孫麗娟 ，秦秦，宋科，孫雅菲，薛永*，施積炎*

1. 上海市農(nóng)業(yè)科學院生態(tài)環(huán)境保護研究所，上海 201403；2. 浙江大學環(huán)境污染防治研究所，浙江 杭州 310058

銅（Copper，Cu）雖然是生物必需的營養(yǎng)元素，但吸收或攝入過量的銅又會對植物或動物產(chǎn)生毒性效應，銅的生物有效態(tài)是指土壤中可能被生物吸收的銅的形態(tài)，進入到土壤中的銅經(jīng)過沉淀/溶解、吸附/解吸、氧化/還原、絡合/離解等一系列化學反應形成不同固相和液相形態(tài)，其濃度及形態(tài)對植物和微生物的環(huán)境產(chǎn)生不同程度毒性，而環(huán)境條件如pH、氧化還原電勢（Eh）、水硬度（碳酸鹽含量）、有機物、鐵錳氧化物等均會以直接或間接的方式影響土壤銅的形態(tài)轉(zhuǎn)化，從而影響銅的生物有效性（Flemming et al.，1989）。

植物根系在生長發(fā)育過程中可以向外界環(huán)境分泌滲出物、分泌物、粘膠質(zhì)以及裂解物質(zhì)4種類型根系分泌物（root exudates），根系向環(huán)境釋放的有機碳量可占植物固定總有機碳量的 1%－40%（Bais et al.，2006）。水稻根系分泌物主要包括一些小分子有機酸、氨基酸、糖、生長物質(zhì)等有機化合物，部分有機化合物對植物吸收重金屬過程有較大影響，可通過改變根際環(huán)境的 pH、Eh、微生物群落結構及豐度等從而影響根系對金屬的吸收（常學秀等，2000）。

含硫有機化合物（主要包括甲硫氨酸和半胱氨酸等）雖然是根系分泌物中較少量的一部分，但是由于土壤重金屬具有優(yōu)先與含硫官能團結合的趨勢（Hesterberg et al.，2001），例如Hg2+與土壤胡敏酸中巰基官能團結合后形成的共價化合物的 logK值達 34.5－38.3（Hesterberg et al.，2001），即使是微克每升級含量的甲基汞亦可與土壤有機質(zhì)中的還原態(tài)有機硫化合物結合（Karlsson et al.，2003），其 logK 值為 12.15－14.48（Hintelmann et al.，1997），可見，土壤有機硫?qū)χ亟饘侪h(huán)境行為具有顯著影響。研究含硫有機分泌物對土壤銅遷移轉(zhuǎn)化的影響可深入了解土壤銅的生物地球化學循環(huán)過程。前期研究證明水稻根際土壤銅的形態(tài)轉(zhuǎn)化與半胱氨酸有關，根際土壤部分銅以半胱氨酸形態(tài)存在（Sunet al.，2015；Sunet al.，2019），因此，本研究重點以半胱氨酸和甲硫氨酸兩種典型的含硫有機化合物為硫源，探討外源添加有機硫?qū)ρ退疇顟B(tài)下土壤銅形態(tài)轉(zhuǎn)化及生物有效性的影響及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與試驗設計

供試土壤（0－20 cm）采自浙江省富陽市環(huán)山鄉(xiāng)某冶煉廠（119°55′29.7′′E，29°56′22.6′′N）周邊拋荒水稻田。土壤樣品經(jīng)自然風干、研磨、過篩（2 mm）后備用。土壤基本理化性狀如表1所示。

L型半胱氨酸（L-Cysteine）、甲硫氨酸（L-Methionine）均購自 aladdin-阿拉丁試劑有限公司，供試土壤經(jīng)高壓滅菌處理后，稱取500 g置于500 mL燒杯中，半胱氨酸和甲硫氨酸的添加濃度分別為0、50、100 mg·kg-1，充分拌勻后，加入去離子水，保持4－5 cm的淹水條件，定期補充蒸發(fā)的水分。將燒杯靜置于小型人工氣候室（浙江求是人工環(huán)境有限公司）中，控制條件為：濕度60%－70%，溫度25－28 ℃，光照時間16 h·d-1，光照強度150μmol·m-2·s-1。分別于淹水 7 d、14 d、21 d 及 28 d在淹水表層采集少量土壤樣品，冷凍干燥后置于真空干燥器中，待用。每個處理設置3次重復，共15個樣本量。

1.2 樣品分析

1.2.1 土壤基本理化性質(zhì)

