二甲雙胍提高肝癌細胞的藥物敏感性及其作用機制

王亞東,周 軍,孫學軍,尹家俊*

(1.大連大學附屬中山醫(yī)院 a.普通外科;b.介入科,遼寧 大連116001；2.西安交通大學附屬第一醫(yī)院 普通外科)

原發(fā)性肝癌是世界上最常見且死亡率較高的惡性腫瘤之一,5年生存率約為17%,而晚期惡性腫瘤患者的生存率僅為3%[1-2]。手術切除是肝癌治療的首選方法,但由于肝癌早期癥狀不明顯導致大部分患者確診時已是晚期,錯失了最佳的手術時機,因此化學療法仍是中晚期肝癌患者治療的重要方法。索拉非尼是一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑,也是原發(fā)性肝癌臨床管理的一線藥物,然而腫瘤細胞耐藥性的出現(xiàn)及發(fā)展嚴重影響了肝癌的治療效果[3]。

近年來,不斷有研究表明,二甲雙胍,一種雙胍類口服治療2型糖尿病的臨床藥物,在增強腫瘤細胞化療敏感性方面發(fā)揮著重要性作用[4，5]。但是其在肝癌細胞化療敏感性方面的作用及相關機制依然未全部闡明。因此,本研究探究了二甲雙胍在肝癌細胞索拉菲尼敏感性方面的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素/鏈霉素試劑及胰蛋白酶均購自美國Gibco；凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC/PI)購自上海翊圣生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學；實驗所用一抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司,二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。二甲雙胍購自大連美侖生物制藥有限公司,索拉菲尼由大連大學附屬中山醫(yī)院提供。

1.1.2細胞 人肝細胞癌細胞系HepG2購自中國科學院細胞庫。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HepG2細胞培養(yǎng)于含10%FBS及1%青霉素/鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中,并將其置于37℃,CO2含量為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞融合度達到80%-90%時消化細胞進行傳代。

1.2.2藥物處理 給予HepG2細胞0,1,5,10,50 μM的索拉菲尼分別處理0、24、48和72 h。此外,0,1,2,5,10 mM的二甲雙胍處理細胞0、24、48和72 h。

1.2.3蛋白免疫印跡(Western blot) 細胞收集或組織勻漿后加入蛋白裂解液,離心吸取上清為組織全蛋白溶液,BCA 法測定蛋白質(zhì)含量,變性后取30 μg蛋白樣本經(jīng)10% SDS-PAGE膠進行分離,轉膜后將PVDF膜用5%牛奶進行室溫封閉1 h,一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h,洗膜后ECL化學熒光顯色,ImageJ軟件進行定量。 GAPDH為內(nèi)對照。

1.2.4CCK-8實驗 HepG2細胞按照4000個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)過夜,第二天給予細胞不同藥物濃度的索拉菲尼、二甲雙胍或索拉菲尼+二甲雙胍處理,于處理后的0、24、48和72 h分別向每孔中加入10 μl CCK-8溶液和90 μl細胞培養(yǎng)基繼續(xù)孵育 4 h,測定450 nm 波長處的吸光度。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞轉染后48 h用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化細胞,清洗一次,離心后每組加入 1×Annexin V Binding Buffer 100 μl,充分混勻細胞,每組細胞加入 5 μl FITC Annexin V 染液,5 μl PI 染液,避光室溫反應15 min,然后每管加300 μl 1×Annexin V Binding Buffer溶液,1 h流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 二甲雙胍增強索拉菲尼對HepG2細胞增殖的抑制作用CCK-8實驗顯示,隨著藥物濃度的增強及作用時間的延長,索拉菲尼對HepG2細胞增殖活性的抑制作用明顯提高(圖1A)；同樣地,5 mM及以上濃度的二甲雙胍亦可抑制HepG2細胞的增殖活性(圖1B)。由以上結果,我們最終選取了5 μM的索拉菲尼和5 mM的二甲雙胍做接下來的研究。同索拉菲尼組相比,二甲雙胍+索拉菲尼組細胞的增殖活性明顯降低(圖1C)。

A-B.CCK-8檢測不同濃度二甲雙胍或索拉菲尼對HepG2細胞增殖活性的影響(*P<0.05,**P<0.01)；C.CCK-8檢測對照組、索拉菲尼(5 μM)組及索拉菲尼(5 μM) + 二甲雙胍(5 mM)組HepG2細胞的增殖活性(*P<0.05,索拉菲尼組vs對照組；#P<0.05,索拉菲尼+二甲雙胍組vs索拉菲尼組)。

圖1 二甲雙胍增強索拉菲尼對HepG2細胞增殖的抑制作用

2.2 二甲雙胍增強索拉菲尼對HepG2細胞的促凋亡作用藥物處理48 h后收集細胞,流式細胞術結果顯示,同索拉菲尼組相比,二甲雙胍+索拉菲尼組細胞凋亡明顯升高(圖2A)；此外,western blot結果顯示,二甲雙胍+索拉菲尼組Bcl-2表達降低,而caspase3和Bax表達升高(圖2B)。

