楊雅婷 顧希垚 蘇殿三 孫加曉 謝文欽

長期的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，20%～25%的腫瘤TNM Ⅰ或Ⅱ期患者術(shù)后出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移[1-2]。轉(zhuǎn)移和復發(fā)是惡性腫瘤的特征[3]。腫瘤的病理學檢查結(jié)果可以預測腫瘤患者術(shù)后的預后，然而臨床有部分腫瘤患者即使術(shù)后病理學檢查結(jié)果為切緣陰性，仍會發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)。全身麻醉腫瘤手術(shù)后復發(fā)率升高的原因不明，阿片類藥物的使用是腫瘤切除術(shù)后導致腫瘤復發(fā)的因素之一，并且越來越受到臨床醫(yī)師的重視[4-7]，但其促進腫瘤惡性生物學行為致其復發(fā)的機制目前尚不清楚。近年來的研究[1,8-9]結(jié)果表明，細胞免疫在腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移和復發(fā)過程中具有重要作用。阿片類藥物可能通過抑制機體的細胞免疫，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)[10-11]。

本研究通過建立balb/c小鼠皮下結(jié)腸癌模型，觀察目前常用的3種阿片類藥物羥考酮、舒芬太尼和芬太尼對荷瘤小鼠免疫細胞組成比例和血清細胞因子的影響，經(jīng)比較后篩選出對免疫抑制比較小的阿片類藥物，以期在圍術(shù)期和癌癥鎮(zhèn)痛治療中選擇更為合適的鎮(zhèn)痛藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 83只6～8周無特定病原體(SPF)級balb/c小鼠，體重25～30 g，均購自南京軍區(qū)福州總院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心。飼養(yǎng)條件：溫度維持在24 ℃左右，濕度40%～60%，自由飲水、進食，12 h晝夜交替照明。

1.2 主要試劑和儀器 小鼠結(jié)腸癌細胞系(CT26)購自中國科學院細胞庫/干細胞庫。羥考酮(HamoL Limited，批號BR171)，舒芬太尼(宜昌人福藥業(yè)有限責任公司，批號1170906)，芬太尼(宜昌人福藥業(yè)有限責任公司，批號1160602)。CD3-異硫氰酸熒光素(FITC，批號11-0032-82)、CD4-異構(gòu)藻青蛋白(APC，批號17-0041-82)、CD8-藻紅蛋白(PE，批號12-0081-82)、CD49b-FITC(批號11-5971-82)均購自美國eBioscience公司，紅細胞裂解液(美國BD公司，批號555899)，小鼠輔助性T淋巴細胞(Th)1/Th2/Th17細胞因子試劑盒(檢測IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A含量，美國BD公司，批號560485)。臺式低溫高速離心機(德國Beckman Coulter公司)，流式細胞儀(熒光激活細胞分類儀FACS)BD FACS Verse(美國BD公司)。

1.3 小鼠結(jié)腸癌模型的建立 將胰酶消化下的小鼠結(jié)腸癌細胞系CT26稀釋為1×107/mL，用注射器抽取0.2 mL，接種于小鼠的右側(cè)腹股溝，接種完用棉球按壓片刻以防細胞漏逸。14 d后，小鼠皮下如見黃豆大小的腫塊形成，則表明模型構(gòu)建成功。

1.4 藥物處理 接種腫瘤細胞的第2天，采用隨機數(shù)字表法將40只小鼠分成4組：對照組(9只)，羥考酮組(11只)，芬太尼組(9只，原10只死亡1只)，舒芬太尼組(10只)。每日觀察小鼠的精神、活動狀態(tài)、飲食和大小便，并稱重。接種腫瘤細胞后第14天開始在小鼠的尾靜脈注射藥物，每天早、晚8點各1次，連續(xù)3 d。每只小鼠每次注射0.2 mL液體，對照組為0.9%氯化鈉溶液，羥考酮組為5 mg/kg羥考酮，舒芬太尼組為5 μg/kg舒芬太尼，芬太尼組為50 μg/kg芬太尼[12-13]。

1.5 標本處理和淋巴亞群檢測 小鼠于最后1次注射藥物后12 h，予氯胺酮麻醉后眼球取血800 μL。斷頸處死小鼠后解剖取脾，經(jīng)200目過濾網(wǎng)研磨成脾細胞懸液。外周血采用紅細胞裂解法獲得淋巴細胞。每管各取100 μL EDTA-K2抗凝外周血，加入CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE 3個熒光標記的單克隆抗體，避光，4 ℃孵育30 min后，加入1 mL紅細胞裂解液，混勻，室溫避光5 min，以300×g、4 ℃離心5 min，然后棄上清液，加入2 mL FACS緩沖液(熒光激活細胞分類儀FACS)洗滌，再以300×g低溫4 ℃離心5 min。重復洗滌離心1次，最后以500 μL含1%多聚甲醛的PBS重懸。檢測外周血和脾懸液中淋巴細胞亞群CD3+T淋巴細胞的比例、CD3+CD4+Th細胞的比例、CD3+CD8+T淋巴細胞的比例和CD4/CD8比值。另各取100 μL外周血和脾懸液，加入CD49b-FITC，具體操作步驟同上。檢測外周血和脾臟中自然殺傷細胞(NK細胞)占淋巴細胞的比例。

