基于電子鼻和GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同原料釀造黃酒風(fēng)味品質(zhì)的比較研究

葛東穎，龍旭霞，楊成聰，趙慧君，張振東，郭壯

（湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽441053）

黃酒是以稻米和黍米為主要原料，經(jīng)加曲、酵母等糖化發(fā)酵劑釀制而成的發(fā)酵酒，具有口感清爽、營養(yǎng)豐富和香氣濃郁的優(yōu)點(diǎn)[1]。作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品，黃酒的制作工藝較為簡(jiǎn)單，且制作環(huán)境較為粗放，釀造原料[2]、發(fā)酵菌種[3]、發(fā)酵[4]和陳釀[5]工藝都會(huì)對(duì)其品質(zhì)產(chǎn)生較大的影響。雖然近年來有研究人員探討了玉米淀粉[6]、麥芽糖漿[7]、金柑[8]和薏米葛根[9]釀造黃酒的可行性，但糯米和大米仍是黃酒生產(chǎn)的主要原料。本研究團(tuán)隊(duì)采用電子舌技術(shù)對(duì)以大米、秈糯米和粳糯米為原料釀造干黃酒（含糖量＜15.0 g/L）的滋味品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以秈糯米和粳糯米為原料釀造的黃酒其滋味品質(zhì)要優(yōu)于大米[10]。除滋味品質(zhì)外，風(fēng)味品質(zhì)亦是黃酒品質(zhì)的重要組成部分，然而目前關(guān)于不同原料釀造黃酒風(fēng)味品質(zhì)影響的評(píng)價(jià)尚少。

目前研究人員常采用電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 （gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)食品的風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)[11]。GC-MS 技術(shù)可以快速檢測(cè)和識(shí)別食品或農(nóng)產(chǎn)品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[12]，具有迅速、準(zhǔn)確和重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，在產(chǎn)品品質(zhì)判別[13]、成分分析[14]、風(fēng)味圖譜構(gòu)建[15]和農(nóng)殘檢測(cè)[16]中具有廣泛的應(yīng)用。而電子鼻技術(shù)可以迅速對(duì)食品中特定的敏感物質(zhì)類型進(jìn)行定性評(píng)價(jià)，具有重復(fù)性和可靠性高且不受主觀因素影響等優(yōu)點(diǎn)[17]，已經(jīng)在黃酒酒齡鑒定[18]、食品品質(zhì)檢測(cè)[19]、黃曲霉毒素B1 評(píng)價(jià)模型構(gòu)建[20]和水果成熟度識(shí)別[21]方面得到了應(yīng)用。

本研究采用電子鼻和GC-MS 聯(lián)用技術(shù)對(duì)秈糯米、大米和粳糯米釀造黃酒風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，探討了原料種類對(duì)黃酒風(fēng)味品質(zhì)的影響，以期為后續(xù)黃酒品質(zhì)的提升提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米、粳糯米、秈糯米和麥曲：市售；氯化鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；黃酒專用釀酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

GCMS-QP2020 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；PEN3 電子鼻：德國Airsense 公司；3-18k 離心機(jī)：德國SIGMA 實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)股份有限公司；CET-Z7F1G5蒸飯柜：永康市搜瑪特貿(mào)易有限公司；SPX-100B-Z 生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：邦西儀器科技（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大米、粳糯米和秈糯米樣品采集

5 個(gè)秈糯米樣品分別采集自湖北省襄陽市和孝感市、江蘇省泰州市、黑龍江省牡丹江市和福建龍巖市；5個(gè)大米樣品分別采集自湖北省襄陽市、江蘇省泰州市、寧夏回族自治區(qū)吳忠市、黑龍江省五常市和遼寧省盤錦市；5 個(gè)粳糯米樣品分別采集自四川省成都市、江蘇省泰州市、廣州壯族自治區(qū)桂林市、黑龍江五常市和福建省龍巖市。

