繆煒倫 陳明龍 施姣姣

目前對(duì)心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)機(jī)制的研究多采用快速電刺激誘發(fā)動(dòng)物自發(fā)性房顫[1]或者是電刺激模式細(xì)胞如小鼠心房肌細(xì)胞(HL-1)細(xì)胞模型[2]，但是此方法需要耗費(fèi)較多的人力物力，并且存在種屬差異，不是后續(xù)進(jìn)行藥物篩查最優(yōu)選擇。

人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSC)技術(shù)發(fā)展至今，具有分化成心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞等多向分化潛能，已經(jīng)成為基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的重要工具[3]。其中心肌細(xì)胞已經(jīng)從非定向分化發(fā)展成可定向分化為心房肌、心室肌以及竇房結(jié)細(xì)胞[4]。筆者以利用hiPSC特異性分化為心房肌細(xì)胞構(gòu)建高頻電刺激心房細(xì)胞損傷模型，并探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 干細(xì)胞培養(yǎng)以及心房肌分化

將hiPSC株(NC5)(筆者實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建)種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)皿預(yù)先用基質(zhì)膠Matrigel(Corning公司)鋪板。干細(xì)胞培養(yǎng)使用mTeSR培養(yǎng)基(Stemcell Technologies公司)，待細(xì)胞長(zhǎng)到鋪滿90%以上的密度即可開(kāi)始分化。培養(yǎng)基更換成含2% B-27 minus insulin(Gibco公司)的RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)。分化方法分為兩組，心房肌組和傳統(tǒng)組。分化前4天方法相同。第0～1天，外加GSK-3抑制劑CHIR-99021(6μmol/L，Selleckchem公司)處理。第3～4天，外加Wnt通路抑制劑IWR-1(5 μmol/L，Sigma-Aldrich公司)處理。第5～7天心房肌組外加視黃酸(Retinoic Acid，RA, 2μmol/L，Sigma-Aldrich公司)處理而傳統(tǒng)組不添加。細(xì)胞分化的第8天更換成含有2% B-27supplement(Gibco公司)的RPMI1640溶液。細(xì)胞分化的第12～14天左右，細(xì)胞開(kāi)始跳動(dòng)，利用純化液(無(wú)糖DMEM,Gibco公司)純化48 h以除去非心肌細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至30天，細(xì)胞相對(duì)成熟，可用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 建立高頻電刺激心房肌損傷模型

用0.25%含EDTA的胰酶(Gibco公司)將分化第30天的心房肌肌細(xì)胞從分化培養(yǎng)皿中消化下來(lái)，種于六孔板中。待至少48 h細(xì)胞穩(wěn)定貼壁，并且再次出現(xiàn)跳動(dòng)后，可進(jìn)行電刺激實(shí)驗(yàn)。將經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理的電刺激電板(C-Pace100TMculture dishes，IonOptix公司)置于六孔板中與細(xì)胞培養(yǎng)液直接接觸，外接導(dǎo)電線于電刺激儀(C-Pace100TMculture Pacer，IonOptix公司)。分組：高頻組(RAP組)、對(duì)照組(Control組)。電刺激參數(shù)：電壓3 V，頻率7 Hz，刺激時(shí)間24 h。另外采用500 nmol/L 4-苯丁酸鈉(4PBA)預(yù)處理接受高頻電刺激的心房肌細(xì)胞，具體方法為將4-苯丁酸鈉4PBA加入培養(yǎng)液后進(jìn)行電刺激處理，后續(xù)實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行洗脫。

1.3 分子學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.3.1免疫熒光染色 將含有分化心房肌的爬片先用4%多聚甲醛室溫固定20 min，用PBS沖洗后Triton-X 100通透5 min。再用5%牛血清白蛋白封閉30 min。封閉結(jié)束后敷一抗，并在4°C中過(guò)夜(至少16 h)。主要的一抗包括：鼠抗α-actinnin(1∶100，Abcam公司)以及兔抗NR2F2(1∶200，Abcam公司)。一抗孵育過(guò)夜后室溫孵育二抗山羊抗兔IgG(Alexa Fluor?488, 1∶500, Abcam公司)以及驢抗IgG(AlexaFluor?488, 1∶500, Abcam公司)至少1 h后，PBS沖洗。最后用核染色劑DAPI(Life Technologies公司)染色封片。

