肺癌完全性切除術對患者外周血中Th17/Treg細胞平衡的影響

趙 蘇 鄭曉瑜 朱開彬 卜建龍 徐世東

肺癌是當前全世界最常見的腫瘤，每年導致超過140萬人死亡[1]。肺癌完全性切除術是目前治療肺癌的主要方式，但手術本身卻可能會促進腫瘤的復發(fā)轉移[2]。主要原因是手術創(chuàng)傷會干擾機體免疫功能，抑制術后適應性免疫反應和抗腫瘤免疫[3]。而CD4+T細胞亞群分化失衡在適應性免疫功能失調(diào)中起主要作用[4]。因此，探討手術創(chuàng)傷后CD4+T細胞亞群的變化至關重要，有助于找到有效的治療策略來改善手術創(chuàng)傷后免疫抑制。

初始CD4+T細胞與抗原作用后會增殖分化為不同的CD4+T細胞亞群[5]。CD4+T細胞亞群主要包括Th1和Th2[6]。新近研究表明，Th細胞也可轉化為Th17和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)，Th17細胞主要誘導正向免疫應答，而Treg則主要抑制免疫效應[7]。以往研究表明手術創(chuàng)傷可以誘導Th1/Th2平衡向Th2漂移[8]。新近研究發(fā)現(xiàn)手術創(chuàng)傷后Th17/Treg細胞也會失衡[5，9]。然而，肺癌完全性切除術后患者Th17/Treg平衡的改變尚未完全闡明。因此本研究旨在探討肺癌完全性切除術對肺癌患者外周血中Th17/Treg平衡的影響。

1 資料和方法

1.1 病例資料

研究程序經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準。本實驗研究對象為21例病理確診為肺癌并即將接受肺癌完全性切除術的患者(均為我院2016年1月—2018年1月收治入院的患者)和21名健康對照者。所有患者均接受肺癌完全性切除術，進行肺葉(全肺)切除及淋巴結清掃術。手術方式均為常規(guī)開胸手術。研究分為三組，健康對照組(Control)、手術患者術前組(Day 0)和手術患者術后三天組(Day 3)?；颊呤中g前必須未接受化療和放療。患有自身免疫性疾病或病毒感染的患者被排除在研究之外?；颊吆徒】祵φ照叩囊话阗Y料詳見表1。

表1 肺癌完全性切除術患者和健康對照者一般資料的比較Table 1 Correlation between patients underwent lung cancer resection and healthy controls

Note：ASA.American society of anesthesiologists.

1.2 標本收集

手術患者在術前(Day0)和術后三天(Day3)清晨，空腹采集肘靜脈血各8 mL，分裝在EDTA-2K抗凝管中，一管6 mL用于流式細胞和RT-PCR檢測，另一管2 mL離心后取血清，保存于-80℃冰箱，用于ELISA檢測細胞因子。健康對照組(不接受手術)隨機清晨空腹采集肘靜脈血，標本收集儲存方法同前。

1.3 外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分離

取一15 mL離心管，加入2 mL已用抗凝劑處理過的人血液樣品，再加入2 mL PBS進行稀釋，上下顛倒混勻樣品，備用；取一新的無菌15 mL離心管，加入3 mL淋巴細胞分離液，然后將稀釋好的4 mL抗凝血標本小心地沿離心管壁緩慢加入淋巴細胞分離液上，保持分離液與標本界面清晰；將離心管垂直放入離心機內(nèi)，18～20℃，1 000 g離心30 min；小心取出離心管，此時，液體分三層：最上層為血漿，下層為紅細胞，中間層為分離液層，位于中層靠近血漿層的白膜層即為單個核細胞層，小心吸走血漿層，不要打動白膜層；用彎頭滴管插入白膜層，小心吸取單個核細胞；將白膜層細胞吸入另一離心管中，加入無菌PBS重懸，400 g離心10～15 min；重復洗滌細胞兩次；末次離心后，棄上清，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640重懸細胞，顯微鏡下用細胞計數(shù)板計數(shù)，將細胞濃度調(diào)整至2～4×106/mL。