1.2.2 黃酒制作

取秈糯米、大米或粳糯米300 g 加入700 mL 蒸餾水，于20 ℃浸漬12 d 后蒸煮30 min 備用。采用攤飯法冷卻至室溫，加0.3 g 酒母、47 g 麥曲、235 mL 清水和175 mL 漿水?dāng)嚢杈鶆颍?8 ℃發(fā)酵7 d，18 ℃發(fā)酵14 d 后離心取上清液備用[22]。

1.2.3 基于電子鼻技術(shù)對(duì)黃酒風(fēng)味的評(píng)價(jià)

準(zhǔn)確吸取20 mL 黃酒樣品于120 mL 樣品瓶中，45 ℃保溫15 min 后插入電子鼻探頭吸取頂端空氣測(cè)定敏感物質(zhì)類型。電子鼻參數(shù)設(shè)置：樣品間隔時(shí)間1 min，自動(dòng)清洗時(shí)間95 s，歸零時(shí)間5 s，插入時(shí)間5 s，測(cè)定時(shí)間90 s，吸氣流量180 mL/min，進(jìn)樣流量180 mL/min。金屬傳感器在60 s 后基本穩(wěn)定，選定65、66 s 和67 s時(shí)響應(yīng)值，并計(jì)算其平均值，重復(fù)操作5 次。

1.2.4 基于GC-MS 技術(shù)對(duì)黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

頂空進(jìn)樣處理：準(zhǔn)確吸取8 mL 黃酒樣品于25 mL樣品瓶中，加入2 g 氯化鈉，振蕩至完全溶解，55 ℃預(yù)熱30 min，平衡2 min，進(jìn)樣1 μL，進(jìn)樣口解析3 min 后進(jìn)入GC-MS 分析。GC 條件：色譜柱為SH-Rtx-Wax極性毛細(xì)管柱（30 m×2.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：起始溫度30 ℃，保持4 min，以3 ℃/min 升到45 ℃，保持10 min，然后以10 ℃/min 升到130 ℃，不保持，然后以15 ℃/min 升到200 ℃保持7 min；傳輸線溫度150 ℃；進(jìn)樣口溫度200 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比為8∶1；載氣流量：1.0 mL/min；載氣為高純He（＞99.999 9%）和高純N2（＞99.999 9%）。MS 條件：EI 離子源；離子源溫度230 ℃；連接口溫度260 ℃；電子轟擊能量：70 eV；檢測(cè)器電壓相對(duì)于調(diào)諧結(jié)果0.1 kV；質(zhì)量掃描范圍范圍33.00 amu～450 amu；采集方式：Q3 Scan；采用保留指數(shù)和NIST14 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫定性，并采用峰面積歸一化對(duì)樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量進(jìn)行分析。每個(gè)樣品平行測(cè)試3 次。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用主成分分析法（principal component analysis，PCA）、典范對(duì)應(yīng)分析法（canonical correlation analyses，CCA）、聚類分析（cluster analysis，CA）和多變量方差分析法（multivariate analysis of variance，MANOVA）對(duì)不同原料釀造黃酒的整體性風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)對(duì)造成不同原料釀造黃酒風(fēng)味品質(zhì)差異的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行甄別。除PCA 采用past 3 軟件外，其他分析均采用MATLAB 2017b 軟件。采用MATLAB 2017b 繪制熱圖，其他圖均采用origin 8.5 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于電子鼻技術(shù)評(píng)價(jià)黃酒風(fēng)味

GB/T13662-2008《黃酒》中約束優(yōu)級(jí)黃酒的香氣應(yīng)具有黃酒特有的濃郁醇香，且無異香，因此本研究首先采用電子鼻技術(shù)對(duì)不同原料釀造黃酒的風(fēng)味進(jìn)行了評(píng)價(jià)。由PCA 可知，第一主成分（PC1）主要是由W1S、W5S 和W6S 3 個(gè)金屬傳感器構(gòu)成，其占所有變量權(quán)重的97.44%，而第二主成分（PC2）主要是由W2W、W1W、W3S、W1C、W5C、W3C 和W2S 7 個(gè)金屬傳感器構(gòu)成并占所有權(quán)重的2.36%。不同原料釀造黃酒整體風(fēng)味品質(zhì)的PC1 與PC2 因子得分圖如圖1所示。

