沈世超 李俊卿 劉維信

摘 要：以具有肉質根的未知白菜材料‘14-16及蕓薹種內其他有/無肉質根的類型為研究對象，利用分子標記探究幾類蔬菜特別是具有肉質根的‘14-16白菜材料與其他蕓薹種蔬菜的親緣關系。UPGMA 聚類結果表明：遺傳相似系數(shù)為0.62時，15份材料分為2類，第1類均為無肉質根類型；‘14-16與有肉質根的蕪菁和薹菜歸為第2大類，但親緣關系有一定距離。普通白菜‘黃渡矮青菜和大白菜‘北京新三號也屬于第2類，說明蕓薹種內肉質根類型材料的遺傳組成有一定的相似性，但也存在復雜性。

關鍵詞：蕓薹種；肉質根；親緣關系

中圖分類號 S634 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）07-0009-04

Abstract：In this study，the unknown material ‘14-16 with fleshy roots and other types of Brassica campestris L. with/without fleshy roots were used as research materials to explore the relationship between these vegetables，especially the ‘14-16 and other vegetables with fleshy root. The results of UPGMA clustering showed that when the genetic similarity coefficient was 0.62，15 materials were divided into two categories，and the first group was no fleshy root type；‘14-16 is classified as the second group with turnips and Tai-tsai，they all have fleshy roots.Pakchoi 'Huangdu' and Chinese Cabbage ‘Beijing New 3 also belong to the second category. The above results indicate that the genetic composition of the fleshy root type materials in the alfalfa species has certain similarities，but there are also complexities.

Key words：Brassica compestris L.；Fleshy root；Genetic relationship

常見的蕪菁、蘿卜等具有肉質根的蔬菜多為耐寒或半耐寒蔬菜[1]。蕓薹種的薹菜在華北地區(qū)能夠露地越冬，研究者認為其抗寒性與越冬前形成的肉質根有關[2]。筆者在資源收集中發(fā)現(xiàn)了少見的具有肉質根的不結球類型白菜材料‘14-16，葉片具少量毛刺，葉形似大白菜葉，其能在青島地區(qū)連續(xù)2年露地越冬，并于春天返青。而一般的白菜類蔬菜根系雖然發(fā)達，但不具肉質根，如果沒有保溫設施，基本無法在山東半島地區(qū)內越冬。因此，‘14-16在肉質根性狀遺傳和抗凍性育種方面具有重要的研究價值，但目前仍不清晰其遺傳關系。蕓薹種分子標記的研究開展較早[3，4]，研究結果均表明，種內具有豐富的遺傳多樣性，而針對蕓薹種內肉質根蔬菜親緣關系及肉質根形成相關的標記的研究報道目前仍較少。為此，本研究以具有肉質根的‘14-16為主要研究對象，利用分子標記手段，通過與具肉質根的蕪菁、薹菜及無肉質根的普通白菜等蕓薹種蔬菜進行種內的遺傳比較，分析幾種蔬菜的親緣關系，特別是‘四季小白菜與其他蕓薹種肉質根蔬菜的親緣關系，為探究蕓薹種肉質根蔬菜的親緣關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗選取15分材料，包括不具肉質根的3份大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis Olsson）、4份普通白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. communis Tsen et Lee）、2份烏塌菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee），能夠形成肉質根的3份薹菜（Brassica campestris L.ssp. Chinensis（L.）Makino var. tai-tsai Hort）、2份蕪菁（Brassica campestris L. ssp. rapi fera Matzg）和不結球的白菜材料‘14-16。材料名稱、來源肉質根性狀見表1。

1.2 DNA提取和檢測 15份試驗材料于2018年4月6日播種在青島市城陽區(qū)青島農(nóng)業(yè)大學實驗基地。5月10日，對每個材料選擇3～4個單株的嫩葉混合取樣，采用CTAB法提取基因組DNA。用0.7%～1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計（美國Thermo NanoDrop 2000）進行DNA質量、純度和濃度檢測，將基因組DNA濃度稀釋至50ng/μL，-20℃保存。

1.3 引物合成 本試驗前期以烏塌菜‘小八葉ב平度薹菜的4個回交后代自交系及2個親本為材料對蕓薹屬基因組數(shù)據(jù)庫（http：//brassicadb.org/brad/index.php）中的325對引物進行了鑒定，從中選擇了49對擴增條帶清晰、可重復、具有多態(tài)性的引物用于本次試驗。引物由青島擎科生物科技有限公司合成，引物位置及序列信息見表2。