1.4 流式細胞術檢測PBMC中的Th17細胞

向PBMC管中加入1 μL莫能霉素和1 μL細胞刺激混合液，混勻后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。向PBMC管中加入FITC標記的CD4單克隆抗體，室溫下避光孵育30 min。PBS洗滌兩次，棄上清，加入固定劑300 μL，室溫下避光固定30 min。固定后洗滌兩次，棄上清，再加入100 μL破膜劑，加入20 μL PE-IL-17單克隆抗體，室溫下避光孵育15～20 min。最后再加入500 μL PBS洗滌一次，用300 μL 1%濃度的甲醛固定細胞，放在4℃環(huán)境中，等待用流式細胞儀檢測。

1.5 流式細胞術檢測PBMC中的Treg細胞

向PBMC管中加入100 μL BD Pharmingen Stain Buffer(554656)混懸細胞，再加入FITC標記的CD4單克隆抗體以及APC-cy7標記的CD25單克隆抗體，室溫下避光孵育30 min。用無菌PBS洗滌兩次，棄上清，加入固定劑(IFP)100 μL，室溫下避光固定4 h。固定后洗滌兩次，棄上清，加入破膜劑100 μL，加入PE-FOXP3單克隆抗體，室溫下避光孵育15～20 min。最后再加入500 μL PBS洗滌一次，用300 μL 1%濃度的甲醛固定細胞，放在4℃，等待用流式細胞儀檢測。

1.6 RT-PCR檢測PBMC中RORγt和Foxp3基因的mRNA水平

使用Omega公司的RNA提取試劑盒提取總RNA，用Real-Time PCR試劑盒進行逆轉錄得到cDNA。RORγt上游引物序列：5′-AATCTCATCCTCGGAAAAGTG-3′，下游引物序列：5′-TCTCAAAGCAGGAGCAATGGA-3′；Foxp3上游引物序列：5′-TGGAGGAACTCTGGGAATGTG-3′，下游引物序列：5′-GGTGCTGGAGAAGGAGAAGCT-3′；以GAPDH為內(nèi)參，上游引物序列：5′-CATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3′，下游引物序列：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。上機后反應程序如下：酶激活溫度95℃(15 min)→擴增反應溫度94℃(15 s)→退火溫度65℃(30 s)，總計40個循環(huán)→延伸溫度溫度70℃(34 s)。1.7 酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

采用人IL-17和TGF-β ELISA試劑盒(Abclonal)檢測三組中血漿IL-17及TGF-β的濃度。按試劑盒操作說明檢測，在iMark酶標儀(美國BIO-RAD公司)上測定OD450值，繪制標準曲線，計算樣品濃度。

1.7 統(tǒng)計分析

使用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，患者一般資料中的計量資料使用均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料以百分比表示，其中身高、年齡、體重等計量資料采用獨立樣本t檢驗，性別和ASA分級等計數(shù)資料采用卡方檢驗和秩和檢驗。多組間比較采用單因素方差分析(one-way AVONA)，多重比較采用SNK法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺癌完全性切除術改變手術后患者外周血中Th17/Treg細胞百分比

肺癌患者術前組(Day 0)外周血中Th17細胞(圖1A和B)(P<0.01)和Treg細胞百分比(圖1C和D)(P<0.05)均高于健康對照組(Control)。此外，手術患者術后三天組(Day 3)與術前組(Day 0)相比，Th17細胞百分比下降(圖1A、B)(P<0.01)，而Treg細胞百分比明顯增加(圖1C和D)(P<0.01)。

2.2 肺癌完全性切除術影響肺癌患者PBMC中RORγt和Foxp3的表達

肺癌患者術前組(Day 0)與健康對照組相比，RORγt和Foxp3的mRNA水平均增高(圖2A和B)(P<0.01)。肺癌患者術后三天組(Day 3)與術前組(Day 0)相比，RORγt表達減少(圖2A)(P<0.01)，而Foxp3的表達增加(圖2B)(P<0.01)。

