張楷樂 楊 熙 牛長梅 趙偉新 楊冉星 王 營 胡曉勇 傅 強(qiáng)

尿道狹窄是泌尿外科的常見疾病，嚴(yán)重影響患者的排尿功能和生活質(zhì)量[1]。采用自體口腔黏膜等進(jìn)行尿道修復(fù)，會不可避免地引起取材部位的并發(fā)癥，如口腔出血、炎性反應(yīng)、感染、疼痛、麻木、咬合困難等[2]。近年來組織工程支架材料的改性研究取得了長足的進(jìn)步，能夠為細(xì)胞提供必要的支撐結(jié)構(gòu)和孔隙，但是現(xiàn)有的組織工程尿道在臨床轉(zhuǎn)化中仍有不足之處。傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)在控制支架孔隙率、微觀結(jié)構(gòu)和孔隙連接等方面仍然有困難，限制了細(xì)胞的長入，以及營養(yǎng)物質(zhì)與細(xì)胞廢物的交換[3]。鑒于傳統(tǒng)組織工程尿道的局限性，探索更加科學(xué)的組織工程尿道構(gòu)建技術(shù)迫在眉睫。

近年來，三維(3D)打印技術(shù)因其能夠突破傳統(tǒng)組織工程領(lǐng)域遇到的多重挑戰(zhàn)已受到廣泛關(guān)注，其基本概念是利用紙層疊原理進(jìn)行快速成型的技術(shù)。3D打印機(jī)與普通噴墨打印機(jī)的工作原理相似，只是改變了噴墨材料的結(jié)構(gòu)，3D打印機(jī)的噴頭根據(jù)數(shù)字建模添加每一層材料，最后得到3D結(jié)構(gòu)原型[3]。這一技術(shù)能夠自由控制組織工程支架的規(guī)格和形狀、孔徑的分布和連接等指標(biāo)。目前在無生命體3D打印技術(shù)的基礎(chǔ)上，已能夠通過打印多種細(xì)胞實現(xiàn)3D結(jié)構(gòu)組織和器官的構(gòu)建，包括心臟瓣膜[4-5]、血管[6-7]、骨骼肌[8-9]、神經(jīng)[10-11]、皮膚[12]等，該技術(shù)被命名為生物打印技術(shù)，有望解決傳統(tǒng)組織工程尿道中存在的問題[13]。本課題研究組在前期研究[14]中使用聚乳酸和纖維蛋白原水凝膠3D打印，構(gòu)建了世界上第1例尿道管腔結(jié)構(gòu)，獲得了尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的生長數(shù)據(jù)，然而該管腔結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能較弱，尚不適合應(yīng)用于體內(nèi)修復(fù)。

本研究使用兔尿道組織和脫細(xì)胞基質(zhì)作為模板，分離兔尿道成纖維細(xì)胞，使用3D生物打印技術(shù)結(jié)合海藻酸鈉和纖維蛋白原水凝膠共同制備兩種負(fù)載兔成纖維細(xì)胞的仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片，是國際上第1項將3D生物打印技術(shù)應(yīng)用于組織工程尿道補(bǔ)片的制備和評估的研究，將對后續(xù)的尿道再生醫(yī)學(xué)的研究起到借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 尿道組織學(xué)指標(biāo)和細(xì)胞獲取 提取兔自體尿道組織，石蠟包埋。將包埋的組織切至0.8 μm厚，之后進(jìn)行H-E染色，獲得尿道的組織學(xué)信息。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行兔尿道上皮層和平滑肌層的測量。兔尿道經(jīng)0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗后去除黏膜層面，剪碎黏膜下層，以0.25%胰酶消化1 h，使用加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)和擴(kuò)增，用于3D生物打印。

1.2 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片結(jié)構(gòu)設(shè)計

1.2.1 補(bǔ)片結(jié)構(gòu)設(shè)計1 內(nèi)層(底層)為2層無孔隙的海藻酸鈉水凝膠；中間層為2層有孔隙的海藻酸鈉水凝膠，含上皮細(xì)胞；外層(頂層)為4層有孔隙的海藻酸鈉水凝膠，含平滑肌細(xì)胞。海藻酸鈉水凝膠配置：明膠20 mg/mL、海藻酸鈉20 mg/mL(輻照滅菌)溶于PBS中，在37 ℃溶解混勻。交聯(lián)劑為5%氯化鈣。打印過程：將配置好的水凝膠裝入3D打印針筒中，邊打印邊霧化5%氯化鈣交聯(lián)以維持水凝膠形態(tài)。打印參數(shù)：大小分別為2 cm×2 cm和2 cm×5 cm；針頭300 μm；絲距1.5 mm(中間層和頂層)，500 μm(底層，無孔隙)；速度180 mm/s；機(jī)械擠壓量0.345 μL/s；層高0.15 mm。仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1打印完成后，再將水凝膠浸入5%氯化鈣中交聯(lián)30 min。

