張 悅

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院農(nóng)副食品所，陜西西安 710048）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國(guó)人均年飲奶量大幅度提高，而現(xiàn)階段仍然存在乳品生產(chǎn)摻假行為[1]?，F(xiàn)階段檢測(cè)摻假的方法也一直在更新探索，如利用特有氨基酸檢測(cè)[2-3]、利用蛋白質(zhì)的溶解性差異檢測(cè)、利用蛋白質(zhì)的抗原特異性檢測(cè)等，其涉及了色譜、質(zhì)譜、免疫、PCR、電泳、光譜等多種檢測(cè)技術(shù)[4]。

現(xiàn)階段已有研究利用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)牛奶中摻入的豆奶蛋白[5]，而研究從牛、羊乳蛋白和大豆蛋白化學(xué)特性的異同上，通過(guò)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)區(qū)分乳蛋白和大豆蛋白的特征性蛋白質(zhì)組分，進(jìn)而能定量鑒定大豆蛋白的摻假檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

牛、羊乳粉和大豆蛋白粉，購(gòu)于西安銀橋乳業(yè)集團(tuán)公司。

1.1.2 試劑

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、過(guò)硫酸銨（APS）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R-250、冰醋酸、甲醇、溴酚藍(lán)（BPB）、低分子量蛋白Maker。

1.1.3 設(shè)備

生物電泳圖像分析系統(tǒng)、電子天平、伯樂(lè)小型垂直電泳槽、電泳供電裝置、電熱恒溫水浴鍋、pH計(jì)等。

1.1.4 分析軟件

使用Quantity One（美國(guó)伯樂(lè)） 對(duì)SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行分析處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

采用凱氏定氮法測(cè)定牛乳粉、羊乳粉、大豆蛋白粉的總蛋白質(zhì)含量。計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)量濃度，使得SDS-PAGE電泳時(shí)上樣質(zhì)量濃度保持在1 μg/μL。

在各離心管中加入80 μL樣品溶液和20 μL上樣緩沖液，混勻，并于95℃水浴加熱5 min，自然冷卻后放4℃保存，準(zhǔn)備電泳試驗(yàn)。

1.2.2 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳

（1）按照乳的蛋白分布。下層凝膠（12.5%） 和上層凝膠（4%）配制方法。

凝膠電泳凝膠buffer見(jiàn)表3。

表3 凝膠電泳凝膠buffer /μL

電泳分2步進(jìn)行S1：80 V，15 min；S2：120 V，3 h并根據(jù)需要結(jié)束電泳。

（2）考馬斯亮藍(lán)染色分析。染色液靜置過(guò)夜后，脫色過(guò)夜，將凝膠放置于生物電泳圖像分析系統(tǒng)中成像，使用Quantity One軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 牛、羊乳粉和大豆蛋白SDS-PAGE電泳分析

通過(guò)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳比較乳蛋白和大豆蛋白的蛋白質(zhì)組分異同。

1.2.4 牛、羊乳粉中分別摻入梯度大豆蛋白鑒別

分別按0，5%，10%，15%，20%，25%，30%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度向牛、羊乳粉中摻入大豆蛋白粉，通過(guò)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳找出了區(qū)分乳蛋白和大豆蛋白的特征性大豆蛋白，并對(duì)其進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛、羊乳蛋白和大豆蛋白組分比較

牛、羊乳蛋白和大豆蛋白電泳分析圖見(jiàn)圖1。

圖1 牛、羊乳蛋白和大豆蛋白電泳分析圖

由圖1分析可知，乳中主要蛋白酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白都得到了明顯分離，與唐萍等人[6]檢測(cè)到的電泳條帶基本一致，牛、羊乳蛋白組分和大豆蛋白組分有顯著區(qū)別，其中大豆蛋白組分中，分子量在46～58 kDa時(shí)有2個(gè)特征的組分條帶，分子量在17 kDa附近也有一條特征組分條帶。