圖1 不同原料釀造黃酒風(fēng)味品質(zhì)的主成分分析Fig.1 Evaluation of the flavor profile characterization of yellow rice wine fermented by different raw materials based on principal component analysis

由圖1可知，以秈糯米為原料釀造的黃酒樣品全部分布在第二象限；以大米和粳糯米為原料釀造的黃酒樣品分布在第三象限和第四象限。由此可見，盡管不同原料釀造的黃酒樣品在空間排布上出現(xiàn)了部分重合，但亦表現(xiàn)出一定的分離趨勢(shì)，這說明不同原料釀造的黃酒其風(fēng)味品質(zhì)可能存在一定差異。本研究采用CCA 這一有監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)不同原料釀造黃酒的風(fēng)味進(jìn)行了進(jìn)一步分析，其結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，不同原料釀造的黃酒樣品在空間排布上顯現(xiàn)出明顯分離趨勢(shì)，這說明不同原料釀造的黃酒在風(fēng)味品質(zhì)上存在較大差異，也進(jìn)一步驗(yàn)證了PCA結(jié)果的正確性。本研究進(jìn)一步使用CA 對(duì)不同原料釀造黃酒風(fēng)味品質(zhì)的相似度進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3所示。

圖2 不同原料釀造黃酒風(fēng)味品質(zhì)的典范對(duì)應(yīng)分析Fig.2 Evaluation of the flavor profile characterization of yellow rice wine fermented by different raw materials based on canonical correlation analyses

圖3 不同原料釀造黃酒風(fēng)味品質(zhì)的聚類分析Fig.3 Evaluation of the flavor profile characterization of yellow rice wine fermented by different raw materials based on cluster analysis

由圖3可知，以大米和粳糯米為原料釀造的黃酒風(fēng)味品質(zhì)較為相似，但是兩者與以秈糯米為原料釀造的黃酒風(fēng)味品質(zhì)存在較大差異。采用MANOVA 對(duì)不同原料釀造黃酒的風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，以大米和粳糯米為原料釀造的黃酒差異不顯著（P＞0.05），但兩者均與以秈糯米為原料釀造的黃酒存在極顯著差異（P＜0.001）。基于電子鼻技術(shù)不同原料釀造黃酒敏感類型物質(zhì)差異性分析如表1所示。

由表1可知，通過Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，傳感器W5S、W6S、W1S、W1W、W2S、W2W 和W3S 對(duì)秈糯米釀造黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)響應(yīng)值顯著偏高（P＜0.05），傳感器W1C 和W3C 對(duì)粳糯米釀造黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)響應(yīng)值顯著偏高（P＜0.05），而傳感器W5C對(duì)不同原料釀造黃酒響應(yīng)值差異均不顯著（P＞0.05）。因傳感器W5S、W6S、W1S、W1W、W2S、W2W 和W3S分別對(duì)黃酒樣品中的氫氧化物、氫氣、甲烷、有機(jī)硫化物和萜類物質(zhì)、乙醇、有機(jī)硫化物和烷烴類物質(zhì)靈敏，而傳感器W1C 和W3C 均對(duì)黃酒中芳香類物質(zhì)靈敏[23]，由此可見，以粳糯米為原料釀造的黃酒其風(fēng)味要顯著優(yōu)于秈糯米和大米。

表1 基于電子鼻技術(shù)不同原料釀造黃酒揮發(fā)性物質(zhì)差異性分析Table 1 The significance analysis of volatile components in yellow rice wine fermented by different raw materials based on electronic nose