1.3.2單細(xì)胞鈣瞬變檢測(cè) 應(yīng)用Fluo-3 AM(Life Technologies公司)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明，5 mol/L Fluo-3溶于DMSO中，混合20%(w/v)F-127(Sigma公司),同時(shí)加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，稀釋到工作濃度5 μmol/L。將細(xì)胞培養(yǎng)液替換成還有Fluo-3的溶液，并在37℃培養(yǎng)箱中孵育90 min后替換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)孵育30 min，最后替換成臺(tái)式液后在熒光顯微鏡下觀察。心肌細(xì)胞中的Fluo-3能夠被波長(zhǎng)為488 nm的光激發(fā)，同時(shí)放出波長(zhǎng)為520 nm的發(fā)射光，該發(fā)射光能被E3CMOS相機(jī)(Touptek公司)記錄。鈣瞬變通過(guò)ΔF/F0來(lái)計(jì)算，ΔF指代熒光強(qiáng)度相比于最小熒光強(qiáng)度F0的變化值。

1.3.3細(xì)胞凋亡流式檢測(cè) 高頻電刺激后，用無(wú)EDTA的胰酶消化心肌細(xì)胞，每個(gè)樣品管至少收集106個(gè)細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS沖洗兩次，離心吸干上清之后用每管300 μl緩沖液重懸細(xì)胞。同時(shí)加入annexin V/PI(BD Pharmingen公司)，室溫避光孵育20 min。樣品在1 h內(nèi)通過(guò)流式檢測(cè)儀(BD FACSCalibur)檢測(cè)。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) 利用TRIzol(Invitrogen公司)提取細(xì)胞RNA。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript Reverse Transcriptase(Bio-Rad公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列由ThermoFisher公司設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1。利用SYBR Green(Bio-Rad公司)進(jìn)行熒光定量，并在AB 7900HT Real-Time PCR System (ABI公司，美國(guó))上進(jìn)行檢測(cè)。內(nèi)參采用GAPDH。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有的數(shù)據(jù)均用Graphpad Prism5軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組分化方法以及電刺激前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 人源誘導(dǎo)干細(xì)胞分化特異性心房肌細(xì)胞(iPSC-atrial CM)

心房肌組一般在第14天左右細(xì)胞會(huì)開(kāi)始跳動(dòng)，而傳統(tǒng)組一般稍早一些，在12天左右開(kāi)始跳動(dòng)。當(dāng)分化達(dá)到30天時(shí)，認(rèn)為心肌細(xì)胞相對(duì)成熟。兩組分化細(xì)胞均表達(dá)心肌細(xì)胞肌節(jié)結(jié)構(gòu)α-actinnin，心房肌組表達(dá)心房肌細(xì)胞特有的核蛋白NR2F2，但傳統(tǒng)組幾乎不表達(dá)。見(jiàn)圖1。同時(shí)qRT-PCR結(jié)果顯示，心房肌組NR2F2表達(dá)量也明顯高于傳統(tǒng)分化組[4.763±0.244 7(n=6) vs 1.032±0.146 7(n=6),P<0.05]。

2.2 鈣穩(wěn)態(tài)比較

RAP組心房肌細(xì)胞的鈣瞬變峰值ΔF/F0相比Control組明顯下降[0.783 3±0.104 7(n=10) vs 2.401 0±0.161 8(n=15),P<0.05]，見(jiàn)圖2，RAP組相比于Control組RYR2基因的表達(dá)量也明顯下降[0.563 6±0.076 1(n=6) vs 1.009±0.091 4(n=6),P<0.05]。為了檢測(cè)4PBA對(duì)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用，增設(shè)一組(4PBA+RAP組)進(jìn)行三組比較，見(jiàn)圖3。4PBA+RAP組的鈣瞬變峰值ΔF/F0相比于RAP組明顯增加[2.274 0±0.169 7(n=17) vs 1.276 0±0.135 6(n=10)，P<0.05]，但與對(duì)照組無(wú)差異[2.679 0±0.123 9(n=10),P>0.05]。見(jiàn)圖3。

