王鵬，馬婕，歐陽高雄，左志超，金觀橋，蘇丹柯，羅寧斌

放射治療是頭頸部惡性腫瘤的主要治療手段之一，不僅能夠有效地縮小原發(fā)灶，還能明顯減少腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，所以其療效在臨床實踐中被廣泛認可。但由于放射線具有輻射作用，尤其在反復多次的放射治療過程中，癌灶周圍正常組織也會因輻射而發(fā)生放射性損傷。在鼻咽癌的放射治療過程中，唾液腺發(fā)生放射性損傷尤為多見。頜下腺作為三大唾液腺之一，唾液分泌量約占靜息狀態(tài)下唾液總量的70%[1]，且其組織構(gòu)成中的漿液性腺泡細胞對放射線敏感，多次放療患者會因放射劑量的累積效應(yīng)導致漿液性細胞發(fā)生急性凋亡[2]，從而造成患者唾液腺功能降低和唾液量減少，導致患者的生活質(zhì)量下降。因此，臨床上應(yīng)對頜下腺的放射性損傷給予足夠的重視，準確客觀地評價頜下腺的放射性損傷，有利于臨床合理制定放療計劃，降低頜下腺的放射性損傷程度，對于改善患者的生活質(zhì)量具有重要意義。傳統(tǒng)影像學評估手段中X線造影、CT及ECT檢查均具有一定創(chuàng)傷性，而超聲檢查的操作難度較大。近年來，MR-IVIM序列作為雙指數(shù)模型擴散加權(quán)成像技術(shù)，主要應(yīng)用于腫瘤的診斷和鑒別診斷、復發(fā)監(jiān)測以及療效評價等[3]，同時在唾液腺放射性損傷的評估方面也表現(xiàn)出較大優(yōu)勢[4]，但其在頜下腺放療損傷的評估及其與病理的相關(guān)性研究鮮有文獻報道。因此，本研究通過建立小型豬頜下腺放射性損傷模型，運用IVIM-MR成像技術(shù)，評估頜下腺放療損傷的程度，并探討IVIM各參數(shù)值(D、D*和f)與放射線所致頜下腺病理改變的相關(guān)性，為今后MR-IVIM技術(shù)應(yīng)用于放射性損傷的無創(chuàng)性評估奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.實驗動物

自廣西大學動物科學技術(shù)學院購進健康雌性2～3個月齡、體重(10.6±1.5) kg的廣西巴馬小型豬9只(許可證號：SCXK桂2013-0003)，標準飼料喂養(yǎng)。將小型豬隨機分成3組，即實驗A組(20Gy組)、實驗B組(15Gy組)及對照組(0Gy)，每組各3只小型豬(雙側(cè)頜下腺共計6個樣本)。

2.建立唾液腺放療損傷模型

實驗過程中，采用鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè)，0.1 g/支)和咪達唑侖注射液(江蘇恩華藥業(yè)，5 mg/支)聯(lián)合用藥，二者按照2:1的比例配伍后對實驗用小型豬進行肌肉注射麻醉，用藥劑量為0.6 mL/kg，以小型豬的左側(cè)耳后距離背部中線約2 cm處為進針點。在建立小型豬放療模型前一日，完成所有小型豬的IVIM-MRI檢查。第二日進行小型豬頜下腺的照射處理，待小型豬麻醉完全后，取俯臥位將豬固定于放療臺正中線上。采用美國瓦里安電子直線加速器(6 ex)對頜下腺進行照射處理，以下頜角為照射中心點，單后野垂直照射一側(cè)的頜面部組織，照射距離約100 cm，照射范圍為體中線至距離體表3 cm，照射野為8 cm×8 cm，射線平均能量6 mV。實驗A組雙側(cè)頜下腺分別接受照射劑量為20Gy，實驗B組雙側(cè)頜下腺分別接受照射劑量為15Gy，對照組雙側(cè)頜下腺的照射劑量為0Gy。

3.MRI檢查方法

使用GE Discovery 750W 3.0T磁共振掃描儀和16通道頭頸聯(lián)合線圈。將麻醉完全的小型豬頭頸部置于線圈內(nèi)，身體正中線與檢查床平行。掃描序列及參數(shù)：FSE T1WI 序列，TR 599 ms，TE 15.6 ms，視野200 mm×200 mm，矩陣320×256，層厚3 mm，層間距1 mm；T2WI 序列，TR 5658 ms，TE 88.312 ms、視野200 mm×200 mm、矩陣256×288、層厚1 mm、層間距1 mm；IVIM序列，TR 5000 ms，TE 92.6 ms，層厚4 mm，層間距2 mm，視野200 mm×200 mm、矩陣128×128，b值取14個(分別為0、20、50、80、100、150、180、200、300、500、800、1000、1500和2000 s/mm2)。所有實驗豬于放射線照射的前一日及第四周末分別按上述掃描參數(shù)進行IVIM-MRI掃描。

