二甲雙胍改善內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗作用的研究

畢欣榮,陳澤姣,陳晨晨,印紅梅*,陳海燕*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 干部病房，吉林 長(zhǎng)春130021；2.長(zhǎng)春市腫瘤醫(yī)院)

二甲雙胍是2型糖尿病的一線用藥，已經(jīng)成為全球應(yīng)用最廣泛的口服降糖藥物，已有確切證據(jù)表明二甲雙胍具有心血管保護(hù)作用，可以降低2型糖尿病患者心血管事件的死亡風(fēng)險(xiǎn)及急性心肌梗死的發(fā)生率，且這種心血管保護(hù)作用可能獨(dú)立于降糖作用之外[1]。目前認(rèn)為二甲雙胍具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化、改善胰島素抵抗、提高心肌供能、抗炎、調(diào)脂、降壓、降體重的綜合作用，但其血管保護(hù)的確切機(jī)制仍然不明確。我們通過(guò)在體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，建立內(nèi)皮細(xì)胞的胰島素抵抗模型，加入藥物二甲雙胍，觀察其對(duì)一氧化氮(NO)，內(nèi)皮一氧化氮合成酶(eNOS)的影響，探討二甲雙胍改善胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 HUVEC由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.2試劑 低糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Fisher Scientific公司)，胰島素(諾和靈R，丹麥諾和諾德公司)，地塞米松(遂成藥業(yè)有限公司)，葡萄糖注射液(中國(guó)大冢制藥有限公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清(GIBCO)，二甲基亞砜(DMSO)(SIGMA公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)Amerson公司)，葡萄糖試劑盒(南京建成生物制品有限公司)，NO試劑盒(南京建成生物制品有限公司)，ET-1試劑盒(南京建成生物制品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立及鑒定 HUVEC 用 5.5 mM 的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。第3至4代內(nèi)皮細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底后，倒掉舊培養(yǎng)基，用 D-Hanks 液輕輕蕩洗 3 次，加入濃度為 0.25%的胰蛋白酶液，鏡下觀察，待大多數(shù)細(xì)胞變圓后，棄消化液，加入 DMEM 培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分散，倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)，然后用 DEME 培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋為 1×105個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于 96 孔板上(接種密度 1×105個(gè))，在 37℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于接種 12 h后，棄去原培養(yǎng)基，用 PBS 洗兩次，將細(xì)胞分為9組，每組6孔，加入200 μl不同胰島素濃度的培養(yǎng)液，其中一組為低糖DMEM培養(yǎng)基，即陰性對(duì)照組。其余8組分別在低糖完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上配制成8種胰島素濃度不同的高糖培養(yǎng)液，配制濃度如下：1×10-2胰島素組(1×10-2mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-3胰島素組(1×10-3mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-4胰島素組(1×10-4mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-5胰島素組(1×10-5mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-6胰島素組(1×10-6mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-7胰島素組(1×10-7mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-8胰島素組(1×10-8mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-9胰島素組(1×10-9mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)，分別于加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后另取一塊 96 孔板，每孔加入工作液200 μl，選取 10 個(gè)孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)液 1-10 μl并加入不同濃度的工作液使系統(tǒng)終體積為 210 μl。分別取各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中的培養(yǎng)基 2 μl分別加入含 200 μl 工作液不同孔中，再加入工作液 8 μl 使系統(tǒng)終體積為 210 μl，另設(shè)空白對(duì)照孔及完全培養(yǎng)基組，加入 2 μl完全培養(yǎng)基，檢測(cè) OD 值計(jì)算平均值。取培養(yǎng)基 2 μl，葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖含量，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)15 min，酶標(biāo)儀震蕩15 min，于492 nm波長(zhǎng)下，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

1.2.2二甲雙胍對(duì)胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用 我們成功的建立了胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞模型，選取1×10-4胰島素組(1×10-4mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)培養(yǎng)液處理的內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對(duì)象，將細(xì)胞分為10組，每組有6個(gè)孔。在普通培養(yǎng)基中添加不同濃度的二甲雙胍，配置成不同濃度的培養(yǎng)液。10組包括陰性對(duì)照組(正常的低糖培養(yǎng)基)，模型組(1×10-4mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM 地塞米松)，二甲雙胍組(共8組，二甲雙胍的藥物濃度分別為：1×103mM、1×102mM/L、1×10 mM/L、1 mM/L、1×10-1mM/L、1×10-2mM/L，1×10-3mM/L、1×10-4mM/L)。各組在給藥后48小時(shí)，棄去上清液，從每孔中吸取2 μl，用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)葡萄糖含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。采用硝基還原酶法測(cè)定一氧化氮的含量，采用放射免疫方法測(cè)定內(nèi)皮素含量，采用方差分析，用SPSS 20.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，P<0.05被認(rèn)為是有顯著的差異，P<0.01代表非常顯著的差異。

