曹 劍,張麗敏

(赤峰學院附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 赤峰024000)

本實驗制作小鼠周圍神經(jīng)損傷模型，應用熊果酸(ursolic acid,UA)進行干預,觀察神經(jīng)損傷后PSD95蛋白表達的變化及髓鞘的形態(tài)學變化，分析二者的相關性，探討神經(jīng)損傷后熊果酸對損傷后修復與再生的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

選用BALB/c鼠做動物模型，共320只 (成年健康雄性，20±2 g,赤峰學院基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供)，坐骨神經(jīng)損傷模型制作后，隨機進行分組，將實驗動物模型分為4組，分別是，熊果酸高、中、低劑量干預組和空白對照組；每組再根據(jù)神經(jīng)損傷后時間，隨機分為8組，分別為：12小時，1天，3天，5天、1周、2周，4周，8周，每組隨機分配10只。飼養(yǎng)條件：室溫,普通飲食。

1.2 實驗動物造模

神經(jīng)損傷實驗動物模型制作：實驗動物 BALB/c鼠，應用硫噴妥鈉(1%濃度，100 mg/kg)進行腹腔麻醉,麻醉成功后，將實驗動物俯臥位固定于固定板上,雙下肢及會陰部脫毛，碘伏消毒，取單側(cè)下肢后方，坐骨神經(jīng)走行部位縱切口約1.5 cm,切開皮膚，顯露皮下梨狀肌下，于梨狀肌下顯露坐骨神經(jīng),隨后鈍性分離坐骨神經(jīng)主干,將神經(jīng)主干在坐骨結(jié)節(jié)下約0.5 cm處離斷,顯微鏡下吻合離斷的坐骨神經(jīng),將切口逐層縫合。

1.3 藥物干預

將神經(jīng)損傷模型動物進行腹腔給藥。給藥劑量參照臨床應用熊果酸原藥劑量，進行等效換算[1]，換算后數(shù)值作為熊果酸干預的中等劑量，高劑量組與低劑量組以中等劑量組等比數(shù)列計算確定。通過換算得出各組給藥量數(shù)值分別為：20 mg/kg/d，10 mg/kg/d，5 mg/kg/d。以生理鹽水溶解后按照換算劑量腹腔注射給藥。生理鹽水對照組給予同等體積生理鹽水腹腔注射。熊果酸連續(xù)干預1周。熊果酸純度：>99.6%(T) 購于四川德思特生物有限公司，型號：DX0019。

1.4 實驗動物標本取材及制備

將每組模型動物在設定時間點進行取材，取材步驟如下： 1%硫噴妥鈉100 mg/kg腹腔麻醉后，在各時間點取各組模型動物5只，以原切口切開皮膚，顯露坐骨神經(jīng)，切取坐骨神經(jīng)自吻合口向遠近端延申約3 mm的神經(jīng)干(全長約6 mm)，將神經(jīng)標本標記后迅速浸置于液氮中備用。將每組剩余5只以上述方法切取坐骨神經(jīng)干6 mm，以10%中性甲醛進行固定，72小時后將標本經(jīng)酒精脫水后石蠟包埋備用。

1.5 標本檢測方法

1.5.1神經(jīng)標本PSD95的Real-time PCR檢測 檢測步驟如下：1)引物合成：設計PSD-95(Beacon designer 7軟件)、以GAPDH為引物(表1)，結(jié)果經(jīng)Blast檢索驗證引物的特異性。2)取坐骨神經(jīng)損傷段組織標本，應用Trizol提取總RNA，并以提取的總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA庫。隨后以cDNA庫為模板,進行PSD-95的PCR擴增，在各個反應體系中均加入GAPDH的一對引物作為PCR擴增的內(nèi)參，反應條件為：95℃ 30 s-58℃ 60 s-72℃ 60 s 共進行40個循環(huán)。

表1 PSD-95、GAPDH引物設計

1.5.2LFB髓鞘染色 將甲醛固定72小時后的神經(jīng)標本經(jīng)酒精脫水，石蠟包埋后切片行HE染色。先進行初步篩選，觀察髓鞘的結(jié)構(gòu)及神經(jīng)損傷處增生及恢復情況，通過初步篩選確定LFB染色對象。將初篩后的石蠟標本切片脫蠟后，置入60℃ LFB液中浸泡12小時；隨后應用95%酒精浸泡5分鐘；再加入0.05%碳酸鋰溶液靜置15 s；最后應用70%的酒精進行洗滌，再經(jīng)蒸餾水洗滌后脫水透明封片。

2 結(jié)果

2.1 Real time-PCR結(jié)果

實時定量PCR結(jié)果顯示：在正常BALB/c鼠神經(jīng)組織中PSD-95 mRNA僅有少量表達,而在坐骨神經(jīng)損傷模型中,神經(jīng)損傷節(jié)段的組織中PSD-95 mRNA 的表達在神經(jīng)損傷的初期呈上升趨勢,并且由神經(jīng)損傷后12 h-2 w周期中表現(xiàn)隨時間遞增的趨勢,各模型組組間可見明顯差異，熊果酸高劑量組和中劑量組在各時間點的增加量均低于熊果酸低劑量和生理鹽水對照組。但是在2 w后PSD-95 mRNA的表達量在各劑量組中的表達量呈下降趨勢(見圖1)。

