寧金梅，吳 平，鈕 燕，趙樹波，孫 勇

（1．曲靖市第一人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，云南 曲靖 655000；2．昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 耳鼻喉科，云南 昆明 650101）

已進(jìn)行了大量關(guān)于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在生理和病理情況下生物學(xué)行為的研究，MMPs通過降解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜和其它蛋白，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[1-12]。其中最重要的是明膠酶，包括明膠酶A（MMP-2）和明膠酶B（MMP-9），其相對分子質(zhì)量MMP-9為92 000（92KD），MMP-2為72 000（72KD），又稱IV 型膠原酶，可有效降解基底膜的主要成分IV型膠原及明膠，還降解V，VII，X型膠原，彈性蛋白和層粘蛋白等，因此導(dǎo)致組織水腫、血管內(nèi)細(xì)胞通過血管內(nèi)皮基底膜遷移到血管外而引起一序列病理變化。有研究表明：MMP-2和MMP-9參與組織結(jié)構(gòu)重塑，在炎癥和腫瘤中表達(dá)量都顯著增高[13,14]。研究發(fā)現(xiàn)MMP9的基質(zhì)降解作用比MMP2 高出近25倍，MMP9 在粘膜內(nèi)胃癌轉(zhuǎn)移中的作用比MMP2更強(qiáng)[15-18]。我們前期研究已證實(shí)，聲帶息肉組MMP-2和MMP-9 陽性單位均值均＞正常聲帶組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）?，F(xiàn)進(jìn)一步對MMP-2和MMP-9在聲帶息肉中表達(dá)進(jìn)行比較，并進(jìn)行相關(guān)性研究，以進(jìn)一步探討聲帶息肉的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療聲帶息肉提供新的思路和理論依據(jù)。

資料與方法

一、臨床資料 實(shí)驗(yàn)組：選擇近年聲帶息肉患者標(biāo)本35例，其中男性22例，女性13例，年齡24～62 歲，平均年齡為41歲，病程1月～8年，均經(jīng)病理診斷確診，且排除其他聲帶病變。所有患者均為初次手術(shù)。對照組：正常聲帶組織標(biāo)本18例（因非喉部疾病死亡24～48h內(nèi)的尸體標(biāo)本，或病理科保存的正常聲帶組織標(biāo)本蠟塊）。

二、試驗(yàn)方法 2組標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，作4μm 厚的連續(xù)切片，HE染色，選取標(biāo)本中細(xì)胞成分多的部位作切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

三、結(jié)果判斷 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：與邁新公司的陽性對照片中陽性細(xì)胞相比。相同或比其深者為陽性，比其弱或沒有染色者為陰性。MMP-2和MMP-9 均以細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色為陽性細(xì)胞，將每張切片著色強(qiáng)度與著色細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分級(jí)。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：0～5%為-，6%～15%為±，16%～25%為+，26%～50%為++，＞50%為+++。陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度：-無著色或染色與邁新公司的陽性對照片中陽性細(xì)胞相比比其弱，+黃色，++棕黃色，+++棕色。

四、圖像定量分析 應(yīng)用Nikon Eclipse 50i計(jì)算機(jī)圖像分析儀，在400 倍鏡下對行MMP-2 和MMP-9 染色的切片每張隨機(jī)選取3個(gè)視野的上皮細(xì)胞和相鄰的細(xì)胞間質(zhì)。因聲帶息肉病理組織學(xué)變化多樣，為增加研究的可比性，在MMP-2 和MMP-9 的連續(xù)切片中，選取的視野相同。用Nikon Mivnt 顯微圖像分析軟件（WindowsXP版），每個(gè)視野隨機(jī)圈定3個(gè)陽性單位（3個(gè)陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)），測定這3個(gè)陽性單位均值代表該視野的陽性單位均值。用陽性單位均值表示被染色物質(zhì)的多少，陽性單位均值越大，說明物質(zhì)的相對含量越高，即抗原物質(zhì)表達(dá)的水平越高，反之亦然。

