趙亞卓，王 鑫，馮佳佳，孫丹丹，王鳳茹，董金皋

(河北農業(yè)大學 生命科學學院，河北省植物生理和分子病理學重點實驗室，河北 保定 071001)

START(The lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains)結構域廣泛存在于動物、植物和微生物中，此結構域調控著磷脂運輸和脂質代謝。在人類和動物很多蛋白質中含有START結構域，與疾病的發(fā)生密切相關；在植物中START結構域往往和其他植物特有的結構域同時存在于一個蛋白質中，調控著植物各個生長發(fā)育過程，如ATML1(A.thalianaMERISTEM LAYER1)在皮層的發(fā)育過程中起重要的調控作用[1]，PDF2(PROTODERMAL FACTOR2)可調控花器官的形成[2]，GL2(GLABRA2)調控表皮毛的生長[3]。ATML1、PDF2和GL2均屬于START結構域蛋白家族中的HD-ZLZ START(Homeodomain zipper-loop-zipper StAR-related lipid transfer)亞家族，這類亞家族成員屬于轉錄因子，START結構域在這些轉錄因子中的作用類似于動物中的甾醇類激素受體，通過結合脂類或甾醇類物質來調控轉錄過程。擬南芥中含START結構域家族成員共35個，但已知功能的僅有9個，均為轉錄因子家族[4]。在START結構域家族中，還有PH-START(Pleckstrin homology StAR-related lipid transfer)亞家族，但此亞家族成員在調控植物生長發(fā)育方面的功能還未見報道。

擬南芥中PH-START蛋白亞家族由At4g19040、At5g45560、At3g54800、At2g28320 4個成員組成。除有研究發(fā)現(xiàn)At4g19040突變體可增強擬南芥對白粉菌(Erysiphecichoracearum)的抗性外[5]，此亞家族成員對擬南芥生長發(fā)育的調控作用未見報道。PH(Pleckstrin homology)結構域首先在普雷克底物蛋白中識別，大約含有120個氨基酸殘基，是血小板中蛋白激酶C(PKC)的主要底物[6-7]。PH結構域是很多與細胞膜結構結合的第二信使蛋白質所具有的結構域。已證實PH結構域參與了細胞內信號傳導、細胞骨架組成、膜磷脂的轉運和修飾[8-9]。在人類基因組中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了252 種蛋白質含有不同結構的PH結構域[10]，在釀酒酵母中，有33種蛋白質具有不同結構的PH結構域[11]。迄今為止，一些PH結構域的結構已經(jīng)通過核磁共振和X射線獲得，盡管不同PH結構域之間的序列相似性很低，但其三維結構卻具有顯著的保守性[12]。雖然已經(jīng)在不同基因組中識別了大量的PH結構域，但PH結構域的功能尚不清楚[13]。PH結構域首次被識別時，認為是一個蛋白質結合域，并且可以識別蛋白質配體，例如異源三聚體G蛋白的β/γ亞基、WD40重復蛋白和酪氨酸激酶等[14]。然而，PH結構域最顯著的功能是它們與磷脂(例如磷酸肌醇或肌醇磷脂酸)結合的能力[15]，與磷酸肌醇類物質的結合可以使具有PH結構域的蛋白質對脂類細胞信使做出反應，從而轉移至細胞膜結構上。蛋白磷脂酶C(PLC)家族具有PH結構域，PLC酶是存在于胞漿膜上的一個關鍵酶，可以水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)，產(chǎn)生1,4,5-磷酸三肌醇和二酰甘油2個第二信號分子，調節(jié)細胞內的Ca2+釋放和激活蛋白激酶C[15]。

本研究以PH-START亞家族成員At2g28320(命名為PH-START1)作為研究對象，分析其時空表達特性，探究其在擬南芥生長發(fā)育中的作用，為更好地促控植物生長發(fā)育、提高作物產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)：Columbia(Col-0)，由河北農業(yè)大學植物生理和分子病理學重點實驗室種植；擬南芥PH-START1(At2g28320)基因的T-DNA插入突變體(SALK-060171、SALK-120376)，購自美國ABRC(ArabidopsisBiological Resource Center)突變體庫。擬南芥生長培養(yǎng)條件為：溫度22 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗。

1.2 試驗方法

1.2.1PH-START1基因表達量分析 為研究PH-START1基因在擬南芥的時空表達情況，以Col-0野生型為材料，分別以根、莖、不同位置的蓮座葉、不同花期的花、授粉后不同時間的角果為材料，提取總RNA，經(jīng)反轉錄后，利用Real-time PCR分析PH-START1基因的表達情況。