圖1 心房肌組以及傳統(tǒng)組心肌細(xì)胞免疫熒光染色

圖2 兩組鈣瞬變(ΔF/F0)比較

圖3 4-PBA預(yù)處理后鈣瞬變?chǔ)/F0比較

2.3 兩組細(xì)胞凋亡比較

RAP組細(xì)胞的早期凋亡(AV+/PI-)以及晚期凋亡(AV-/PI+)比率之和明顯高于Control組[55.27%±2.24% vs 19.41%±0.84%，P<0.005]，見(jiàn)圖4。同時(shí)RAP組相比于Control組促進(jìn)凋亡指標(biāo)bax表達(dá)上升[1.309±0.022(n=6) vs 1.003±0.050(n=6)，P<0.05]；抑制凋亡指標(biāo)bcl-2表達(dá)下降[0.383±0.011(n=6) vs 1.005±0.068(n=6),P<0.05]。

圖4 兩組細(xì)胞早期凋亡以及晚期凋亡比例之和

3 討論

人源誘導(dǎo)分化多能干細(xì)胞技術(shù)發(fā)展以來(lái)，被廣泛應(yīng)用于建立疾病模型、藥物篩查應(yīng)用以及細(xì)胞治療等方面,該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于利用iPSC可以分化成特異性的目的細(xì)胞[5]。本研究旨在于將干細(xì)胞定向分化為心房肌細(xì)胞，取代HL-1，打破傳統(tǒng)機(jī)制研究以及藥物篩查的種屬差異，并能夠?yàn)楹笃诖蠓秶幬锖Y查以及毒理研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。利用筆者實(shí)驗(yàn)室已建立的正常人iPSC細(xì)胞系(NC5)為基礎(chǔ)[6]，通過(guò)RA誘導(dǎo)分化技術(shù)[7-9]將干細(xì)胞定向分化為心房肌細(xì)胞。分化達(dá)到30天的心房肌細(xì)胞經(jīng)染色顯示表達(dá)心房肌特異性核蛋白(NR2F2)，并且基因表達(dá)量也明顯高于傳統(tǒng)分化方法分化所得細(xì)胞，證實(shí)該技術(shù)確實(shí)可以提高心房肌的分化效率。

先前的研究通過(guò)高頻刺激兔心房誘發(fā)房顫發(fā)現(xiàn)心房肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的鈣穩(wěn)態(tài)異常[10]。在筆者的研究中首次電刺激人源誘導(dǎo)干細(xì)胞分化特異性心房肌細(xì)胞，從人源角度細(xì)胞水平探討心房肌在接受高頻電刺激后的損傷變化。結(jié)果顯示，iPSC-atrial CM在接受了高頻電刺激后出現(xiàn)了相同的鈣穩(wěn)態(tài)異常表現(xiàn)。同時(shí)，有研究表明房顫發(fā)生后鈣穩(wěn)態(tài)改變與細(xì)胞鈣離子通道活動(dòng)異常有關(guān)[11]，所以筆者檢測(cè)細(xì)胞鈣交換相關(guān)離子通道RYR2的表達(dá)量，它是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上參與鈣觸發(fā)-鈣釋放的離子通道，與細(xì)胞內(nèi)鈣超載密切相關(guān)，結(jié)果顯示RYR2在mRNA水平表達(dá)下降。mRNA水平改變與蛋白質(zhì)水平改變并不是一定是平行關(guān)系，但是先前的研究表明RYR2蛋白水平下降，同時(shí)伴隨著鈣電流的減小[6]。由于細(xì)胞內(nèi)鈣超載也是導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡很重要的原因，所以筆者檢測(cè)高頻電刺激對(duì)于心房肌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示高頻電刺激會(huì)引起心房肌細(xì)胞凋亡增加。以上結(jié)果表明，iPSC-atrial CM接受高頻電刺激后出現(xiàn)的損傷改變與動(dòng)物模型中房顫發(fā)生后的鈣穩(wěn)態(tài)異常有著共同處，因此可以從該角度模擬房顫損傷機(jī)制。為了檢測(cè)高頻電刺激對(duì)于心房肌細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)損傷是否具有保護(hù)作用，筆者利用一種新型化學(xué)分子伴侶4PBA處理接受高頻電刺激的心房肌細(xì)胞。有研究表明，4PBA能夠有效抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，改善非折疊蛋白功能，減輕肌細(xì)胞的損傷[12]。所以筆者用4-PBA處理接受高頻電刺激的心房肌細(xì)胞，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)4PBA處理的心房肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)異常明顯減輕，這可能與4PBA改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。4PBA可以作為一種潛在的保護(hù)心房肌細(xì)胞免于高頻電損傷的治療方法。