圖1 神經(jīng)損傷后PSD-95的mRNA表達

2.2 神經(jīng)標本髓鞘LFB染色結(jié)果

神經(jīng)標本經(jīng)LFB快藍染色后，神經(jīng)髓鞘顏色表現(xiàn)為淺藍色，而神經(jīng)軸突透明無法著色，圖片背景顯示白色。造模后8周的篩選標本染色結(jié)果顯示：熊果酸高劑量組(H組)和中劑量組(M組)的髓鞘形態(tài)呈規(guī)則排列，并且髓鞘厚度相對均勻；同時觀察到髓鞘的輪廓清晰，局部組織輕度增生；而熊果酸低劑量組(L組)髓鞘形態(tài)不規(guī)則且薄厚不均，髓鞘的輪廓可辨別，神經(jīng)束間結(jié)締組織增生明顯；生理鹽水對照組(B組)髓鞘形態(tài)不規(guī)則，局部可見大量纖維結(jié)締組織增生(見圖2)。

a.高劑量組.b.中劑量組 c.低劑量組 d.對照組

2.3 實驗動物模型標本有髓纖維平均直徑和有髓纖維數(shù)目測定

將各組動物模型LFB染色標本鏡下隨機選取視野進行圖像分析，計算有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目和平均直徑，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果表明,有髓神經(jīng)纖維的數(shù)量和直徑在高、中劑量組顯著高于低劑量組和模型組(P<0.05),表明高級神經(jīng)再生高、中劑量組神經(jīng)損傷后恢復情況優(yōu)于低劑量組和模型組(表2)。

表2 造模8周后各組有髓神經(jīng)纖維數(shù)目及其平均 直徑變化

綜上所述，坐骨神經(jīng)損傷模型中PSD-95 mRNA的變化與神經(jīng)髓鞘LFB染色的有髓神經(jīng)纖維數(shù)目及其平均直徑變化趨勢呈反比。

3 討論

熊果酸是三萜類化合物并以化合物的形式存在于許多天然植物中，有研究表明熊果酸具有抗炎、鎮(zhèn)靜以及降低血糖等功效；同時它還是一種抗氧化劑，在醫(yī)藥和化工領域有廣泛的應用[2]。UA的作用機理是：可以迅速降低ALT、GPT具有降黃疽、增進食欲、緩解纖維化的作用，對肝功能的恢復具有調(diào)節(jié)作用。

當UA濃度(5-15 μmol/L)時對抗谷氨酸受體激動劑紅藻氨酸誘導大鼠海馬神經(jīng)元自由 基形成、線粒體膜電位下降[3]。熊果酸作為一種強抗氧劑，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化- 還原平衡，減少氧化應激造成的損傷，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。但目前，關于其對周圍神經(jīng)損傷后的保護性作用未見報道[4-7]。PSD95(突觸后密度蛋白，postsynaptic density protein 95)又稱為神經(jīng)骨架蛋白，可以反映突觸的形態(tài)和密度。PSD95的結(jié)構(gòu)由N 端3個重復的PDZ和SH3以及C 端的GK 結(jié)構(gòu)域三部分組成。其中PDZ 結(jié)構(gòu)域是其主要功能單元,能夠關聯(lián)和協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)間的功能域，使其特異地與離子通道和相關受體的靶點蛋白的C 端緊密結(jié)合。PSD-95 的第2 個PDZ 結(jié)構(gòu)域可以同時結(jié)合NMDA 受體中NR2B亞基C 端第7個氨基酸和一氧化氮合酶nNOS構(gòu)成NMDAR/PSD-95/nNOS三二聚體[8]。中間結(jié)構(gòu)域SH3則可以結(jié)合Ras 相關效應器蛋白和肌動，具有介導模體的作用。另一個GK 結(jié)構(gòu)域和酵母的胍氨酸激酶具有同源性[9]。有研究表明PSD-95可以關聯(lián)突觸后神經(jīng)元黏附分子neuroligins 和突觸前膜外伸蛋白neurexins，對突觸結(jié)構(gòu)連接和功能的表達具有正向調(diào)節(jié)作用。位于第二和第三個PDZ之間存在的殘基絲氨酸-295 對神經(jīng)元的突觸可塑性具有調(diào)控作用：絲氨酸-295 的磷酸化可以促進PSD-95 的聚集并促進突觸的長時程，相反絲氨酸-295的去磷酸化則抑制突觸的長時程[10]。有研究證實：PSD-95可以將膜蛋白穩(wěn)定在突觸水平，同時還可以調(diào)控膜蛋白的功能，NMDA 受體的門控通道具有PSD-95 劑量依賴性，與此同時PSD-95對鉀通道具有內(nèi)向聚集功效[11-14]。通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)： Real-time PCR的檢驗結(jié)果表明在BALB/c鼠坐骨神經(jīng)損傷后，神經(jīng)損傷段的PSD-95被激活并大量表達，增加了局部的炎性反應和瘢痕增生，抑制了神經(jīng)髓鞘的再生，應用熊果酸后高中劑量組的PSD-95表達明顯低于于低劑量組及對照組。坐骨神經(jīng)損傷后應用熊果酸可以對PSD-95的活化起到持續(xù)抑制作用,達到神經(jīng)損傷后的保護作用，為神經(jīng)的再生創(chuàng)造條件。

通訊作者簡介：張麗敏，女，55歲，醫(yī)學碩士，法學碩士，教授，主任醫(yī)師，赤峰學院附屬醫(yī)院院長，赤峰學院醫(yī)學院院長，郵箱：zlm0476@163.com。