1.4 PCR擴增及檢測 PCR反應總體系為20μL，包含10×PCR Buffer（含25mmol/L MgCl2）2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq 酶0.2μL，模板DNA（50ng/μL）1.0μL，上下游引物各1.0μL（10μmol/μL），ddH2O 14.4μL。PCR擴增程序：94℃預變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)，72℃延伸7min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行分離檢測，180V、130mA條件下，電泳100min。用銀染顯色法檢測電泳結果。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 選擇清晰可辨的電泳條帶，以1和0記錄多態(tài)片段的有和無，在同一位置上出現(xiàn)的電泳條帶記為“1”，同一位置沒有出現(xiàn)的帶記為“0”，以獲得矩陣。采用NTSYSpc（2.1e版）軟件分析供試材料的遺傳相似系數(shù)，采用非加權平均法（UPGMA）進行聚類分析并繪圖[5]。

2 結果與分析

本試驗對49對引物的擴增產(chǎn)物進行了聚丙烯凝膠電泳，引物覆蓋6條染色體，15個材料共獲得99條譜帶，其中89條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為89.89%。每條引物擴增出2～6條清晰條帶，擴增結果見圖1。

根據(jù)引物的檢測結果，通過UPGMA方法聚類分析后得到供試材料的聚類圖（圖2）。群體的遺傳相似性系數(shù)介于0.48～0.83，表明15個材料間存在較大的遺傳差異。當相似系數(shù)在0.62時，15個材料分為兩大類。第1類均為無肉質根的材料，包括3份普通白菜、2份烏塌菜和2份大白菜。第2類包括有肉質根的3份薹菜、2份蕪菁和未知的‘14-16材料，還包括無肉質根的大白菜‘北京新3號、普通白菜‘黃渡矮青菜。在第2大類中，材料‘14-16（9號）單獨列為一類，與其他材料在遺傳關系上有一定距離。在所有15個材料中，‘14-16與‘金黃蔓菁相似系數(shù)最高，為0.72，與第1大類中的‘新夏青5號相似系數(shù)最低（0.55），其次為‘金夏蒔（0.56）。以上結果可以看出，具有肉質根性狀的蕓薹種白菜，與無肉質根的類型在遺傳關系上存在一定距離。

3 結論與討論

本研究利用來源于蕓薹屬數(shù)據(jù)庫中的標記引物分析了未知白菜材料‘14-16與蕓薹種蔬菜中具有肉質根和不具有肉質根的代表類型之間的遺傳關系。結果顯示，具有肉質根的材料在聚類關系中均歸于一類，與無肉質根的蕓薹種類型具有一定的遺傳差異。說明在肉質根性狀上來源于白菜基因組的引物能較好地反映蕓薹種群體的遺傳組成。在聚類圖中，“黃渡矮青菜”和“北京新3號”雖無明顯肉質根形成，但仍與肉質根類型劃分為同一大類，推測可能與它們的遺傳來源不同有關。在后期的研究中，應進一步擴大引物在染色體組上的分布范圍，并增加不同類型測試材料的數(shù)量，以獲得更精確的聚類結果。

參考文獻

[1]羅丹，吳委林，周波，等.蕪菁SSR引物的開發(fā)及多態(tài)性分析[J].生物技術通訊，2012，23（03）：402-406.

[2]劉倩倩，孫艷，劉維信，等.薹菜肉質根發(fā)育過程中糖積累及蔗糖代謝相關酶活性變化[J].植物生理學報，2016，52（11）：1546-1544.

[3]李光光，黃紅弟，張華，等.利用SSR分子標記研究白菜類亞種資源的遺傳多樣性[J].熱帶作物學報，2017，38（07）：1316-1322.

[4]劉冬媛，王新華，劉楊，等.不結球白菜品種（系）遺傳多樣性與親緣關系的SSR分析[J].分子植物育種，2014，12（03）：499-508.

[5]李桂花，陳漢才，張艷，等.小白菜種質遺傳多樣性與親緣關系的SRAP和SSR分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2017，44（05）：37-45.

（責編：張宏民）