1.2.2PH-START1過表達轉基因擬南芥的獲得 以PH-START1基因的CDS序列和擬南芥過表達載體pSN1301的MCS分析其酶切位點并選定為BamH Ⅰ和KpnⅠ，以野生型擬南芥的cDNA作為模板，擴增PH-START1目的序列。對PCR擴增得到的目的片段經(jīng)膠回收后與克隆載體pMD19-T Vector連接，轉化大腸桿菌，對篩選得到的陽性克隆菌液檢測并測序，將測序正確的菌液提取質粒，雙酶切回收目的條帶，然后與載體片段連接、轉化、驗證。將最終得到的含有目的基因的過表達載體命名為pSN1301-PH-START1。用電擊法轉化農桿菌GV3101，利用花絮侵染法轉化野生型擬南芥，抗生素篩選陽性苗[16]，并用Real-time PCR進行基因表達量的驗證。

1.2.3PH-START1T-DNA插入突變體的獲得 將購買的PH-START1基因突變體種子播種在含有Kan抗性的MS平板上(Kan：100 mg/L)篩選，選取葉片鮮綠下胚軸較長的植株移栽，收獲種子繼續(xù)篩選并進行驗證。

三引物法：提取T3不再出現(xiàn)分離的突變體植株幼苗和野生型擬南芥的DNA，以T-DNA Primer Design(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)設計插入位點上下游的引物LP、RP，以LBb1作為T-DNA特異引物，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證T-DNA插入位點。

PH-START1基因表達量驗證：提取28 d的Col-0野生型擬南芥和PH-START1突變體植株的RNA，反轉錄后用SqRT-PCR和Real-time PCR 驗證PH-START1基因的表達情況。

1.2.4 擬南芥葉面積的測定 將生長環(huán)境完全一致的野生型和突變體植株相同部位的葉片展平，用Image J軟件測量葉片的面積，野生型和突變體各測量30個葉片。

2 結果與分析

2.1 PH-START1時空表達分析

分別提取野生型擬南芥不同生長時期的根、莖、蓮座葉、花、角果的總RNA并反轉錄，然后利用Real-time PCR分析PH-START1基因的表達量(圖1)。結果發(fā)現(xiàn)，在擬南芥的各個器官中均有PH-START1基因的表達，在葉中表達最多，然后依次是根、花、角果和莖，且在各個器官中的表達差異達極顯著水平(圖1-A)；從子葉期到幼苗期，根中PH-START1基因的表達量極顯著上升，但到成苗期根中PH-START1的表達無顯著改變(圖1-B)；對第2，4，6，8，10片蓮座葉中PH-START1的表達分析發(fā)現(xiàn)，每片蓮座葉中均有PH-START1的表達，在第6片蓮座葉中的表達量最高，其次是第2片蓮座葉，在第8，10片蓮座葉中表達量最低(圖1-C)；授粉后的角果中PH-START1均有表達，授粉后第5天(5DAP)的角果中PH-START1表達量極顯著高于3 d的角果，而在以后時期角果的表達量更低(圖1-D)；比較不同花期的花中PH-START1表達量，發(fā)現(xiàn)隨著花的發(fā)育，花中PH-START1表達量逐漸增高，差異均達極顯著水平(圖1-E)；比較花器官中花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊PH-START1基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)雄蕊中PH-START1的表達量最高(差異極顯著)、其次是花瓣和萼片，而雌蕊中最少，差異達極顯著水平(圖1-F)。

不同小寫和大寫字母分別表示5%和1%水平差異顯著。圖9同。Different small and capital letters indicate 5% and 1% significant level respectively.The same as Fig.9.

2.2 PH-START1過表達載體的構建

根據(jù)PH-START1CDS序列引物擴增得到PH-START1CDS序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在2 214 bp處得到單一條帶，與PH-START1片段大小一致(圖2-A)?；厥漳康臈l帶，并與克隆載體pMD19-T vector 16 ℃連接1 h，轉化E.coliDH5α，PCR檢測陽性菌落(圖2-B)。選擇陽性克隆進行測序，并提取測序正確的陽性克隆質粒，用BamH Ⅰ和KpnⅠ對其雙酶切(圖2-C)，回收目的片段。目的片段與pSN1301載體片段用T4DNA Ligase在16 ℃過夜連接，轉化E.coliDH5α后對陽性克隆進行PCR檢測(圖2-D)。將陽性克隆用BamH Ⅰ和KpnⅠ進行雙酶切驗證，得到PH-START1目的條帶(圖2-E)，表明PH-START1過表達載體構建成功，命名為35S∶pSN1301-PH-START1。將構建好的35S∶pSN1301-PH-START1轉化GV3101，用基因序列引物檢測陽性克隆，得到PH-START1基因目的條帶(圖2-F)，說明構建好的過表達載體成功轉入農桿菌感受態(tài)GV3101中。

