邵夢嬌 張玲 商魯翔 石佳 馮敏 李耀東 湯寶鵬 周賢惠

近年來研究證實(shí)β1腎上腺素能受體自身抗體(β1 adrenergic receptor antibodies，β1AR)表達(dá)增強(qiáng)在心律失常發(fā)生中發(fā)揮一定的病理生理作用[1-2]，在不適當(dāng)竇性心動過速和房性心律失常患者中均可檢測到β1AR表達(dá)增強(qiáng)[3-5]。而非瓣膜心房顫動(AF)患者血清中β1AR表達(dá)增強(qiáng)，同時自身抗體水平對導(dǎo)管消融術(shù)后復(fù)發(fā)起預(yù)測作用，是AF消融術(shù)后的獨(dú)立預(yù)測因子[6]。然而β1AR表達(dá)增強(qiáng)誘發(fā)AF的機(jī)制，目前尚不清楚。筆者擬通過β1腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段(β1多肽)建立β1AR陽性的兔模型，觀察β1AR表達(dá)增強(qiáng)促進(jìn)AF發(fā)生及維持是否與心房電重構(gòu)相關(guān)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 成年新西蘭大白兔24只，體重為2.5～3.5 kg，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心提供[許可證號：SYXK(新)2010-0001]，溫度18～25℃，相對濕度40%～60%，光照明暗各12 h，每籠1只，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院使用管理倫理委員會批準(zhǔn)(許可證號:IACUC-20170420-03 ) 。

24只新西蘭大白兔通過隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為兩組：對照組(Con組，n=12)和β1AR組(n=12)。

1.2β1多肽免疫 每次免疫使用分離純化的2 mg多抗原肽(包含β1受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段氨基酸序HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNR，GenScript，Piscataway，NJ)[7]，另外給予1 ml Freund′s佐劑(第1次免疫使用完全弗氏佐劑，第2次及以后使用不完全弗氏佐劑，美國sigma公司)用渦旋混合器充分混合，使其完全乳化。每兩周免疫一次，共免疫4次。每次采用常規(guī)微量免疫法免疫兔，沿背部皮下多點(diǎn)注射。每次免疫前采耳緣靜脈血備用。Con組為正常新西蘭大白兔，與β1AR組同時開始飼養(yǎng)，除不加β1多肽外其余同β1AR組處理。

1.3β1AR水平的測定 于0、2、4、6 w采耳緣靜脈血，收集的全血置于室溫下1 h，3 000轉(zhuǎn)離心取血清，通過酶聯(lián)免疫吸附測定血清中抗體免疫情況，觀察血清內(nèi)抗體效價是否增加來驗(yàn)證造模是否成功。將β1AR多肽 (100 ug/100 ul)溶解于19.9 ml 無水硫酸鈉中，配制成終濃度為5 μg/ml 的抗原包被液。將20 mL包被液，每孔以50 ul 量包被酶標(biāo)板。血清按1∶10 000濃度進(jìn)行倍比稀釋后，以50 ug/孔在酶標(biāo)板上加入倍比稀釋的血清。帶有堿性磷酸酶的山羊抗兔IgG用以檢測結(jié)合抗體1 h后在450 nm測光密度值(OD)，每次測定均設(shè)有空白對照和陰性、陽性對照。