1.2.2 補(bǔ)片結(jié)構(gòu)設(shè)計2 內(nèi)層(底層)為2層無孔隙的海藻酸鈉水凝膠；中間層為2層有孔隙的海藻酸鈉水凝膠和纖維蛋白原水凝膠，纖維蛋白原水凝膠中含上皮細(xì)胞；外層(頂層)為4層有孔隙的海藻酸鈉水凝膠和纖維蛋白原水凝膠，纖維蛋白原水凝膠中含平滑肌細(xì)胞。纖維蛋白原水凝膠配置：明膠45 mg/mL、纖維蛋白原30 mg/mL、透明質(zhì)酸3 mg/mL、甘油100 g/L。配置方法：將透明質(zhì)酸溶于高糖DMEM中于37 ℃攪拌過夜，加入纖維蛋白原、明膠、甘油攪拌1 h，用0.45 μm過濾器過濾備用。交聯(lián)劑：凝血酶溶液20 U/mL。打印過程：將配置好的水凝膠裝入3D打印針筒中，邊打印邊霧化5%氯化鈣交聯(lián)以維持水凝膠形態(tài)，在海藻酸鈉水凝膠的網(wǎng)格中填充纖維蛋白原水凝膠。打印參數(shù)：大小分別為2 cm×2 cm和2 cm×5 cm；針頭200 μm；絲距1.5 mm；速度180 mm/s；機(jī)械擠壓量0.1 μL/s；層高0.15 mm。仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片2打印完成后，再將水凝膠浸入含有5%氯化鈣和20 U/mL的凝血酶中交聯(lián)30 min。

1.3 生物降解實驗和生物力學(xué)測試 生物降解實驗：制備仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1，分成兩組，每組每個時間點(diǎn)設(shè)置3個平行樣，提前稱重每個離心管并標(biāo)號(W1)，將樣品分別放入標(biāo)記好的離心管中，放入37 ℃烘箱中烘干。烘干后精確稱重(W2)。離心管中加入75%乙醇溶液，并用紫外輻照30 min，棄去乙醇，用滅菌水清洗3遍。將Ⅱ型膠原酶溶于DMEM中配制成2 U/mL的溶液。其中一組樣品放入含有Ⅱ型膠原酶(2 U/mL)的溶液中，另一組放入滅菌水中作為對照組，每管放入的溶液均為2 mL。將全部樣品放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，每2 d換液。設(shè)置的時間周期為30 d，時間間隔分別是第7、14、21、30天。在每個預(yù)定的時間點(diǎn)取出樣品后，用滅菌水輕輕洗滌2次，然后將含有樣品的離心管放入37 ℃烘箱中烘干。稱取含有樣品的離心管(W3)，根據(jù)公式即可得到降解后每個時間點(diǎn)樣品的剩余量。剩余量百分?jǐn)?shù)=(W3-W1)/(W2-W1)×100%。降解時間分別為7、14、21、30 d。

生物力學(xué)測試：使用電子游標(biāo)卡尺測量支架的橫切面，分別測量仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1的尿道支架，以及兔自體尿道的寬度和厚度。設(shè)置拉力機(jī)兩個鉗夾的距離為1.4 cm，配置100 N的拉力單位。以2 mm/min的牽拉速度測量仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1的牽拉強(qiáng)度。

1.4 細(xì)胞活性檢測 采用鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)/碘化丙啶(PI)雙染細(xì)胞的方法染色活細(xì)胞和死細(xì)胞。試劑：①Calcein-AM 100 μL(-20 ℃避光保存)，100～1 000倍稀釋(一般為試劑盒母液的1 000倍稀釋)，染色時間為15～30 min；②PI 50 μL(2～8 ℃保存)，5 000～30 000倍稀釋(常用10 000～20 000倍稀釋)；③10倍染色緩沖液。用Hank’s平衡鹽溶液(HBSS緩沖液)或無血清培養(yǎng)基配置。PBS清洗細(xì)胞2次，先用Calcein-AM染色，再用PI染色，于室溫或37 ℃避光孵育，染色完成后可用PBS清洗，避免背景太亮。應(yīng)用熒光顯微鏡觀察，在490 nm波長下，活細(xì)胞呈綠色，死細(xì)胞呈紅色；在545 nm波長下，僅觀察死細(xì)胞。觀察并計算0、3、6 d仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1和2中的細(xì)胞存活率。采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)實驗檢測仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片2內(nèi)纖維蛋白原水凝膠中細(xì)胞的擴(kuò)增速率，以分光光度計吸光度(A值)表示。