1.2.3Western blotting檢測(cè)eNOS表達(dá) 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，可篩選出二甲雙胍的最佳濃度和作用時(shí)間，使用Western blotting方法檢測(cè)eNOS的表達(dá)。通過(guò)目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值來(lái)進(jìn)行比較;使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗模型的成功建立

本實(shí)驗(yàn)組在大量的前期工作中已經(jīng)成功篩選出了內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗模型的最佳胰島素及葡萄糖含量，本次實(shí)驗(yàn)中，再次對(duì)此模型進(jìn)行鑒定，采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖含量。如表1中所示，與對(duì)照組相比，1×10-4胰島素組(1×10-4mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)的上清液中葡萄糖濃度明顯增加，表明葡萄糖消耗顯著降低(P<0.05)，我們認(rèn)為此時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞傾向于胰島素抵抗模型，表明模型建立成功。

表1 胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗

與對(duì)照組相比：*P<0.05,**P<0.01；與10-4mmol/L 胰島素組相比：△P<0.05,△△P<0.01。葡萄糖水平用來(lái)表示,單位mmol/L。

2.2 二甲雙胍對(duì)胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

2.2.1二甲雙胍對(duì)胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞NO和ET-1的影響 在成功鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的胰島素抵抗模型后，我們分別在低糖DMEM培養(yǎng)基上添加不同濃度的二甲雙胍，繼續(xù)作用48小時(shí)，再次進(jìn)行葡萄糖氧化酶法檢測(cè)葡萄糖含量，并檢測(cè)反應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞功能的相關(guān)指標(biāo)NO和ET-1。如表2及表3中所示，當(dāng)藥物二甲雙胍作用48 h后，與對(duì)照組相比，在103-10-4mM二甲雙胍組葡萄糖含量均明顯減少(P<0.05)，表明二甲雙胍對(duì)胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞葡萄糖消耗具有顯著改善作用。在10-1-10-3mM的二甲雙胍組NO含量顯著增加(P<0.05)，NO和葡萄糖沒(méi)有表現(xiàn)出明顯相關(guān)性(P>0.05)，反映出該藥物可直接增加血管內(nèi)皮NO含量，而不依賴于葡萄糖含量的變化。ET-1的水平在10-1-10-3mM藥物組顯著性減少(P>0.05)，ET-1與葡萄糖也沒(méi)有表現(xiàn)出明顯相關(guān)性(P>0.05)，表明二甲雙胍在同一時(shí)間，降低了ET-1水平。

2.2.2二甲雙胍對(duì)胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)的影響 通過(guò)檢測(cè)了胰島素抵抗的血管內(nèi)皮細(xì)胞模型組(IR組)，陰性對(duì)照組即低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞(NC組)和4組濃度不同的二甲雙胍組(二甲雙胍濃度分別為1×10-1mM、1×10-2mM、1×10-3mM、1×10-4mM)，通過(guò)半定量的分析方法檢測(cè)eNOS的表達(dá)，見表4、圖1。胰島素抵抗模型組的血管內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS表達(dá)比陰性對(duì)照組中正常血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少，而加入不同濃度的二甲雙胍后胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS的表達(dá)均有明顯的增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中1×10-3mM的二甲雙胍組eNOS的表達(dá)最強(qiáng)。

表2 二甲雙胍處理HUVEC后NO 和ET-1的表達(dá)

A與模型對(duì)照組相比：P<0.01；b與陰性對(duì)照組相比：P<0.01；NO和ET1的水平用來(lái)表示,單位mmol/L。

表3 二甲雙胍處理HUVEC后血糖、NO 和ET-1的相關(guān)性

N=陰性，P=陽(yáng)性 (P<0.05)