2.3 肺癌完全性切除術影響肺癌患者血漿中IL-17和TGF-β1的表達

通過ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，肺癌患者術前組血漿中IL-17和TGF-β1的水平高于健康對照組(圖3A，B)(P<0.01)。此外，與術前組相比較，患者術后3天組血漿IL-17的水平降低(圖3A)(P<0.01)，然而血漿TGF-β1的水平明顯增高(圖3B)(P<0.01)。

圖1 肺癌完全性切除術對外周血中Th17和Treg細胞百分比的影響Figure 1 Effects of lung cancer resection on the percentages of Th17 and Treg cells in the peripheral blood of patientsNote：A.Representative diagram of the percentage of Th17 in healthy controls and patients before surgery(Day 0)or Day 3；B.Graph shows the percentage of Th17 cells；C.Representative diagram of the percentage of Treg cells in healthy controls and patients before surgery(Day 0)or Day 3；D.Graph shows the percentage of Treg cells.* P<0.05，** P<0.01，when compared with the control group；# P<0.05，when compared with the Day 0；## P<0.01，when compared with the Day 0.

圖2 肺癌完全性切除術對患者PBMC中RORγt和Foxp3的影響Figure 2 Effects of lung cancer resection on the expression of RORγt and Foxp3 in PBMCNote：A.Expression of RORγt in the three groups；B.Expression of Foxp3 in the three groups.* P<0.05，** P<0.01，when compared with control group；#P<0.05，## P<0.01，when compared with Day 0.

圖3 肺癌完全性切除術對患者血漿中TGF-β1和 IL-17的影響Figure 3 Effects of lung cancer resection on the plasma levels of tumor growth factor(TGF)-β1 and interleukin(IL)-17Note：A.Plasma level of IL-17 in the three groups；B.Plasma level of TGF-β1 in the three groups.* P<0.05，** P<0.01，when compared with control group；#P<0.05，## P<0.01，when compared with Day 0.

3 討論

肺癌是全球癌癥的第一原因，也是癌癥的第一死因。手術切除仍然是治療肺癌的一線治療方法，但手術本身導致的術后免疫抑制可以促進肺癌的復發(fā)轉移，因此深入研究手術切除對肺癌患者術后免疫抑制的影響，并尋找新的可運用于臨床的治療策略，是提高患者臨床受益的迫切需要。

手術創(chuàng)傷能觸發(fā)機體發(fā)生復雜的宿主反應，它既干擾固有免疫反應，又干擾適應性免疫反應，誘導相關細胞和促炎、抗炎細胞因子發(fā)生短暫性的變化，從而造成機會性感染和創(chuàng)傷后并發(fā)癥增加[10-11]。創(chuàng)傷后免疫失衡可導致膿毒癥和多器官功能障礙，對抗抗腫瘤免疫反應，促進腫瘤患者的復發(fā)和轉移。因此，全面理解免疫應答的活化和變化對于預防創(chuàng)傷后并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展以及改善創(chuàng)傷后的不良臨床后果至關重要。迄今為止，手術創(chuàng)傷相關并發(fā)癥的確切機制仍未被闡明。然而，細胞介導的免疫抑制被公認對于創(chuàng)傷后并發(fā)癥的發(fā)展至關重要。其中，CD4+T細胞應答的改變在細胞介導的免疫抑制中發(fā)揮關鍵性作用，主要包括Th1/Th2平衡向Th2漂移，同時伴隨Th1功能的喪失和Treg細胞數(shù)量的上調(diào)[12]。