結(jié) 果

一、免疫組化觀察結(jié)果

1．MMP-2 在正常聲帶和聲帶息肉中的表達(dá)MMP-2 定位于細(xì)胞漿，細(xì)胞核無著色。陰性對照片中未見陽性反應(yīng)。MMP-2在正常聲帶和聲帶息肉中均呈程度不一的陽性反應(yīng)，MMP-2在正常聲帶組中，陽性反應(yīng)主要位于炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞。在炎性細(xì)胞的表達(dá)：計(jì)數(shù)和表達(dá)強(qiáng)度均大多為++；在成纖維細(xì)胞的表達(dá)：計(jì)數(shù)為－～+，表達(dá)強(qiáng)度為－～++。血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、橫紋肌及軟骨細(xì)胞也有表達(dá)，但表達(dá)較弱，見圖1。MMP-2 在聲帶息肉組中，陽性反應(yīng)主要位于上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞、和血管內(nèi)皮細(xì)胞。在上皮細(xì)胞的表達(dá)：計(jì)數(shù)和表達(dá)強(qiáng)度均為+～++；在成纖維細(xì)胞的表達(dá)：計(jì)數(shù)為±～++，表達(dá)強(qiáng)度為+～++；在炎性細(xì)胞的表達(dá)：計(jì)數(shù)為：±～+，表達(dá)強(qiáng)度大多為++；在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)：計(jì)數(shù)為：－～+，表達(dá)強(qiáng)度：－～++，大多為++。在間質(zhì)也有表達(dá)，見圖2～4。

2．MMP-9 在正常聲帶和聲帶息肉中的表達(dá)

MMP-9在正常聲帶組中，陽性反應(yīng)主要位于炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。不同的標(biāo)本中各種細(xì)胞的表達(dá)可不一樣，常以某一種細(xì)胞的表達(dá)為主，表達(dá)計(jì)數(shù)大多為+，強(qiáng)度多為+～++。也表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、橫紋肌和軟骨細(xì)胞，見圖5。在聲帶息肉組中，幾乎所有切片上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞、和血管內(nèi)皮細(xì)胞都明顯表達(dá)MMP-9。在上皮細(xì)胞的表達(dá)：計(jì)數(shù)和表達(dá)強(qiáng)度均在+～++之間；在成纖維細(xì)胞的表達(dá)：計(jì)數(shù)大多為+～+++，表達(dá)強(qiáng)度大多為++；在炎性細(xì)胞的表達(dá)：計(jì)數(shù)多為+～+++，表達(dá)強(qiáng)度大多為++；在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)：計(jì)數(shù)多為+～+++，表達(dá)強(qiáng)度大多為++，見圖6～9。

結(jié) 果

一、正常聲帶和聲帶息肉MMP-2陽性單位均值比較

正常聲帶和聲帶息肉組間MMP-2陽性單位均值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1，聲帶息肉組陽性單位均值（30.5666±7.18438）＞正常聲帶組（16.1361±4.32634）。

二、正常聲帶和聲帶息肉MMP-9陽性單位均值比較

正常聲帶和聲帶息肉組間MMP-9陽性單位均值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2，聲帶息肉組陽性單位均值（42.9661±9.80116）＞正常聲帶組（16.6147±8.48336）。

三、聲帶息肉組織中MMP-9與MMP-2陽性單位均值比較

聲帶息肉組中MMP-9與MMP-2陽性單位均值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3，MMP-9陽性單位均值（42.9661±9.80116）＞MMP-2（30.5666±7.18438）。

四、聲帶息肉組織中MMP-9與MMP-2表達(dá)的相關(guān)性分析

在進(jìn)行相關(guān)性分析之前先用聲帶息肉中MMP-9 和MMP-2陽性單位均值做散點(diǎn)圖，兩變量之間不存在線性趨勢，見圖10，說明沒有相關(guān)性，未做pearson相關(guān)分析。

討 論

聲帶是聲音的振動(dòng)器官，聲音產(chǎn)生的質(zhì)量取決于聲帶獨(dú)特的層次結(jié)構(gòu)。對聲帶本身而言，其張力大小、長短、厚薄，皆對聲音高低有影響[19]。聲帶固有層是與聲帶的發(fā)音功能直接相關(guān)的重要組織結(jié)構(gòu)，特別是固有層淺層的形態(tài)和緊張度決定了聲帶振動(dòng)的特性。發(fā)聲過程中，聲帶振動(dòng)最明顯的是任克氏間隙，大多數(shù)聲帶病變起源于固有層，如果這一層出現(xiàn)炎癥、新生物和瘢痕，聲帶就會(huì)變得僵硬，振動(dòng)就會(huì)受到影響，音質(zhì)就會(huì)發(fā)生改變[20]。細(xì)胞外基質(zhì)的清除和合成之間的平衡是維持聲帶正常形態(tài)和功能的重要機(jī)制，聲帶息肉和Reinke's間隙水腫可能是基質(zhì)的降解與合成失衡所致。細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)涉及許多蛋白質(zhì)成分，如膠原和彈性蛋白，這些蛋白質(zhì)的降解或再生由基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs），如明膠酶和彈性蛋白酶等的控制，而MMPs則受金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs） 調(diào)控。正常的細(xì)胞外基質(zhì)有賴于基質(zhì)蛋白、MMPs和TIMPs間的平衡。基底膜（basement membrane,BM） 是細(xì)胞和結(jié)締組織交界處的細(xì)胞外基質(zhì)，代表細(xì)胞外骨架、具有結(jié)構(gòu)支持，細(xì)胞附著和選擇濾過的功能。