土壤 pH、有機質(zhì)、陽離子交換量等測試方法參照魯如坤（2000）編寫的《土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法》中推薦的方法，重金屬及硫元素含量使用ICP-OES 測定（iCAP 6300，Thermo，USA）。

1.2.2 土壤pH測定

采集樣品前，利用Orion 5 Star臺式pH玻璃電極（Thermo Orion，Thermo Fisher Scientific，USA）原位測定表層土壤pH值。

1.2.3 土壤有效態(tài)銅含量測定

采用一步提取法提取土壤有效態(tài)銅，分別用0.01 mol·L-1CaCl2和 DTPA 混合液（包括 0.005 mol·L-1DTPA、0.01 mol·L-1CaCl2、0.1 mol·L-1TEA混合液）提取（Quevauviller，1998），具體過程見表2。

CaCl2提取態(tài)：稱取 2.0 g冷凍干燥（Alphal-4LSC，德國）后的土壤置于50 mL離心管中，加10 mL 0.01 mol·L-1CaCl2溶液，渦旋振蕩儀振蕩 15 s后于 20 ℃、200 r·min-1下振蕩 2 h；12000 g、20 ℃下離心10 min，過濾，待測。

DTPA提取態(tài)：稱取4.0 g冷凍干燥后的土壤置于50 mL離心管，加10 mL DTPA混合液，在渦旋振蕩儀上振蕩15 s 后，于20 ℃、200 r·min-1下振蕩2 h；12000 g離心10 min，過濾。

1.2.4 土壤銅形態(tài)分析

銅的K邊X射線近邊吸收譜學（XANES）在北京同步輻射裝置（BSRF）的1W1B線站采集，輻射裝置儲存環(huán)能量為2.2 GeV，束流強度為140 mA，土壤樣品經(jīng)壓片機壓片（直徑10 mm，厚2 mm）后，利用 3M膠帶（Scotch，USA）將其固定在金屬樣品架上待測。采用Lytle探測器在熒光模式下采集銅的K邊吸收譜線。數(shù)據(jù)譜線采集后利用IFFEFFIT數(shù)據(jù)包中的Athena軟件對數(shù)據(jù)進行預處理及歸一化處理。采用Cu片（Cu foil）作為內(nèi)參比，利用Athena軟件將其譜線的一階導數(shù)的極大值能量（E0）校準至理論值8979 eV，其余實驗譜線及標準樣品均參照 Cu片的能量偏移量進行校準。參與擬合標準物的選擇通過 Sixpack軟件進行主成分分析，確定主成分個數(shù)后，逐個對標準樣品進行目標轉(zhuǎn)換，依據(jù)目標轉(zhuǎn)換spoil值的大小確定參與擬合的標準物（Manceauet al.，2002）。參照spoil值及主成分個數(shù)，在Athena軟件中進行線性擬合，將擬合結果導入Origin 8.0進行圖形化處理。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA），圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。處理組顯著性分析采用最小顯著差異法（LSD）進行檢驗（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical characters of the tested soil

表2 土壤重金屬生物有效態(tài)的一歩提取法Table 2 The bioavailable fraction of heavy metals in soil extracted by single extraction

2 結果與分析

2.1 淹水時間和硫添加對土壤pH影響

不同淹水時間下的土壤pH變化如圖1所示，整體而言，不同處理組中土壤pH值隨著淹水時間的延長呈現(xiàn)先下降再上升的變化趨勢，與對照組相比，各個處理組對土壤pH變化影響并不顯著，這可能與本實驗中有機物的施加濃度較低有關。

圖1 不同淹水時間下土壤pH的變化Fig. 1 pH value of soil under different flooding time

2.2 淹水時間和硫添加對土壤銅生物有效性的影響

2.2.1 土壤可交換態(tài)銅變化

圖2 不同淹水時間下土壤CaCl2提取態(tài)銅質(zhì)量分數(shù)的變化Fig. 2 Mass fraction of CaCl2 extractable Cu in soil under different flooding time

土壤CaCl2提取態(tài)銅質(zhì)量分數(shù)一般用于表征土壤可交換態(tài)銅含量（Xu et al.，2015），如圖2所示，隨著淹水時間的延長，土壤可交換態(tài)銅質(zhì)量分數(shù)在3－7 mg·kg-1范圍內(nèi)，整體呈逐漸降低趨勢，淹水前期（21 d前），可交換態(tài)銅含量降低緩慢，而從淹水21－28 d時，可交換態(tài)銅含量急劇下降。淹水前期，不同種類的有機物及不同濃度對土壤可交換態(tài)銅的影響并不顯著，淹水21 d時，有機硫化物的各個處理組的可交換態(tài)銅含量均高于對照組，而到淹水28 d時，各處理組的可交換態(tài)銅含量均降低至3 mg·kg-1左右，且各處理組無顯著性差異。