2.3 二甲雙胍抑制HepG2細胞的上皮間充質(zhì)轉化Western blot結果顯示,同索拉菲尼組相比,二甲雙胍+索拉菲尼組細胞中E-cadherin表達升高,而N-cadherin、Snail、Vimentin蛋白表達降低(圖3),表明二甲雙胍可抑制HepG2細胞的上皮間充質(zhì)轉化。

2.4 二甲雙胍抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活同索拉菲尼組相比,二甲雙胍+索拉菲尼組細胞中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化蛋白的表達降低(p-PI3K、p-AKT、p-mTOR),而總蛋白表達水平不變(圖4)。

A.流式細胞術檢測各對照組、索拉菲尼組及索拉菲尼+二甲雙胍組HepG2細胞的凋亡情況；B.Western blot檢測各處理組HepG2細胞中Bcl-2、Bax及caspase3蛋白的表達情況。(*P<0.05,索拉菲尼組vs對照組；#P<0.05,索拉菲尼+二甲雙胍組vs索拉菲尼組)

圖2二甲雙胍增強索拉菲尼對HepG2細胞的促凋亡作用。

Western blot檢測各處理組HepG2細胞中E-cadherin、N-cadherin、Snail及Vimentin蛋白的表達(*P<0.05,索拉菲尼組vs對照組；#P<0.05,索拉菲尼+二甲雙胍組vs索拉菲尼組)。

圖3 二甲雙胍抑制HepG2細胞的上皮間充質(zhì)轉化

Western blot檢測各處理組HepG2細胞中PI3K、AKT、mTOR總蛋白及磷酸化蛋白的表達(*P<0.05,索拉菲尼組vs對照組；#P<0.05,索拉菲尼+二甲雙胍組vs索拉菲尼組)。

圖4 二甲雙胍抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活。

3 討論

二甲雙胍作為2型糖尿病的一線治療藥物,除了具有胰島素增敏、降血壓等作用,近年來研究表明其可以降低糖尿患者罹患肝癌的風險并改善肝癌患者的預后[6]。二甲雙胍亦可明顯抑制肝癌細胞的增殖活性并促進其凋亡[7-9]。此外,越來越多的證據(jù)表明二甲雙胍可提高腫瘤細胞的化療敏感性。例如,吳詩文等[10]研究表明,在胃癌中,采用二甲雙胍聯(lián)合順鉑處理較單一順鉑處理細胞增殖活性受到明顯抑制。Uehara[11]實驗結果顯示,二甲雙胍能明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖并提高其對順鉑的化療敏感性。同樣地,在下咽癌[12]、結腸癌[13]、胰腺癌[14]等惡性腫瘤中,二甲雙胍聯(lián)合化療藥物用藥亦可明顯增強腫瘤細胞的化療敏感性。在本研究中,我們通過體外實驗探究了二甲雙胍對肝癌細胞HepG2化療敏感性的影響,我們發(fā)現(xiàn),同索拉菲尼單獨處理組相比,二甲雙胍聯(lián)合索拉菲尼用藥可促進促凋亡蛋白Bcl-2和caspase3的表達,降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表達,促進細胞凋亡且抑制細胞增殖活性,以上結果揭示了二甲雙胍同樣可增強肝癌細胞對索拉菲尼的敏感性。

為了探究二甲雙胍誘導化療敏感性的相關機制,我們通過western blot技術檢測了二甲雙胍對上皮間充質(zhì)進程的影響,我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍處理可明顯降低N-cadherin、Snail及Vimentin等間充質(zhì)細胞的標記分子,而提高上皮細胞標記分子E-cadherin的表達,表明二甲雙胍可干預肝癌細胞的上皮間充質(zhì)轉化進程。此外,我們亦探究了二甲雙胍對PI3K/AKT/mTOR通路激活的影響,結果顯示二甲雙胍處理后HepG2細胞中p-PI3K、p-AKT及p-mTOR的表達水平均顯著降低,而總蛋白無明顯變化,表明二甲雙胍可抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活,這或許介導了二甲雙胍對肝癌細胞化療敏感性的提高。二甲雙胍是能量調(diào)控信號分子腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的激動劑,激活AMPK可抑制下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表達,進而調(diào)控細胞的增殖與凋亡等生命進程。激活的PI3K/AKT/mTOR信號通路可通過提高促癌基因缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor,HIF)、cyclin D及c-myc等的轉錄和翻譯促進腫瘤細胞增殖,抑制凋亡,因此,特異性調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活已成為癌癥治療的重要靶標[15]。

綜上,本研究表明二甲雙胍能夠明顯增強肝癌細胞對索拉菲尼的藥物敏感性,促進細胞凋亡并抑制細胞增殖活性,這可能與PI3K/AKT/mTOR通路和上皮間充質(zhì)轉化進程的抑制相關。