2 結(jié) 果

2.1 兔尿道組織學(xué)模板 H-E染色結(jié)果顯示，兔尿道上皮細(xì)胞覆蓋于黏膜下組織，連續(xù)分布，將用于3D打印尿道補(bǔ)片內(nèi)層結(jié)構(gòu)模板(圖1A)；兔尿道脫細(xì)胞后可見細(xì)胞外基質(zhì)有序分布，可作為3D打印尿道補(bǔ)片海藻酸鈉水凝膠打印模板(圖1B)。

A 兔尿道組織學(xué)結(jié)構(gòu) B 兔尿道脫細(xì)胞基質(zhì)圖1 兔尿道組織病理學(xué)圖片(H-E染色，×20)

2.2 兩種仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片外觀 使用3D生物打印機(jī)，根據(jù)補(bǔ)片結(jié)構(gòu)設(shè)計1和2均可制備大小為2 cm×2 cm的仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片，兩者的結(jié)構(gòu)完整性無明顯差異。使用交聯(lián)劑作用于打印后的仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1和2，可增強(qiáng)補(bǔ)片力學(xué)性能，1 h后即可使用手術(shù)鑷子操作。見圖2。

A 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1交聯(lián)前的外觀 B 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1交聯(lián)后30 min的外觀 C 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1交聯(lián)后1 h的外觀 D 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片2交聯(lián)前的外觀 E 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片2交聯(lián)后30 min的外觀 F 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片2交聯(lián)后1 h的外觀圖2 兩種仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片大體觀

2.3 生物降解實驗和生物力學(xué)測試結(jié)果 生物降解實驗結(jié)果顯示，仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1在Ⅱ型膠原酶溶液和滅菌水中均有明顯的降解，10 d內(nèi)其在Ⅱ型膠原酶溶液中的降解速率明顯快于在滅菌水中，10～20 d時的降解速率較在滅菌水中平穩(wěn)，>20～<30 d時與在滅菌水中的同步，30 d時在兩種溶液中的降解率均接近50%(圖3A)。生物力學(xué)測試結(jié)果顯示，仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1的力學(xué)性能表現(xiàn)為線性增加，最大牽拉強(qiáng)度為6 N(圖3B)。

2.4 兩種仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片內(nèi)細(xì)胞的活性比較 細(xì)胞活性染色結(jié)果示，仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1內(nèi)的細(xì)胞為點(diǎn)狀分布，無明顯的舒展(圖4A～C)，細(xì)胞死亡率較高，細(xì)胞在培養(yǎng)0、3、6 d的存活率分別為62.91%±3.39%、41.92%±8.86%和57.11%±6.12%；仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片2內(nèi)細(xì)胞形態(tài)舒展，死亡率較低(圖4 D～F)，在培養(yǎng)第6天時即有明顯的細(xì)胞擴(kuò)增，細(xì)胞在培養(yǎng)0、3、6 d的存活率分別為95.12%±1.37%、79.46%±4.77%和84.70%±8.62%。

A 生物降解實驗結(jié)果 B 生物力學(xué)測試結(jié)果圖3 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1的生物降解實驗和生物力學(xué)測試結(jié)果

A 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1打印即刻 B 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1培養(yǎng)3 d C 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片1培養(yǎng)6 d D 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片2打印即刻 E 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片2培養(yǎng)3 d F 仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片2培養(yǎng)6 d圖4 不同時間兩種仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片內(nèi)的成纖維細(xì)胞(Calcein-AM/PI雙染，×20)

CCK-8實驗結(jié)果顯示，仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片2內(nèi)纖維蛋白原水凝膠中的細(xì)胞在培養(yǎng)1、4、7、10、15 d的擴(kuò)增率的A值分別為0.012 752 083、0.131 895 833、0.208 958 333、0.430 608 333、0.623 875 000，有明顯的擴(kuò)增表現(xiàn)。

3 討 論

本研究應(yīng)用3D生物打印技術(shù)制備了兩種結(jié)構(gòu)的仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片，通過比較單純海藻酸鈉水凝膠和在海藻酸鈉水凝膠基礎(chǔ)上的纖維蛋白原水凝膠構(gòu)建的尿道補(bǔ)片，發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉可為尿道修復(fù)補(bǔ)片提供充足的力學(xué)性能，纖維蛋白原可提高細(xì)胞的存活率和擴(kuò)增率，結(jié)合兩者的優(yōu)勢可制備仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片。