2.2.2 土壤有機結合態(tài)銅變化

土壤DTPA提取態(tài)銅質(zhì)量分數(shù)可用于表征土壤有機結合態(tài)銅含量（Xu et al.，2015），由圖3所示，土壤有機結合態(tài)銅在 150－225 mg·kg-1范圍內(nèi)波動，整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。淹水前期，有機物施加對土壤有機結合態(tài)銅含量的影響不顯著，而到淹水21 d，兩種含硫有機物施加處理組中的有機結合態(tài)銅均低于對照組，甲硫氨酸表現(xiàn)顯著（P＜0.05），淹水28 d，含硫有機物處理組中土壤有機結合態(tài)銅含量高于對照處理組。

圖3 不同淹水時間下土壤DTPA提取態(tài)銅質(zhì)量分數(shù)的變化Fig. 3 Mass fraction of DTPA extractable Cu in soil under different flooding time

2.3 淹水時間和硫添加下土壤銅的XANES分析

采集淹水21 d的土壤，冷凍干燥后在北京同步輻射裝置的 1W1B線站采集對照組及 100 mg·kg-1含硫有機物（半胱氨酸及甲硫氨酸）處理組土壤樣品中銅的K邊XANES，得到的譜線如圖4所示，土壤樣品中銅的XANES譜的主要吸收峰位于8995 eV處，另外在8981 eV處有1個較小的吸收白線鋒，這兩個峰分別為二價銅和一價銅的吸收峰。土壤銅的K邊XANES譜線線性擬合結果如表3所示，銅的主要形態(tài)由硫化亞銅（Cu2S）、纈氨酸銅（Cu-valine）及針鐵礦結合態(tài)銅（Cu-goethite）組成，其中Cu-valine占比較大（53.8%－69.7%），其次為Cu2S和Cu-goethite，可以看出，施加含硫有機化合物可增加土壤中Cu-valine的占比，與對照組相比，半胱氨酸和甲硫氨酸處理組中 Cu-valine占比的增幅分別為15.9%和8.5%，與此同時，Cu-goethite占比分別降低19.3%和11.4%，Cu2S的占比變化不大。可見，淹水條件下含硫有機化合物的添加可促進土壤中纈氨酸銅類化合物比例的增加。

圖4 淹水3周土壤及標準樣品銅的XANES譜線Fig. 4 Comparison of Cu K-edge XANES spectra of reference compounds and soil samples treated with sulfur compounds after three weeks of flooding

表3 不同處理組中土壤銅的K邊XANES譜線線性擬合結果Table 3 Linear combination fitting results of the Cu K-edge XANES spectra of soil samples treated with 100 mg·kg-1 sulfur compounds

3 討論

3.1 淹水條件下含硫有機物對土壤pH的影響

根系有機分泌物是根際微域影響重金屬環(huán)境行為的重要因素之一，根泌物可通過改變根際微生物活性、根際理化性質(zhì)、根生長過程等間接影響重金屬的行為，也可直接通過酸化、螯合、沉淀或氧化還原等反應影響重金屬的形態(tài)轉(zhuǎn)化。不同作物根系分泌物組成具有較大差異，主要分為氨基酸、有機酸、酚類、多糖和胡敏酸等化合物（Baiset al.，2006），檸檬酸、草酸及蘋果酸被認為是根際微域影響較大的有機酸（Joneset al.，2003），研究表明水稻根分泌物中大量氨基酸主要有組氨酸、脯氨酸、纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸，少量氨基酸有天冬氨酸、精氨酸、絡氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸等（Bacilio-Jiménezet al.，2003）。本研究中添加含硫有機物的土壤隨著淹水時間的延長，土壤pH出現(xiàn)先下降再上升的趨勢，短期淹水狀態(tài)下，土壤中微生物呼吸釋放的 CO2溶解形成 H2CO3，H2CO3水解為 H+和 HCO3-，使得土壤溶液 pH降低（Ponnamperuma，1972）。Khaokaew et al.（2011）研究也發(fā)現(xiàn)稻田土壤在短期淹水后，pH出現(xiàn)下降，約30 d后趨于穩(wěn)定狀態(tài)，本研究中土壤溶液pH在21 d后呈升高趨勢，這與供試土壤為弱酸性土壤有關，在酸性土壤中淹水至一定還原條件后，F(xiàn)e3+可被還原為 Fe2+[Fe(OH)3+3H++e-=Fe2++3H2O]，該過程消耗 H+，從而引起土壤溶液pH的增大。外源含硫有機物的添加對土壤pH變化影響不顯著，可能與本實驗體系中含硫有機物施加量較小有關。