2.2 基于GC-MS技術(shù)分析黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

本研究使用GC-MS 技術(shù)對(duì)不同原料釀造黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了定性和相對(duì)定量研究，15 個(gè)黃酒樣品中共檢測(cè)出34 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類、酯類、酸類、酮類和其他類化合物分別為11 種、15 種、6 種、2 種和3 種。不同原料釀造黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及相對(duì)含量如表2所示。

由表2可知，秈糯米、大米和粳糯米釀造黃酒中醇類化合物平均相對(duì)含量分別為71.83 %、66.65 %和65.78%，酯類化合物平均相對(duì)含量分別為27.09%、31.54%和32.27%。由此可知，醇類化合物和酯類化合物為黃酒中主要揮發(fā)性物質(zhì)。王旭等[24]研究結(jié)果與本研究相同，其采用GC-MS 和電子鼻聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同酒齡黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了辨別，指出醇類化合物和酯類化合物是黃酒中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。此外，王培璇等[25]和牟穰等[26]的研究也表明醇類和酯類化合物在黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中占據(jù)較大比例。不同原料釀造黃酒中平均相對(duì)含量大于0.1%的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)強(qiáng)度熱圖如圖4所示。

表2 不同原料釀造黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量Table 2 The relative abundance of volatile components in yellow rice wine fermented by different raw materials

續(xù)表2 不同原料釀造黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量Continue table 2 The relative abundance of volatile components in yellow rice wine fermented by different raw materials

圖4 不同原料釀造黃酒平均相對(duì)含量大于0.1%揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的熱圖Fig.4 Heat map of volatile components in yellow rice wine fermented by different raw materials with the relative abundance more than 0.1%

由圖4可知，相對(duì)含量高于0.1%的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共計(jì)13 種，不同原料釀造黃酒中乙酸乙酯、異戊醇、異丁醇、乙醇、2-甲基-1-丁醇、2，4，5-三甲基-1，3-二氧戊環(huán)烷、醋酸和己酸乙酯等8 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)均存在顯著差異（P＜0.05）。粳糯米釀造黃酒中的乙酸乙酯、醋酸和己酸乙酯均顯著偏高（P＜0.05），而秈糯米釀造黃酒中的異戊醇、異丁醇、乙醇和2-甲基-1-丁醇相對(duì)含量顯著偏高（P＜0.05）。酯類化合物作為黃酒發(fā)酵和陳釀過程中的重要產(chǎn)物，其感官閾值相對(duì)較低對(duì)黃酒的風(fēng)味品質(zhì)形成具有重要的影響[27]，其中乙酸乙酯具有芳香和特定的水果香氣，而己酸乙酯則具有曲香和菠蘿香型香氣，可顯著提升黃酒風(fēng)味品質(zhì)。高級(jí)醇是黃酒發(fā)酵過程中不可避免的副產(chǎn)物，雖然感官閾值相對(duì)較高對(duì)黃酒風(fēng)味形成的貢獻(xiàn)較小[28]，但是如果黃酒中異戊醇、異丁醇和2-甲基-1-丁醇相對(duì)含量過高，飲用后易上頭、易醉和“后反功”，且對(duì)人體健康有一定的危害[29-30]。由此可見，黃酒的風(fēng)味品質(zhì)以粳糯米為原料釀造的最佳，這與電子鼻分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

在使用秈糯米、大米和粳糯米為原料進(jìn)行黃酒釀造的基礎(chǔ)上，采用電子鼻和GC-MS 技術(shù)對(duì)不同原料釀造黃酒的風(fēng)味進(jìn)行了評(píng)價(jià)，經(jīng)電子鼻技術(shù)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)以粳糯米為原料釀造的黃酒其芳香類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)強(qiáng)度顯著偏高，經(jīng)GC-MS 技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)以粳糯米為原料釀造的黃酒乙酸乙酯和己酸乙酯顯著偏高，而異戊醇、異丁醇和2-甲基-1-丁醇相對(duì)含量顯著偏低。由此可見，以粳糯米為原料釀造的黃酒其風(fēng)味要顯著優(yōu)于秈糯米和大米。