將MRI數(shù)據(jù)傳送至GE AW4.6工作站，使用Function Tool軟件對IVIM圖像進行后處理，生成相應(yīng)雙指數(shù)模型下的D、D*及灌注系數(shù)f值的偽彩圖。結(jié)合常規(guī)T1WI及T2WI，選擇頜下腺最大層面的圖像，在DWI圖像上手動勾畫感興趣區(qū)(ROI)，注意避開腺體邊緣區(qū)域，每側(cè)頜下腺每個參數(shù)重復測量3次，取平均值。

4.組織病理學檢查

在放射線照射后第四周末，對所有小型豬再次進行IVIM-MRI檢查。檢查結(jié)束后第二日，于動物實驗中心解剖室采用空氣栓塞法處死所有小型豬，摘取頜下腺組織，將其置于10%的福爾馬林溶液中固定12 h，然后進行組織脫水及石蠟包埋，并行3 μm厚的連續(xù)切片。組織切片完成后行HE染色于電子顯微鏡下觀察病理改變，采用Image J軟件(https://imagej.nih.gov/ij/)分析實驗組和對照組頜下腺HE染色切片下的腺泡面積百分比。首先在低倍鏡下(×100)選取一個中心點，然后以該點為中心，順時針選取9個面積相同的視野，保存其高倍鏡(×400)視野下的圖像共9幀，每幀圖像使用Image J軟件勾畫腺泡的面積，分別勾畫三次進行測量，取3次測量的平均值，再計算出9張圖像中腺泡面積在總的圖像面積所占百分比。將頜下腺組織中腺泡面積較對照組減少10%及以上即認為頜下腺放射性損傷模型建立成功[5]。

表1 照射前三組小型豬頜下腺IVIM參數(shù)值比較

表2 照射后三組小型豬頜下腺IVIM參數(shù)值比較

表3 照射前后20Gy組小型豬頜下腺IVIM參數(shù)值比較

表4 照射前后15Gy組小型豬頜下腺IVIM參數(shù)值比較

表5 照射前后對照組小型豬頜下腺IVIM參數(shù)值比較

免疫組織化學檢查采用兔多克隆抗體CD31(Abcam公司)相關(guān)抗原，通過二步法標記血管內(nèi)皮細胞，參照Weidner等[6]提出的評判標準，計算著色的微血管和毛細血管，凡呈現(xiàn)棕色的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞群、內(nèi)皮細胞簇和內(nèi)皮細胞條索，且與周圍組織有明顯界限者，按1個血管計數(shù)，不考慮管腔或有無紅細胞存在，帶有明顯肌層的血管不納入計數(shù)。先在低倍鏡下(×40)選擇5個MVD“熱點”，然后在高倍鏡下(×400)計數(shù)，取5個“熱點”的平均值作為最終的MVD值。

5.統(tǒng)計學分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差的形式表示。實驗組和對照組小型豬在照射前、后頜下腺的IVIM參數(shù)(D值、D*值及f值)的比較采用配對樣本t檢驗。采用單因素方差分析比較三組小型豬頜下腺IVIM參數(shù)，采用Spearman相關(guān)分析法對D值與腺泡面積百分比、D*值和f值與MVD值的相關(guān)性進行分析。以雙側(cè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.三組小型豬IVIM參數(shù)值

照射前三組小型豬頜下腺的D、D*及f值及比較結(jié)果見表1。三組間這3項參數(shù)值的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

照射后三組小型豬頜下腺的D、D*和f值及比較結(jié)果見表2。三組間3項參數(shù)值的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

實驗組A中在照射前后小型豬頜下腺(圖1～2)的IVIM參數(shù)值(D值、D*值和f值)及比較結(jié)果見表3，三項參數(shù)的測量值在照射前后的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗組B中小型豬頜下腺在照射前后的IVIM參數(shù)值及比較結(jié)果見表4，三項參數(shù)的測量值在照射前后的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。對照組小型豬頜下腺照射前后IVIM參數(shù)值及比較結(jié)果見表5，三項參數(shù)的測量值在照射前后的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.實驗組和對照組的病理表現(xiàn)