2.2 牛、羊乳粉分別摻入不同梯度大豆蛋白鑒別結(jié)果

牛、羊乳粉分別摻入質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度（0，5%，10%，15%，20%，25%，30%）大豆蛋白進(jìn)行鑒別。

牛乳蛋白摻入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度大豆蛋白質(zhì)電泳分析圖見(jiàn)圖2。

圖2 牛乳蛋白摻入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度大豆蛋白質(zhì)電泳分析圖

由圖2可知，隨著摻入的大豆蛋白添加量越大，牛乳蛋白固有條帶間增加的數(shù)條大豆蛋白條帶的含量逐漸增加，大豆蛋白中的3種特征性蛋白組分A，B，C的占比也越大，其光密度也越大，且都隨加入量的增加有顯著的線性關(guān)系，其線性關(guān)系見(jiàn)圖3。這與宋宏新等人[7]利用SDS-PAGE法分析牛乳蛋白中摻假大豆蛋白粉的情況一致；因此，可以挑選出蛋白組分A，B，C作為大豆蛋白的特征性組分，找出的特征性大豆蛋白組分A占比（光密度占整個(gè)大豆蛋白組分光密度的百分比）28%，蛋白組分B占比20.5%，蛋白組分C占比19.4%，其中蛋白組分A的分子量在23 kDa附近，蛋白組分B的分子量在58 kDa附近，蛋白組分C的分子量在46 kDa附近。

特征大豆蛋白組分A，B，C光密度與大豆蛋白添加量的線性關(guān)系（牛乳） 見(jiàn)圖3。

綜合大豆蛋白的特征組分A，B，C，確定最后向牛乳粉中摻入大豆蛋白的添加量與特征組分光密度的線性關(guān)系：Y=1.011X+7.857，R2=0.971。

牛乳粉中摻入大豆蛋白的添加量與特征組分光密度的線性關(guān)系見(jiàn)圖4，羊乳蛋白摻入梯度大豆蛋白電泳分析圖見(jiàn)圖5。

圖3 特征大豆蛋白組分A，B，C光密度與大豆蛋白添加量的線性關(guān)系（牛乳）

圖4 牛乳粉中摻入大豆蛋白的添加量與特征組分光密度的線性關(guān)系

由圖5可知，隨著摻入的大豆蛋白添加量越大，大豆蛋白中的3種特征性蛋白質(zhì)組分A，B，C的占比也越大，其光密度也越大，且都隨添加量的增加有顯著的線性關(guān)系。

圖5 羊乳蛋白摻入梯度大豆蛋白電泳分析圖

特征大豆蛋白組分A，B，C光密度與大豆蛋白添加量的線性關(guān)系（羊乳） 見(jiàn)圖6。

圖6 特征大豆蛋白組分A，B，C光密度與大豆蛋白添加量的線性關(guān)系（羊乳）

綜合大豆蛋白的特征組分A，B，C，確定最后向羊乳粉中摻入大豆蛋白的添加量與特征組分光密度的線性關(guān)系：Y=1.283X+3.803，R2=0.966。

羊乳粉中摻入大豆蛋白的添加量與特征組分光密度的線性關(guān)系見(jiàn)圖7。

綜上所述，用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，可以快速直觀地反映大豆蛋白粉摻入乳粉的情況，且效果顯著。

3 結(jié)論

（1）牛、羊乳蛋白組分與大豆蛋白組分有顯著區(qū)別。

（2） 找出了特征性大豆蛋白組分A占比28%，蛋白組分B占比20.5%，蛋白組分C占比19.4%，且都隨添加量的增加有顯著的線性關(guān)系。

圖7 羊乳粉中摻入大豆蛋白的添加量與特征組分光密度的線性關(guān)系

（3）選取特征性大豆蛋白組分A，B，C建立綜合曲線，得到大豆蛋白摻假乳蛋白的線性關(guān)系：大豆蛋白摻入牛乳粉中（Y=1.011X+7.857，R2=0.971），大豆蛋白摻入羊乳粉中（Y=1.283X+3.803，R2=0.966）。