3.2 淹水條件下含硫有機物對土壤銅形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響

土壤重金屬的化學行為與土壤固相粘土膠體、氧化物及有機質(zhì)等密切相關，此外土壤溶液的pH、競爭離子等也會影響重金屬在土壤固相中的吸附（Temminghoff et al.，1997）。在酸性土壤中，有機質(zhì)是影響重金屬如銅、鎘形態(tài)的重要因素之一，例如溶解性有機質(zhì)與銅通過化學鍵結合形成的Cu-DOC化合物可促進銅在土壤中的移動性和生物有效性（Temminghoffet al.，1994；Benedettiet al.，1995）。Weng et al.（2002）研究發(fā)現(xiàn)，相比其他重金屬（如Cd、Zn和Ni），Cu和Pb與溶解性有機質(zhì)結合更顯著，Nguyen et al.（2017）研究也發(fā)現(xiàn)根際土壤中有效態(tài)的Ni和Cu濃度與溶解性有機質(zhì)濃度呈正相關關系。本研究中所用到的含硫有機酸均為溶解性有機質(zhì)，可溶于水，因而在淹水21 d，有機酸添加組里土壤的可交換態(tài)銅含量均顯著高于對照組。

DTPA提取態(tài)重金屬用于表征重金屬的生物有效性，而有機質(zhì)的添加有利于提高土壤重金屬的生物有效性，Leita et al.（1999）研究發(fā)現(xiàn)土壤DTPA提取態(tài)重金屬含量隨著土壤有機碳施加量的增加而升高，可能是因為土壤有機質(zhì)礦化的過程中，金屬可被有機物釋放出來致使其移動性和有效性增大。此外，有機質(zhì)含量較高的條件下，自然存在的細菌等微生物代謝活動加劇，產(chǎn)生較多的水溶性有機化合物的增加可促進溶解態(tài)重金屬的增大。土壤水稻秸稈生物質(zhì)炭的添加可促進有機結合態(tài) Cu、Cd和Pb濃度增大（Luet al.，2017）。本研究中，淹水28 d后，有機酸添加處理組中的土壤DTPA提取態(tài)銅顯著高于對照組，而前期并沒有出現(xiàn)顯著性差異，表明有機酸的添加需要一定的時間平衡穩(wěn)定后，才會對土壤銅的生物有效性起到作用。

甲硫氨酸和半胱氨酸的等電點（pl）分別為5.74、5.2。土壤溶液中的 pH＞6，高于這兩個等電點，因為甲硫氨酸和半胱氨酸均可結合水中的OH-而帶負電，H+繼續(xù)在水溶液中而使得土壤溶液 pH降低，兩者因等電點相差不大導致土壤溶液pH無顯著差異。由于pH的降低導致施硫處理組中土壤CaCl2提取態(tài)Cu和DTPA提取態(tài)Cu含量均高于對照組，說明含硫有機分泌物的釋放會提高土壤 Cu的生物有效性。Cu的K邊XANES研究表明，有機硫施加促進土壤中纈氨酸銅（Cu-valine）含量的增加，而針鐵礦吸附態(tài)銅（Cu-goethite）含量減少，可能原因是由于淹水時間較短，施入土壤中的甲硫氨酸和半胱氨酸帶負電，甲硫氨酸的羧基及半胱氨酸的巰基被 OH-包被，能與 Cu起作用的主要是-NH2部分，從而使得 Cu與類似于纈氨酸的-NH2結合量增多。土壤中與-NH2結合的Cu能被DTPA絡合劑提取，因而淹水28 d后含硫有機化合物增大了DTPA提取態(tài)Cu濃度。

4 結論

（1）供試土壤中，隨著淹水時間的延長，土壤pH先降低后升高，而本實驗中小分子含硫有機酸的施加對土壤體系的pH的影響不顯著。

（2）淹水21 d后，小分子有機酸的增加可促進土壤可交換態(tài)銅含量的增大，而有機結合態(tài)銅含量降低，淹水28 d時，含硫有機酸添加對土壤可交換態(tài)銅含量影響不顯著，有機結合態(tài)銅含量顯著升高。

（3）淹水21 d后，土壤銅主要化學形態(tài)由纈氨酸銅、針鐵礦銅及硫化亞銅組成，而含硫有機物的施加可促進淹水 21 d土壤纈氨酸銅類化合物占比的增大，針鐵礦結合態(tài)銅的降低，銅主要與纈氨酸的-NH2結合。