A.PH-START1基因擴增；B.陽性克隆PCR檢測；C.pMD19-PH-START1雙酶切驗證；D.pSN1301-PH-START1的PCR檢測；E.35S∶pSN1301-PH-START1雙酶切驗證；F.35S∶pSN1301-PH-START1轉化GV3101后PCR檢測。M.5 kb Marker；1-3.目的條帶。

A.PH-START1gene amplification; B. Positive clone detection by PCR; C.pMD19-PH-START1double enzyme digestion test; D. pSN1301-PH-START1PCR detection; E.35S∶pSN1301-PH-START1double enzyme digestion test; F.PCR detection of pSN1301-PH-START1transformation into GV3101. M. 5 kb Marker; 1-3. Target band.

圖2PH-START1過表達載體的構建
Fig.2 Construction ofPH-START1overexpressing vector

2.3 過表達PH-START1轉基因擬南芥的遺傳轉化和篩選

用花絮侵染法轉化擬南芥，將轉化得到的種子經(jīng)抗性篩選(圖3-A)，得到T3純合株系，提取純合株系DNA，可以擴增出目的條帶(圖3-B)，說明過表達PH-START1轉基因擬南芥創(chuàng)制成功。

2.4 過表達擬南芥植株中PH-START1的表達量分析

為了解PH-START1過表達擬南芥中PH-START1的表達情況，從得到的陽性植株中選取了2個轉基因株系提取總RNA，反轉錄后對PH-START1基因進行SqRT-PCR分析(圖4)，結果發(fā)現(xiàn)2個轉基因植株中pH-START1的表達量均高于野生型植株，表明確實為PH-START1過表達株系，將其分別命名為OE1、OE2。

A.潮霉素平板上轉基因陽性苗的篩選；B.PCR檢測35S∶pSN1301-PH-START1轉基因陽性純合株系。M.2 kb Marker；1-2.WT對照；3-4.目的條帶。

A.Screening of transgenic positive seedlings on the hygromycin plate; B.PCR detection of the35S∶pSN1301-PH-START1transgenic positive homozygous lines. M.2 kb Marker;1-2.Control;3-4.Objective stripe.

圖3 過表達PH-START1轉基因陽性苗的篩選與純合驗證
Fig.3 Screening and homozygous validation of35S∶pSN1301-PH-START1overexpression transgenic positive seedlings

2.5 PH-START1缺失突變體轉基因擬南芥的創(chuàng)制

2.5.1PH-START1T-DNA插入突變體插入位點分析 由ABRC突變體庫購得擬南芥PH-START1的2株不同T-DNA插入位點突變體，其編號分別為SALK_060171、SALK_120376。通過擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR網(wǎng)站，得到其插入位點(圖5)，箭頭所指的位置及方向就是載體插入的位置及方向。SALK_060171插入位置在起始密碼子ATG后205 bp的位置，將之命名為ph-start1-1，SALK_120376插入位置在起始密碼子ATG前534 bp的位置，將之命名為ph-start1-2，背景為 Col-0 野生型擬南芥。

圖5 ph-start1突變體中T-DNA插入位點示意圖Fig.5 The T-DNA insertion sites in ph-start1 mutant

提取T3不再出現(xiàn)分離比的突變體植株幼苗和野生型擬南芥的DNA，以T-DNA Primer Design設計插入位點上下游的引物LP、RP，以LBb1作為T-DNA特異引物，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證T-DNA插入位點。結果表明(圖6)，ph-start1-1和ph-start1-2株系為T-DNA插入突變體純合株系。

M.2 kb Marker；1.以LBb1和RP為引物；2.以LP和RP為引物。M.2 kb Marker; 1.LBb1 and RP as primers; 2.LP and RP as primers.

2.5.2 T-DNA插入突變體中PH-START1的表達量分析 為了解PH-START1T-DNA插入突變體中PH-START1表達情況，提取野生型擬南芥和ph-start1突變體幼苗RNA，用SqRT-PCR技術分析PH-START1基因的表達情況(圖7)，結果表明ph-start1-1和ph-start1-2無PH-START1表達，說明確實為PH-START1功能缺失突變體。

圖7 SqRT-PCR技術分析PH-START1 T-DNA插入突變體中PH-START1的表達量Fig.7 Expression analysis of PH-START1 by SqRT-PCR in PH-START1 T-DNA insertion mutants