在正常生理情況下，MMPs能調(diào)節(jié)細(xì)胞粘著、作用于細(xì)胞外成分或其它蛋白成分而啟動(dòng)潛在生物學(xué)功能、直接或間接參與胚胎發(fā)育、組織模型再塑及創(chuàng)傷修復(fù)等正常生理功能[21]。病理情況下，MMPs 在炎癥反應(yīng)、血管生成及腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[22-24]。Vaiva Lesauskaite等[25]用免疫組織化學(xué)方法研究MMP-2和MMP-9在聲帶息肉組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示：MMP-9在上皮細(xì)胞的表達(dá)無論是聲帶息肉組還是正常聲帶組都顯著強(qiáng)于MMP-2 的表達(dá)，這支持我們的研究結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中，用聲帶息肉中MMP-9和MMP-2陽性單位均值做散點(diǎn)圖，兩變量之間不存在線性趨勢，說明沒有相關(guān)性。我們推測MMP-9和MMP-2在聲帶息肉的表達(dá)可能存在著獨(dú)立的調(diào)節(jié)機(jī)制，MMP-9和MMP-2 的上調(diào)或下調(diào)不會(huì)影響另一方的表達(dá)。

表1 正常聲帶和聲帶息肉MMP-2 陽性單位均值比較

表2 正常聲帶和聲帶息肉MMP-9 陽性單位均值比較

表3 聲帶息肉組織中MMP-9與MMP-2陽性單位均值比較

圖1 MMP-2 在正常聲帶上皮和固有層中的表達(dá)（免疫組化MaxVisionTM法，×200）；

圖3 MMP-2 在聲帶息肉組織中的表達(dá)，著色于上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞（免疫組化MaxVisionTM 法，×400）；

圖4 MMP-2在聲帶息肉組織中的表達(dá)，著色于纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞（免疫組化MaxVisionTM法，×400）；

圖5 MMP-9 在正常聲帶組織固有層中的表達(dá)，主要著色于纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞（免疫組化MaxVisionTM 法，×200）；

圖6 MMP-9 在聲帶息肉組織中的表達(dá)，主要著色于炎性細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞（免疫組化MaxVisionTM×200）；

圖7 MMP-9 在聲帶息肉組織中的表達(dá)，主要著色于上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞（免疫組化MaxVisionTM 法，×200）；

圖8 MMP-9 在聲帶息肉組織中的表達(dá)，主要著色于纖維結(jié)締組織和血管壁（免疫組化MaxVisionTM 法，×400）；

圖9 MMP-9 在聲帶息肉組織中的表達(dá)，主要著色于血管內(nèi)皮細(xì)胞（免疫組化MaxVisionTM 法，×200）；

圖10 聲帶息肉組織中MMP-9 和MMP-2 陽性單位均值散點(diǎn)圖。

MMP-9和MMP-2在聲帶息肉中的表達(dá)明顯＞正常聲帶組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們推測明膠酶可能在聲帶息肉的病理生理方面發(fā)揮著重要作用，參與了組織結(jié)構(gòu)的重塑。MMP-9和MMP-2在聲帶息肉組織中的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，MMP-9的表達(dá)明顯＞MMP-2，表明在聲帶息肉的發(fā)生發(fā)展中MMP-9似乎起到了更重要的作用。MMP-9和MMP-2 在聲帶息肉中的表達(dá)可能存在著獨(dú)立的調(diào)節(jié)機(jī)制，其中一方的表達(dá)不受另一方的影響。對于聲帶息肉病人，同時(shí)抑制MMP-2和MMP-9，可望成為一種更好的治療方案。