對照組中小型豬頜下腺標本的HE染色顯微鏡下表現(xiàn)(圖3)：腺泡細胞顯示完整，胞漿豐富，細胞核深染、無皺縮。實驗組中小型豬頜下腺標本的HE染色顯微鏡下表現(xiàn)(圖4)：漿液性腺泡細胞出現(xiàn)萎縮、變小，相應(yīng)細胞核輕度固縮，胞漿嗜酸性變，少數(shù)淋巴細胞浸潤，并見輕度纖維增生。實驗組免疫組化血管標記后表現(xiàn)(圖5)：微血管內(nèi)皮細胞被標記成棕色。

圖1 照射前實驗組小型豬頜下腺IVIM-MRI，掃描數(shù)據(jù)在工作站經(jīng)后處理軟件自動生成相應(yīng)的各項參數(shù)圖，通過在DWI上勾畫感興趣區(qū)域，可得到各項參數(shù)值。a)DWI；b)D值偽彩圖；c)D*值偽彩圖；d)f值偽彩圖。 圖2 照射后實驗組小型豬頜下腺IVIM-MRI。a)DWI圖上勾畫感興趣區(qū)，顯示雙側(cè)頜下腺信號較照射前降低；b)D值偽彩圖顯示純擴散系數(shù)升高；c)D*值偽彩圖顯示假性擴散系數(shù)降低；d)f值偽彩圖顯示灌注分數(shù)升高。

圖3 對照組頜下腺組織病理片，鏡下示正常腺泡細胞(×400，HE)。 圖4 實驗組照射后4周頜下腺組織病理片，鏡下示腺泡細胞萎縮(×400,HE)。 圖5 實驗組照射后4周頜下腺組織微血管免疫組化染色，鏡下示頜下腺內(nèi)被標記成棕色的微血管(×400)。

Image J軟件分析結(jié)果顯示，對照組、實驗B組和實驗A組中腺泡面積百分比分別為41.4133%±3.6951%、26.2667%±3.3657%和20.7283%±2.9867%，三組間的差異具有統(tǒng)計學意義(F=60.878，P=0.000)。免疫組化檢查結(jié)果顯示，三組小型豬頜下腺的MVD分別為25.9667±2.4246、18.9167±2.8358和18.5333±2.3822，三組間的差異具有統(tǒng)計學意義(F=16.091，P=0.000)。

3.IVIM參數(shù)值與病理指標的相關(guān)性

實驗組小型豬的頜下腺腺泡面積較對照組明顯減少，照射后頜下腺D值較對照組升高，相關(guān)性分析顯示D值與腺泡面積百分比呈負相關(guān)(r=-0.639，P=0.004；圖6)。實驗組小型豬頜下腺的MVD較對照組減少，照射后D*值較對照組降低，相關(guān)性分析顯示D*值與MVD呈正相關(guān)(r=0.767，P<0.000；圖7)；f值與MVD呈負相關(guān)(r=-0.631，P=0.005；圖8)。

討 論

IVIM技術(shù)是Le等[7]最早提出的采用雙指數(shù)模型DWI來描述體素內(nèi)信號衰減與b值間關(guān)系的一種新MRI技術(shù)，采用多b值DWI進行分析，可以同時得到水分子擴散參數(shù)(真性擴散分數(shù)D)以及組織灌注相關(guān)參數(shù)(灌注分數(shù)f和假擴散系數(shù)D*)，用于量化分析組織中水分子的擴散和灌注兩種運動成分。在b值小于200 s/mm2時，DWI對微循環(huán)灌注效應(yīng)更加敏感，掃描過程中所監(jiān)測到的信號衰減同時反映了組織內(nèi)水分子的擴散和微循環(huán)毛細血管網(wǎng)內(nèi)水分子的假性擴散；在b值大于200 s/mm2情況下，微循環(huán)灌注所產(chǎn)生的信號已基本衰減完畢，此時信號衰減基本只與體素內(nèi)單純水分子擴散相關(guān)[8]。鑒于IVIM擴散加權(quán)成像技術(shù)的成像特點，已有研究證實其在腫瘤的診斷和鑒別診斷方面具有較大的優(yōu)勢[4]，對腮腺放射性損傷的評估也見諸文獻報道[4]，而對頜下腺放射性損傷的研究較為少見。多次接受放射治療的頭頸部腫瘤患者中，因頜下腺受損所致口干癥的情況并不少見，降低了患者的生活質(zhì)量。因此，對頜下腺放射性損傷情況進行評估，有利于臨床制訂合理的治療方案，減少唾液腺放射性損傷的程度。