2.6 PH-START1 轉基因擬南芥表型分析

將收獲的Col-0野生型擬南芥、PH-START1-OE、缺失突變體擬南芥種子播種在培養(yǎng)基中，放置于培養(yǎng)室相同環(huán)境下培養(yǎng)，觀察各時期生長發(fā)育情況(圖8)。發(fā)現(xiàn)播種12 d，Col-0野生型擬南芥為四葉期而OE轉基因擬南芥已到達六葉期，OE植株明顯較野生型大；播種25 d，OE生長發(fā)育已變得遲緩，植株明顯小于野生型；播種40 d，OE轉基因擬南芥各個器官的生長發(fā)育都明顯小于野生型。ph-start1無論是在四葉期還是在營養(yǎng)生長時期的生長發(fā)育都略優(yōu)于野生型。綜上所述，PH-START1對擬南芥的生長發(fā)育起著重要的調控作用。

A.擬南芥四葉期植株表型對比(播種12 d)；B.擬南芥四葉期植株表型對比(播種10 d)；C-D.在同樣正常的環(huán)境條件下，Col-0野生型和OE表型對比(播種25 d)；E.Col-0野生型和ph-start1表型對比(播種30 d)；F.Col-0野生型和OE表型對比(播種40 d)。

A.Phenotypic comparison of 4-leaf stage ofArabidopsis(12 d after sown); B.Phenotypic comparison of 4-leaf stage ofArabidopsis(10 d after sown); C-D.Phenotypic comparison of Col-0 wild type andOE(25 d after sown) under the same normal environmental conditions; E.Phenotypic comparison of Col-0 wild type andph-start1(30 d after sown); F.Phenotypic comparison of Col-0 wild type andOE(40 d after sown).

圖8PH-START1功能獲得和缺失轉基因擬南芥表型分析
Fig.8 Phenotypic analysis ofPH-START1transgenicArabidopsiswith functional acquisition and loss

A-B.OE擬南芥葉片的表型； C-D. ph-start1擬南芥葉片的表型；E.OE葉面積統(tǒng)計；F.ph-start1葉面積統(tǒng)計。A-B.OE Arabidopsis leaves phenotype; C-D.ph-start1 Arabidopsis leaves phenotype; E.Comparison of leaf area of OE Arabidopsis;F.Comparison of leaf area of ph-start1 Arabidopsis.

觀察相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的OE和ph-start1的全部蓮座葉，選擇同一部位的蓮座葉進行葉面積和葉柄長度的測定(圖9)。結果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，OE的葉片極顯著變小，葉面積為0.11，0.12 cm2，只占對照的4.89%，5.33%；ph-start1的葉片極顯著變大，葉面積為2.94，3.05 cm2，占對照的142%，148%。表明PH-START1的過量表達嚴重影響了擬南芥葉片的發(fā)育，PH-START1表達量的下降可以促進葉片的發(fā)育。

3 討論

擬南芥中PH-START1含有PH-START結構域，PH結構域首次被鑒定時認為是蛋白質結合域，現(xiàn)多參與細胞內信號傳導、細胞骨架組織、膜轉運和磷脂修飾[17-18]。START結構域首次被發(fā)現(xiàn)是在急性調節(jié)蛋白中，它是一個與脂類和甾醇類物質結合相關的結構域，負責將急性調節(jié)蛋白中的膽固醇轉移到線粒體內膜[19-20]。在擬南芥中含START結構域的蛋白質家族共有35個成員，其中21個被融合在同源異型結構域中，此現(xiàn)象表明START結構域在植物的生長發(fā)育過程中起到了重要的作用[21-22]。隨著擬南芥的生長發(fā)育，PH-START1在各個組織中均有不同程度的表達，根中主要在幼苗期表達量較高，蓮座葉中主要在生長的第6片蓮座葉表達量較高，花中主要在15花期表達量較高，角果中主要在授粉后5 d表達量較高，在花器官發(fā)育過程中，相對萼片、花瓣和雌蕊而言，雄蕊中PH-START1的表達量最高。

植物的生長周期分為2個階段即營養(yǎng)生長階段和生殖生長階段。營養(yǎng)生長是生殖生長的基礎，根系的發(fā)達才能從周圍土壤中吸收大量的水分和營養(yǎng)物質，通過軸向和徑向運輸傳遞給莖和葉，使其茁壯生長，可以有效地抵制各種生物和非生物脅迫，并且為生殖生長做好準備。與野生型相比，過表達PH-START1擬南芥主根短、主莖細弱、蓮座葉小，ph-start1的主根較長、主莖較粗、蓮座葉大。PH-START1表達量的升高嚴重抑制了擬南芥的發(fā)育，說明PH-START1在擬南芥生長發(fā)育中起著負調控作用。至于PH-START1負調控擬南芥生長發(fā)育的分子機制，還需要對其進行轉錄組、蛋白質組及互作蛋白進行分析，建立植物生長發(fā)育調控網(wǎng)絡，闡明植物生長發(fā)育調控機制。