本研究中，仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片2在海藻酸鈉水凝膠基礎(chǔ)上使用纖維蛋白原水凝膠，由纖維蛋白原、明膠、甘油、透明質(zhì)酸加入至高糖DMEM中制成，打印完成后再由凝血酶交聯(lián)，使纖維蛋白原內(nèi)形成化學(xué)鍵，增強(qiáng)力學(xué)性能[15]。這一過程類似于血液凝固和傷口愈合的反應(yīng)機(jī)制[16]。最新的研究[17]發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白原內(nèi)有微米級別的孔隙，能夠?qū)⑴囵B(yǎng)液滲透進(jìn)入10 μm的水凝膠內(nèi)部，如果打印結(jié)構(gòu)的厚度大于這一距離，將會降低水凝膠內(nèi)細(xì)胞的代謝，從而降低存活率。細(xì)胞活性實驗和CCK-8實驗結(jié)果顯示，仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片2內(nèi)的成纖維細(xì)胞的存活率和擴(kuò)增率均較高，證明了在海藻酸鈉水凝膠基礎(chǔ)上使用的纖維蛋白原水凝膠具有高度生物相容性。

細(xì)胞負(fù)載于水凝膠中，使組織工程尿道獲得多層次細(xì)胞結(jié)構(gòu)成為可能，采用該方法能夠解決傳統(tǒng)支架所面臨的細(xì)胞層次單一的問題。在傳統(tǒng)組織工程的尿道支架材料中，為了給細(xì)胞黏附提供充足的區(qū)域，支架的孔隙往往非常小，僅為納米級別。這種類型的結(jié)構(gòu)無法促進(jìn)外層的基質(zhì)細(xì)胞與內(nèi)層的上皮細(xì)胞交流，宿主生物體內(nèi)的血管僅能通過材料邊緣進(jìn)入支架的管腔內(nèi)部，而無法獲得新生組織周圍血管化提供的營養(yǎng)，因此容易造成管腔內(nèi)面的細(xì)胞缺氧壞死，導(dǎo)致修復(fù)失敗[18]。由于上述原因，經(jīng)常導(dǎo)致移植物發(fā)生壞死，上皮下層的纖維化和手術(shù)的失敗，使用3D生物打印技術(shù)克服了支架孔隙小的問題，可以保證大量細(xì)胞進(jìn)入支架內(nèi)部。

本研究的細(xì)胞活性實驗結(jié)果顯示，在培養(yǎng)第6天時，兩種仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量均明顯增多，但要達(dá)到正常兔尿道細(xì)胞的數(shù)量，仍需對多個指標(biāo)進(jìn)行改進(jìn)，如增加打印時所使用的細(xì)胞數(shù)量、延長培養(yǎng)時間、采用動態(tài)培養(yǎng)方式、改良水凝膠配方等。由于本研究中使用的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，其在提取、培養(yǎng)、擴(kuò)增方面都較上皮和平滑肌細(xì)胞要容易，為了滿足生物打印對細(xì)胞數(shù)量的要求，需要提取大面積的膀胱進(jìn)行上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)，從而造成對宿主的傷害，因此在今后的實驗中，可能會引入干細(xì)胞作為生物打印的細(xì)胞來源，如脂肪干細(xì)胞、胎盤干細(xì)胞、胎盤上皮細(xì)胞等[19-20]。

生物打印尿道的另一項優(yōu)勢是可以方便地在水凝膠內(nèi)加入各種相關(guān)的生長因子和信號通路調(diào)節(jié)劑來促進(jìn)組織的生長和分化，具有廣闊的研究前景[21]。由于臨床實驗或干細(xì)胞臨床的要求嚴(yán)格，使用細(xì)胞進(jìn)行3D打印將面臨更大的應(yīng)用難度。在現(xiàn)階段，本課題組會最大限度地優(yōu)化3D打印尿道補(bǔ)片結(jié)構(gòu)，包括提高力學(xué)性能，提高孔隙率，促進(jìn)細(xì)胞長入，在體外細(xì)胞實驗和動物體內(nèi)實驗中進(jìn)行觀察性研究，之后可單獨(dú)使用無細(xì)胞水凝膠補(bǔ)片或加入生長因子進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化研究。

綜上所述，本研究探索了3D生物打印技術(shù)用于構(gòu)建仿生尿道修復(fù)補(bǔ)片的可行性，為進(jìn)一步體內(nèi)試驗奠定了堅實的基礎(chǔ)，為生物打印應(yīng)用于尿道狹窄治療積累了經(jīng)驗。