-PAGE電泳結(jié)果

12 %SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，1～7號泳道可見相對分子質(zhì)量為29 kDa，1～6號泳道為4拷貝表達載體轉(zhuǎn)化子；7號泳道為單拷貝表達載體轉(zhuǎn)化子；8號泳道為不含人微小纖溶酶原基因但是有pPICZαA 的畢赤酵母，9號泳道為1號樣品加入甲醇誘導劑之前的菌液。8、9泳道在29 kDa都沒有條帶，1～7號泳道畢赤酵母在加入甲醇溶液后，都產(chǎn)生人微小纖溶酶原大小的目的蛋白大小與預期相符合，且單拷貝蛋白電泳條帶明顯比多拷貝電泳條帶淡很多，說明多拷貝表達量高。

2.5 發(fā)酵周期對人微小纖溶酶原產(chǎn)量的影響

從圖6和7可知，PCP4PLG被甲醇誘導1～6 d內(nèi)蛋白表達量隨著時間的增加而增加，當甲醇誘導6 d后人微小纖溶酶原的產(chǎn)量最高。

M:DNA marker DL10000;1～14:pPICZαA-4mPlg轉(zhuǎn)化到酵母后的PCR產(chǎn)物,15:4拷貝表達質(zhì)粒載體的PCR產(chǎn)物圖4 菌落PCR篩選陽性克隆Fig.4 PCR screening positive clone

M:Protein marker;1～6：4拷貝表達載體轉(zhuǎn)化子; 7：單拷貝表達載體轉(zhuǎn)化子; 8：含pPICZαA 的畢赤酵母; 9：誘導前樣品圖5 培養(yǎng)基上清液目標蛋白蛋白質(zhì)電泳結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE peofile of expressed protein

1：誘導前;2：不含目的基因酵母誘導6D;3：誘導1D;4：誘導2D;5：誘導3D;6：誘導4D;7：誘導5D;8：誘導6D圖6 1 %甲醇不同誘導時間對人微小纖溶酶原表達的影響Fig.6 Effect of different induction time of 1 % methanol on expressing the microplasminogen

圖7 誘導天數(shù)對人微小纖溶酶原活性的影響Fig.7 Effect of induction days on microplasminogen activity

1：0.25 %甲醇;2：0.5 %甲醇;3：1 %甲醇;4：2 %甲醇;5：3 %甲醇;6：誘導前圖8 誘導劑濃度對人微小纖溶酶原表達的影響Fig.8 Effect of different induction concentration of methanol on expressing the microplasminogen

2.6 誘導劑濃度對人微小纖溶酶原產(chǎn)量的影響

從圖8～9可知，PCP4PLG被不同濃度甲醇持續(xù)誘導4 d后的電泳結(jié)果和活性檢測顯示。甲醇終濃度為2 %，產(chǎn)量最高，活性最高。

2.7 pH對人微小纖溶酶原產(chǎn)量的影響

從圖10～11可知，PCP4PLG在磷酸鉀緩沖液pH為3 、4、5、6、7中被甲醇誘導4 d后的發(fā)酵樣品。pH為7時，活性最高。

圖9 甲醇終濃度對人微小纖溶酶原活性的影響Fig.9 Effect of final concentration of methanol on microplasminogen activity

1：pH3；2：pH4；3：pH5；4：pH6；5：pH7；6：pH6不含目的基因酵母；8：誘導前圖10 pH對人微小纖溶酶原表達的影響Fig.10 Effect of different pH on expression the microplasminogen

圖11 pH對活性的影響Fig.11 Effect of pH on microplasminogen activity

2.8 不同OD600誘導對人微小纖溶酶原產(chǎn)量的影響

1: OD600 =2;2: OD600 =3;3: OD600 =5;4:OD600 =6;5:OD600 =8;6: OD600 =10;7: OD600 =12;8: 誘導前;9:不含目的基因酵母OD600圖12 不同OD600添加甲醇對人微小纖溶酶原表達的影響Fig.12 Effect of different OD600 add methanol on expressing the microplasminogen

圖13 OD600對活性的影響Fig.13 Effect of OD600 on activity

1: r/min=150;2: r/min=175;3: r/min=200;4:r/min=225;5:r/min=250;6: r/min=275;7: r/min=300;8: 誘導前;9:不含目的基因酵母r/min=250圖14 不同轉(zhuǎn)速對人微小纖溶酶原表達的影響Fig.14 Effect of different rooting speed on expression the microplasminogen

2.9 溶氧量對人微小纖溶酶原產(chǎn)量的影響

PCP4PLG在不同轉(zhuǎn)速下甲醇誘導4 d后的發(fā)酵樣品。由圖14～15可知，人微小纖溶酶原的產(chǎn)量隨溶氧量的增高而增強?？紤]到發(fā)酵容器的容量有限，若是轉(zhuǎn)速越高，容器內(nèi)的發(fā)酵液所受到離心力越大而導致發(fā)酵液容易飛濺或污染。所以僅考慮250 r/min為最適溶氧量。

圖15 轉(zhuǎn)速對活性的影響Fig.15 Effect of rooting speed on microplasminogen activity

1:r/min=24 ℃;2:r/min=26 ℃ 3: r/min=28 ℃;4:r/min=30 ℃;5:r/min=32 ℃;6: r/min=34 ℃;7: r/min=36 ℃;8: 誘導前;9:不含目的基因酵母30 ℃圖16 不同溫度對人微小纖溶酶原表達的影響Fig.16 Effect of different temperature on expression the microplasminogen