IR，insulin resistance，胰島素抵抗；NC，Negative control，陰性對(duì)照組

eNOS/β 肌動(dòng)蛋白IRNCmetformin0.051±0.1160.236±0.198a0.736±0.211ab

acompare to IR,P<0.01；bcompare to NC,P<0.05。

3 討論

血管內(nèi)皮功能異常是糖尿病血管病變的重要機(jī)制之一，目前認(rèn)為胰島素抵抗與內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂明顯相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，生理濃度的胰島素可以刺激機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO，起到舒張血管、增加血流的作用；但胰島素抵抗的病人由于其自身對(duì)胰島素的敏感性降低，NO的生成也相應(yīng)減少，對(duì)血管的保護(hù)作用隨之減弱[2]。胰島素抵抗對(duì)脂質(zhì)代謝也產(chǎn)生明顯影響，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，脂蛋白脂酶的敏感性降低，使得高密度脂蛋白生成減少，低密度脂蛋白生成增多，低密度脂蛋白是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。而胰島素抵抗是通過(guò)何種方式導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的，目前尚不明確。

目前胰島素抵抗內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制研究主要是采用動(dòng)物模型和體外細(xì)胞模型，而后者由于其快速、簡(jiǎn)便、節(jié)約的優(yōu)勢(shì)，發(fā)展迅速。本課題組采用葡萄糖/胰島素/地塞米松多種藥物聯(lián)合作用進(jìn)行體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)，成功建立了胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞模型。我們篩選出了建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗模型的最佳胰島素及葡萄糖含量，通過(guò)葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖含量。與普通的DMEM低糖培養(yǎng)基相比，1×10-4胰島素組(1×10-4mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)的上清液中葡萄糖濃度明顯增加，葡萄糖消耗顯著降低，這組內(nèi)皮細(xì)胞成為最佳的胰島素抵抗模型。

目前有大量的臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果證實(shí)二甲雙胍對(duì)糖尿病的心腦血管并發(fā)癥具有降糖作用以外的很多益處，可以改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能,可能與二甲雙胍可增加eNOS的磷酸化及其表達(dá)，從而增加血漿NO水平及降低全身血管阻力，起到改善內(nèi)皮功能的作用[4，5]。而胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，胰島素受體依賴的磷脂酰肌醇 3-激酶活性降低導(dǎo)致 NO 合成及釋放下降，內(nèi)皮細(xì)胞失去 NO 的保護(hù)作用，從而加重粥樣硬化的病理變化[6]。胰島素抵抗可抑制eNOS活性使內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO減少，血管舒張功能進(jìn)一步下降。而ET-1是一種強(qiáng)效的血管舒縮因子，NO 與 ET-1 是一對(duì)互相制約的因素，共同發(fā)揮作用維持血管內(nèi)皮的平衡。而 eNOS 是激活 NO 發(fā)揮其生物學(xué)作用的重要物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的二甲雙胍處理后均出現(xiàn)血管內(nèi)皮NO含量增加、ET-1水平下降，NO和ET-1之間呈負(fù)相關(guān)，且上述改變不依賴于葡萄糖含量的變化。同時(shí)我們通過(guò)半定量的分析方法檢測(cè)eNOS的表達(dá)情況。如圖1所示，胰島素抵抗的血管內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS表達(dá)較正常血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少，而加入不同濃度的二甲雙胍后胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS的表達(dá)均有明顯的增強(qiáng)，這與Noble等人的研究結(jié)果一致，他們均認(rèn)為二甲雙胍激活了內(nèi)皮細(xì)胞AMPK活性，從而增強(qiáng)eNOS磷酸化及表達(dá)，達(dá)到改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用[7]。

二甲雙胍作用于胰島素抵抗的內(nèi)皮細(xì)胞后，可以有效的升高NO水平，降低ET-1水平，增強(qiáng)eNOS的表達(dá)；在eNOS的作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)上調(diào)NO和下調(diào)ET-1而起到對(duì)抗胰島素抵抗、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、對(duì)抗粥樣硬化的作用。關(guān)于二甲雙胍保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，還有很多其他的機(jī)制參與其中。Goldberg等人[5]在一項(xiàng)應(yīng)用二甲雙胍14年的研究中發(fā)現(xiàn)該藥物可以增加應(yīng)用者腸道中嗜黏蛋白-艾克曼菌的含量，調(diào)控腸道菌群達(dá)到降糖及抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。也有研究表明二甲雙胍可通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管緊張素II受體1表達(dá)，而達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮功能，減緩糖尿病患者心血管事件發(fā)生的有益作用[8]。

綜上，二甲雙胍是2型糖尿病患者的首選口服降糖藥物，其確切的心血管保護(hù)作用已得到廣泛認(rèn)可。本研究進(jìn)一步證實(shí)了二甲雙胍改善胰島素抵抗的血管內(nèi)皮功能與增強(qiáng)eNOS表達(dá)、升高NO水平有關(guān)，但確切機(jī)制還有待深入研究。