1.4心內(nèi)電生理檢測 心內(nèi)電生理檢測包括心房有效不應(yīng)期(AERP)的測定、AF誘發(fā)率、AF持續(xù)時間的測定及平均心率的記錄。每只兔在免疫前的基礎(chǔ)狀態(tài)和免疫后8周行心內(nèi)電生理檢測。術(shù)前12 h禁食，6 h禁飲。氯胺酮 (20 mg/Kg)基礎(chǔ)麻醉，3%戊巴比妥鈉維持麻醉，靜脈推注肝素1000 U抗凝。將兔仰位固定于兔臺上，備皮、固定、氣管插管和輔助呼吸，調(diào)節(jié)氧流量4～6 L / min，潮氣量為10 mL/kg，呼吸壓力0 ～ 2 KPa。采用LEAD- 7000 電生理儀(四川錦江電子科技)行心內(nèi)電圖和體表心電圖監(jiān)測。分離暴露頸靜脈，切開后置入6F鞘管，經(jīng)鞘管插入一根 4F十極電極(電極間距2 mm)至心內(nèi)膜高右房(HRA)做記錄電極，刺激電極為記錄電極的相鄰電極。以心內(nèi)電生理圖出現(xiàn)高大 A波小V波為理想記錄圖，固定電極導(dǎo)管，觀察波形保證每只動物測量部位大致相同。①心房有效不應(yīng)期(AERP)的測定：以高出竇性心率 10 %～ 20 %的頻率起搏,脈寬0.5 ms, 測定起搏閾值。以起搏閾值 2 倍為輸出電壓, 采用 S1S2遞減刺激測量AERP，S1S2=220 ms，S1∶S2=8∶1，步長 5 ms。以不能下傳心房的最長的S1S2間期為 AERP。②AF誘發(fā)率及持續(xù)時間：測定通過Burst刺激(持續(xù)約3～5 s)，20 Hz頻率，2倍舒張期閾值電壓。刺激的位置位于右心房，Burst刺激的位置選在A波大，V波很小的位置。記錄刺激后非持續(xù)性或持續(xù)性心律失常的誘發(fā)情況。記錄刺激后非持續(xù)性(<5 s)或持續(xù)性(≥5 s)心律失常的誘發(fā)情況。每只兔給予5次刺激，每組共給予60次刺激。心律失常的定義遵循Lambeth Conventions心律失常分類法[8]。竇性心動過速定義為規(guī)則，快速的心率≥200 次/分伴1∶1 房室傳導(dǎo)，心房激動起源于竇房結(jié)，心內(nèi)電圖心房電圖發(fā)生于P波的起始；房性心動過速: 規(guī)則，快速的心率≥200 次/分，有一個固定的A-A間期伴心內(nèi)電圖心房電圖發(fā)生于P波之后(一般位于P波尖峰左右)。心房撲動:規(guī)律，快速的心房率≥250次/分，規(guī)律的明顯的P波在QRS波之間。交界性心動過速:規(guī)則，快速的心房率≥200次/分，伴1∶1房室傳導(dǎo)，心內(nèi)電圖中相關(guān)ECG導(dǎo)聯(lián)心房電圖恰好優(yōu)先于QRS波群。AF:不規(guī)則，快速的心房率≥500 次/分，R-R間期絕對不等。心房率大于心室率。③平均心率的測定：至少連續(xù)測量10個心室周期后根據(jù)這10個心動周期的時間換算為一分鐘的次數(shù)。反復(fù)測量3次取平均值。

1.5離子通道蛋白及縫隙連接蛋白水平的測定 安樂死處死動物后，留取左房心肌，厚約2cm。①應(yīng)用Westernblot分析Kir3.1、Cav1.2及縫隙連接蛋白(Cx43,Cx40)的表達(dá)量,相應(yīng)的一抗分別為Connexin 43 / GJA1小鼠單克隆抗體(ab11369,abcam公司；稀釋比例：1∶400 )、縫隙連接蛋白40抗體(bs-1050R，北京博奧森公司；稀釋比例：1∶500)、Anti-CACNAlC抗體(ab84814，abcam公司；稀釋比例：1∶400)和Anti-KCNJ3(ab116126，abcam公司；稀釋比例：1∶500)檢測方法如以前研究所述,以內(nèi)參β-actin(BM0627，博士德生物公司;稀釋比例1∶600)條帶光密度值作為標(biāo)準(zhǔn) ,計(jì)算相關(guān)蛋白表達(dá)的相對量。②mRNA表達(dá)的檢測：測量指標(biāo)同westernblot，采用Trizol一步法提取總RNA并用DNA酶處理,按試劑盒說明一步法逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增RNA,雙向引物由上海生物工程有限責(zé)任公司提供。用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析,以內(nèi)參 β-actin mRNA 條帶光密度值作為標(biāo)準(zhǔn) , 計(jì)算mRNA表達(dá)的相對量。上下游引物見表1。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

24只新西蘭大白兔造模過程中無死亡，均完成實(shí)驗(yàn)。

2.1兩組各時間點(diǎn)血清中β1AR的水平 0w時Con組與β1AR組抗體水平無差異(P>0.05)。與Con組相比，β1AR組隨著時間點(diǎn)的推移血清中β1AR水平顯著升高，與0w及Con組相應(yīng)時間點(diǎn)比較有差異(P<0.05),見表2。

2.2AF誘發(fā)率及持續(xù)時間 免疫前Con組與β1AR組心律失常發(fā)生率無差異[8.3% (1/12) vs 8.3% (1/12),P>0.05], 兩組均有1只發(fā)生竇性心動過速，無AF發(fā)生。免疫后β1AR組心律失常發(fā)生率高于Con組[83.3%(50/60) vs 18.3%(11/60),P<0.05]。其中β1AR組發(fā)生AF 20次，占33.3%，其中11次為持續(xù)性AF，持續(xù)時間(24.66±40.92)s；Con組未發(fā)生AF,見圖1。

表2 兩組各個時間點(diǎn)血清內(nèi)β1AR表達(dá)水平/(ng/L)

注：w =周；與Con組比較，*P< 0.05 ;與同組0 w比較,#P< 0.05

A：Con組免疫前，Burst刺激后出現(xiàn)竇性心律，心率157次/分；B：β1AR組免疫前Burst刺激后出現(xiàn)竇性心動過速，心率240次/分；C：Con組免疫后Burst刺激后出現(xiàn)竇性心律，心率160次/分；D：β1AR組免疫后Burst刺激后出現(xiàn)AF，心率210次/分

圖1兩組免疫前后的心電圖

2.3AERP及心率改變 兩組免疫前AERP及心率無差異，Con組免疫后較免疫前心率增快,但AERP無差異。β1AR組免疫后較免疫前及Con組免疫后AERP縮短和心率顯著增快(P均<0.05)，見表3。