圖17 溫度對活性的影響Fig.17 Effect oftemperature on microplasminogen activity

2.10 溫度對人微小纖溶酶原產(chǎn)量的影響

PCP4PLG在不同溫度下甲醇誘導4 d后的發(fā)酵樣品。由圖16～17可知，PCP4PLG在30 ℃表達人微小纖溶酶原產(chǎn)量最佳。

表1 樣品稀釋80倍組吸光度與活性濃度

2.11 蛋白純化SDS-PAGE及活性檢測

由表1和圖18可知，峰內(nèi)和洗脫液在29 kDa有很明顯的電泳條帶，在峰內(nèi)的樣品和洗脫液都有活性，代表人微小纖溶酶原純化成功，蛋白的純度接近90 %，且測得的活性高達336 U/mL且蛋白回收率為69 %。

3 結(jié) 論

國內(nèi)的沈俊卿等[11]表達Plg C 端530～790位間的261個氨基酸殘基組成的肽鏈，在大腸桿菌中表達。由于大腸桿菌在蛋白翻譯后不能對纖溶酶原進行正常折疊，需要體外用半胱氨酸復性但是體外復性可能形成錯誤折疊，得到有活性的人微小纖溶酶原含量很不理想，而且耗時很長。宋鋼等[12]在畢赤酵母中成功表達含有261個氨基酸的人微小纖溶酶原且有活性，但沒有具體說明其產(chǎn)量。Rongzeng Liu[13]在畢赤酵母中成功表達出含有261個氨基酸序列的人微小纖溶酶原，在5 L的發(fā)酵罐中，超過40h的誘導酵母分泌的蛋白含量達到1.88 g/L，上清液的活性單位達到7.9 U/mL。國外的Kishore k等[14]，成功表達在信號肽的作用下從畢赤酵母中分泌出來的不含五環(huán)結(jié)構(gòu)的人微小纖溶酶原，并測定其活性、氨基酸序列等。Frans Aerts等[15]，在畢赤酵母中表達人纖溶酶原C端249個氨基酸序列，并用豬眼睛做實驗測定其水解層粘蛋白、纖維連接蛋白的活性。

研究人微小纖溶酶原為未來研究其結(jié)構(gòu)和機制提供條件。通過發(fā)酵條件優(yōu)化得到PCP4PLG的最適pH值為7，最適溫度為30 ℃和最佳甲醇添加比為2 %，搖床轉(zhuǎn)速在250 r/min，在酵母生長濃度為1時添加甲醇持續(xù)誘導6 d，畢赤酵母表達人微小纖溶酶原的產(chǎn)量最高且發(fā)酵液活性為90 U/mL，進行SP-Sepharose fast flow凝膠層析后的蛋白液活性為336 U/mL，為后續(xù)進行大規(guī)模表達人微小纖溶酶原打下了基礎(chǔ)。

4 討 論

不同物種對遺傳密碼子具有一定的偏好性，當酵母表達非自身基因時，某些稀有密碼子的出現(xiàn)可能限制細胞中氨酰tRNA對氨基酸的正常運轉(zhuǎn)而導致翻譯的提前終止，此外，不恰當?shù)?AT 比例及分布也會明顯降低表達水平[16]。因此，找到人微小纖溶酶原的氨基酸序列，需要通過軟件設(shè)計畢赤酵母偏愛的人微小纖溶酶原的cDNA序列。

1: 峰內(nèi);2: 峰內(nèi);3: 穿透液;4:洗脫液;5:發(fā)酵液 圖18 不同純化階段的人微小纖溶酶原含量Fig.18 Human microplasminogen content in different purification stages

畢赤酵母SMD1168為甲醇快利用型菌株，其同時含有編碼醇氧化酶AOX1 和 AOX2 基因。一般情況下，分泌蛋白表達選擇AOX1為啟動子，其表達出來的蛋白活性相對于AOX2為啟動子的要高一些[17]。而且畢赤酵母SMD1168為組氨酸脫氫酶缺陷菌株，可以利用組氨酸來篩選重組子。蛋白酶缺陷型的宿主菌蛋白含量少，可以減少目的蛋白的降解[18]。

載體選用pPICZɑA，其中含有在大腸桿菌可以擴增的原核啟動子，同時含有5’AOX1 啟動子、3’AOX1終止子。多克隆位點、抗性篩選標計、線性化酶切位點、C 末端聚組氨酸標簽，以便于外源基因通過質(zhì)粒整合到酵母基因組并進行篩選、表達，也有利于外源蛋白的檢測和純化[19]。

人微小纖溶酶原的表達及活性鑒定。在重組子被篩選出來后，酵母不需要很細化的培養(yǎng)基成分只需要用BMGY培養(yǎng)基就可以來培養(yǎng)及誘導人微小纖溶酶原的表達。通過誘導前和誘導后的上清液SDS-PAGE便可很直觀的看出是否有目的蛋白的表達。在有目的條帶的前提下進行發(fā)色底物測定，通過測定人微小纖溶酶原水解發(fā)色底物使其產(chǎn)生淡黃色的對硝基苯胺在波長為405 nm的吸光度來確定人微小纖溶酶原活性強弱。

外源基因多拷貝能使串聯(lián)的多個目的基因同時進行轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而達到提高蛋白產(chǎn)量的效果[20]，但少部分研究也表明，單拷貝與多拷貝間并無明顯差異，甚至多拷貝產(chǎn)量更低[21]。這可能是由于外源mRNA 翻譯效率降低，也可能是因為蛋白質(zhì)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能正確折疊或者折疊效率低造成的。