近年來，有研究表明嚴重的胸部創(chuàng)傷和創(chuàng)傷后敗血癥會使得Th17/Treg失衡[13-14]。但是，肺癌完全性切除術對肺癌患者術后Th17/Treg細胞平衡的影響尚未被闡明。本研究結果顯示，在接受肺癌完全性切除術后的患者外周血中，Th17細胞的百分比下降，而Treg細胞的百分比上調(diào)。同時，血漿IL-17的表達水平降低，而血漿TGF-β1的表達水平增高。ROR-γt是Th17細胞特異性的轉錄因子，在初始輔助性T細胞中誘導IL-17基因的轉錄。Th17細胞百分比在ROR-γt-缺陷型小鼠中明顯降低[15]。同時，Treg細胞的特異性轉錄因子是Foxp3，并且已經(jīng)有研究表明TGF-β依賴性信號轉導途徑可以促進初始T細胞中的Foxp3的表達[16]。因此，本研究也采用RT-PCR法檢測了ROR-γt和Foxp3的表達。結果表明，肺癌患者術后與術前相比，ROR-γt的表達降低，F(xiàn)oxp3的表達升高，以上結果均表明肺癌完全性切除術帶來的手術創(chuàng)傷可能導致Th17/Treg平衡向Treg方向漂移。這種變化抑制了機體的抗腫瘤免疫，并可能促進腫瘤的復發(fā)和轉移。

導致手術創(chuàng)傷后Th17/Treg失衡的原因包括很多，首先，細胞因子微環(huán)境是Th17/Treg平衡的主要決定因素之一。TGF-β1是由Treg分泌的特征性細胞因子，可促進Treg的分化[15]。然后由Treg細胞分泌產(chǎn)生的TGF-β1又可以為Treg的誘導產(chǎn)生提供強大的正反饋回路。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)手術促進了TGF-β1的產(chǎn)生，這可能是術后患者外周血Th17/Treg細胞平衡向Treg方向偏移的一個重要原因；最近有報道稱共刺激分子如PD-1也是控制Th17和Treg細胞分化的關鍵因子[17]。PD-1通過與其配體PD-L1結合導致PD-1胞內(nèi)段的酪氨酸發(fā)生磷酸化，PD-1內(nèi)段免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)與免疫酪氨酸轉換基序(ITSM)發(fā)生磷酸化，隨后抑制抗原信號向細胞核內(nèi)傳入，抑制T細胞信號傳導，介導免疫抑制作用[18-19]；并且，手術創(chuàng)傷同時會引起微循環(huán)功能障礙，導致乳酸水平升高[20]。乳酸水平的增加導致T細胞的代謝重整，損害了T輔助細胞的功能，但卻不影響Treg細胞的功能，這一研究表明，手術創(chuàng)傷為Tregs提供了代謝優(yōu)勢[21]。此外，嚴重的創(chuàng)傷改變了常規(guī)樹突狀細胞(cDCs)分泌促炎細胞因子的能力，從而損害了其有效觸發(fā)Th1和Th17細胞免疫應答的能力；還會誘導未成熟抗原呈遞細胞如未成熟樹突細胞(DC)和骨髓來源抑制細胞(MDSC)的百分比明顯增加[22]。這些抗原呈遞細胞損害了Th1和Th17細胞的功能，并可促進Treg細胞的功能，這也可能是手術創(chuàng)傷中Th17/Treg失衡的潛在機制[23]。

此外，越來越多的證據(jù)表明，Th17和Treg細胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移中表現(xiàn)出復雜和有爭議的作用[19，24]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，肺癌患者外周血中的Th17和Treg細胞的百分比與健康對照者相比均增高，與以往的文獻報道一致，可能的原因主要有，肺癌患者相比較健康對照者IL-17A、IL-23、IL-1 β以及RORC的血漿蛋白水平和mRNA分子水平均增高，這些增高了的細胞因子和特異性轉錄因子會明顯促進Th17細胞的分化[25]；肺癌患者相比較健康對照者TGF-β以及Foxp3表達水平也增高，而這些細胞因子及轉錄因子的過表達會促進Treg細胞的分化[26]。

綜上所述，接受肺癌完全性切除術后的患者外周血Th17/Treg細胞平衡向Treg方向偏移，可使得外科手術患者術后的免疫功能處于抑制狀態(tài)，可能會促進或加速腫瘤的復發(fā)與轉移，因而下一步對肺癌完全性切除術后Th17/Treg失衡進行深入的機制研究有助于尋找治療靶點以改善術后Th17/Treg失衡，對肺癌患者的預后有重要的臨床意義。