表3 兔模型免疫前后電生理指標(biāo)

注：與Con組比較，*P<0.05；與同組免疫前比較，#P<0.05

2.4離子通道蛋白及縫隙連接蛋白的表達(dá) 與Con組比較，β1AR組Cx43和Cav1.2降低；Cx40和Kir3.1升高，見表4，灰度圖見圖2。

2.5離子通道蛋白及縫隙連接蛋白mRNA的表達(dá) 與Con組相比，β1AR組Cx43和Cav1.2顯著降低, Cx40和Kir3.1顯著升高，見表5。

表4 各組離子通道蛋白及縫隙連接蛋白表達(dá)相對值

注：與Con組比較，*P<0.05

圖2 各組離子通道蛋白及縫隙連接蛋白的表達(dá)

3 討論

β1AR是心臟G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)成員,構(gòu)成心臟β腎上腺素能受體補(bǔ)體的70%～80%，正常機(jī)體中含量低，無影響。病理性增高會誘發(fā)AF[5]。本研究用2 mg β1受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段與等體積佐劑的混合，采用常規(guī)微量多次免疫法，背部皮下多點(diǎn)注射。經(jīng)過6周β1AR的免疫，隨著時間的推移血清中抗體效價增高，但未注射的對照組抗體效價基本無變化，可說明模型制作成功。β1AR升高會縮短ERP、提高AF發(fā)生率，并導(dǎo)致心房電重構(gòu)，而電重構(gòu)為已知的AF促發(fā)AF的機(jī)制之一，但β1AR致AF和電重構(gòu)的具體機(jī)制尚不明確，可能與其能特異性識別受體第二胞外環(huán)，在體外心肌細(xì)胞中起著一種擬交感神經(jīng)作用相關(guān)，擬交感作用可以引起腎上腺素分泌增加，激活β腎上腺素通路，促進(jìn)離子通道改變，促進(jìn)電重構(gòu)[4]。

表5 各組離子通道蛋白及縫隙連接蛋白mRNA表達(dá)相對值

注：與Con組比較，*P<0.05

本研究還發(fā)現(xiàn)，β1AR表達(dá)增加會減少心房肌細(xì)胞Cav1.2、增加Kir3.1；減少Cx43、增加Cx40。 Cav1.2是鈣電流，是復(fù)極相主要內(nèi)向電流，其減弱使外向電流相對增加從而使心肌復(fù)極加快和ERP縮短。乙酰膽堿敏感鉀通道(KAch)是由Kir3.1(GIRK1)和Kir3.4(GIRK4) 組成的四聚物從而加大了復(fù)極電流，縮短了AERP。我們猜測可能原因是：β1AR特異性識別受體第二胞外環(huán)，在體外心肌細(xì)胞中起著一種擬交感神經(jīng)的作用，能激活β腎上腺素受體信號通路，通路激活后引起Gs和Gi蛋白激活，導(dǎo)致蛋白激酶A(PKA)激活和心肌細(xì)胞靶通道經(jīng)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)介導(dǎo)磷酸化[9]。而減少cAMP和PKA的產(chǎn)生使L型鈣通道離子流密度減小，失活后恢復(fù)減慢[3]。Gs蛋白又能激活KAch，其開放促進(jìn)K+外流使膜超極化，KAch的組成基因也相應(yīng)的上調(diào)，從而加大了復(fù)極電流，縮短了AERP，使心房進(jìn)一步發(fā)生電重構(gòu)[10]。

Cx43和Cx40是構(gòu)成心房細(xì)胞縫隙連接的主要亞基，Cx43是心肌縫隙連接通道含量最豐富的連接蛋白，在閏盤以端對端分布為主[11-12]。Cx40 絕大多數(shù)位于心肌橫向邊界參與心肌的橫向傳導(dǎo)，Cx40 表達(dá)水平的增加，就會導(dǎo)致心房肌局部傳導(dǎo)各向異性不均勻一致，其結(jié)果是增加AF的易感性，與AF患者心肌易損性增加密切相關(guān)[13]。本研究中，與Con組相比，不管是在蛋白水平，還是mRNA水平上，β1AR組心房肌組織中 Cx40 表達(dá)水平明顯增高而 Cx43 表達(dá)水平顯著降低?？赡艿臋C(jī)制是：β1AR特異性擬交感神經(jīng)的作用，而β1AR表達(dá)增強(qiáng)可以促進(jìn) Cx43的降解。也有研究表明，Cx43的低表達(dá)與Cx40的高表達(dá)與交感神經(jīng)活性增強(qiáng)有關(guān)，而交感神經(jīng)激活又可以激活β腎上腺素通路引起了心肌細(xì)胞離子通道改變，最終導(dǎo)致引起電重構(gòu)[14]。因此，針對自身抗體陽性的AF患者，可能提供了一種調(diào)控自身免疫的新型治療策略。