圖6 三組小型豬頜下腺D值與腺泡面積百分比的相關(guān)性分析點線圖，顯示兩個指標呈負相關(guān)。 圖7 三組小型豬頜下腺D*值與MVD的相關(guān)性分析點線圖，顯示兩個指標呈正相關(guān)。 圖8 三組小型豬頜下腺f值與MVD的相關(guān)性分析點線圖，顯示兩個指標呈負相關(guān)。

本研究通過建立小型豬頜下腺的放射損傷模型，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，實驗組中頜下腺的D值和f值升高、D*值減低，差異均有統(tǒng)計學意義，與Marzi等[4]和Zhou等[9]的研究結(jié)果基本一致。對IVIM參數(shù)與病理參數(shù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示D值與腺泡面積百分比呈負相關(guān)，D*值與MVD呈正相關(guān)，f值與MVD呈負相關(guān)。D值為純擴散系數(shù)，代表體素內(nèi)單純的水分子擴散運動。由于頜下腺組織內(nèi)漿液性細胞對放射線敏感，經(jīng)過放射線照射后，漿液性細胞容易發(fā)生放射性損傷，腺泡細胞壞死[10]，導致頜下腺組織內(nèi)細胞密度減低，細胞外水分子的擴散運動加劇，使得D值上升。本研究中病理HE染色結(jié)果顯示實驗組小型豬頜下腺組織內(nèi)腺泡面積較對照組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義，且照射劑量越大，腺泡面積減少越明顯，相關(guān)性分析顯示D值與頜下腺腺泡面積呈負相關(guān)，說明了頜下腺組織在放射性損傷后D值的改變與腺泡面積的損傷和減少程度是一致的，因此通過D值的改變能夠間接反映出腺體內(nèi)腺泡的損傷情況。

D*值為假性擴散系數(shù)，代表體素內(nèi)微循環(huán)灌注相關(guān)擴散運動，它與微血管的幾何形態(tài)以及血管內(nèi)血流速度緊密相關(guān)，主要受微血管結(jié)構(gòu)及其血液流速的影響。頜下腺接受放射線照射后，血管內(nèi)皮細胞主要呈現(xiàn)出凋亡反應(yīng)[13]，造成組織內(nèi)毛細血管結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)皮下膠原暴露，促進了血小板的黏附聚集，毛細血管內(nèi)微血栓形成[14]，相應(yīng)血流速度減低。說明放射線導致血管內(nèi)皮細胞的損傷，不僅使腺體組織正常微血管結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時微血管內(nèi)的血液流速降低，二者綜合作用引起D*值的降低。本研究中免疫組化結(jié)果顯示實驗組小型豬腺體組織的MVD較對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與顏興等[15]在小型豬頜下腺放療后的病理研究結(jié)果相一致；此外，本研究結(jié)果顯示D*值與MVD呈正相關(guān)，說明了D*值的改變與微血管的改變存在關(guān)聯(lián)，能夠通過腺體組織D*值的改變間接反映組織內(nèi)MVD的改變情況。

f值為組織內(nèi)的灌注分數(shù)，代表掃描體素內(nèi)微循環(huán)灌注效應(yīng)占總體擴散效應(yīng)的比例，其數(shù)值大小主要取決于組織內(nèi)的血容量[11]。頜下腺組織接受放射線照射后，早期階段組織內(nèi)發(fā)生炎性反應(yīng)，血管內(nèi)皮細胞腫脹，殘留的血管擴張充血[12]，導致局部血容量增加，f值相應(yīng)升高。相關(guān)性分析結(jié)果顯示f值與MVD值呈負相關(guān)。分析其原因可能是由于照射劑量越大，相應(yīng)腺體組織發(fā)生炎性反應(yīng)的程度就越顯著，雖然微血管密度減低，但最終組織炎性反應(yīng)導致灌注成分的增加掩蓋了因MVD減少所致的灌注減少的損失，或其它有待發(fā)現(xiàn)的機制，尚需進一步研究。

綜上，IVIM擴散加權(quán)成像技術(shù)能夠?qū)崟r、無創(chuàng)地監(jiān)測頜下腺組織的放射性損傷過程，并可通過IVIM參數(shù)對其損傷程度進行數(shù)據(jù)量化分析，可間接反映損傷頜下腺腺泡面積和MVD的病理改變，有望為臨床的治療決策提供更多的參考依據(jù)。但本研究尚有不足，實驗樣本量較少，可能存在選擇偏倚等，下一步將擴大樣本量進行更深入地分析和論證。