1.6 血清細胞因子檢測 剩余43只小鼠按前述方式造模和給藥：對照組(9只)，羥考酮組(10只)，芬太尼組(14只)，舒芬太尼組(10只)。促凝管收集外周血，靜置1 h后以2 000×g、4 ℃離心15 min，收取血清于-80 ℃凍存，應用Th1/Th2/Th17細胞因子試劑盒檢測細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A含量，操作步驟按照試劑盒說明書進行，均在福建醫(yī)科大學流式細胞儀分析室上機檢測。

2 結(jié) 果

2.1 不同阿片類藥物對外周血淋巴細胞亞群分布的影響 各組間CD3+T淋巴細胞的比例的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，羥考酮組、舒芬太尼組和芬太尼組的CD3+T淋巴細胞比例分別降低2.21%、19.21%和23.52%，舒芬太尼組和芬太尼組與對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)；羥考酮組的CD3+T淋巴細胞比例也顯著高于舒芬太尼組和芬太尼組(P值均<0.01)，而舒芬太尼組與芬太尼組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組間CD3+CD4+Th細胞的比例的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，羥考酮組、舒芬太尼組和芬太尼組的CD3+CD4+Th細胞比例分別降低0.93%、19.67%和24.64%，舒芬太尼組和芬太尼組與對照組的差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)；羥考酮組的CD3+CD4+Th細胞比例也顯著高于舒芬太尼組和芬太尼組(P值均<0.01)，而舒芬太尼組與芬太尼組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組間CD3+CD8+T淋巴細胞的比例的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，羥考酮組、舒芬太尼組、芬太尼組CD3+CD8+T淋巴細胞比例分別降低3.87%、21.07%和21.98%，舒芬太尼組和芬太尼組與對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)；羥考酮組的CD3+CD8+T淋巴細胞比例也顯著高于舒芬太尼組和芬太尼組(P值均<0.05)，而舒芬太尼組與芬太尼組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組間NK細胞占淋巴細胞的比例的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，羥考酮組、舒芬太尼組、芬太尼組的NK細胞占淋巴細胞比例分別降低16.45%、29.53%、34.19%，舒芬太尼組和芬太尼組與對照組的差異有統(tǒng)計學意義(P值分別<0.05、0.01)；羥考酮組的NK細胞占淋巴細胞比例顯著高于芬太尼組(P<0.05)，舒芬太尼組與芬太尼組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組間CD4/CD8比值的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組外周血淋巴細胞亞群分布比較

組別NCD3+T淋巴細胞CD3+CD4+Th細胞CD3+CD8+T淋巴細胞CD4/CD8NK細胞對照90.721±0.0160.571±0.0150.129±0.0044.51±0.160.172±0.018羥考酮110.705±0.0200.566±0.0190.124±0.0074.24±0.250.144±0.009舒芬太尼90.582±0.018①③0.459±0.020①③0.102±0.005①④4.42±0.360.121±0.010②芬太尼100.551±0.016①③0.431±0.016①③0.101±0.004①④4.11±0.200.113±0.006①④

與對照組比較：①P<0.01，②P<0.05；與羥考酮組比較：③P<0.01，④P<0.05

2.2 不同阿片類藥物對脾臟中淋巴細胞亞群分布的影響 各組間CD3+T淋巴細胞的比例的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，羥考酮組、舒芬太尼組CD3+T淋巴細胞比例分別增加22.13%和20.84%，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)，而芬太尼組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；羥考酮組的CD3+T淋巴細胞的比例顯著高于芬太尼組(P<0.05)。各組間CD3+CD4+Th細胞的比例的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組相比，羥考酮組、舒芬太尼組CD3+CD4+Th細胞的比例分別增加18.42%和21.54%，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)，芬太尼組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；羥考酮組與芬太尼組間CD3+CD4+Th細胞比例的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組間CD3+CD8+T淋巴細胞的比例的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，羥考酮組、舒芬太尼組CD3+CD8+T淋巴細胞比例分別增加26.81%和25%，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)，芬太尼組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；羥考酮組的CD3+CD8+T淋巴細胞比例顯著高于芬太尼組(P<0.05)。各組間NK細胞占淋巴細胞的比例的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，羥考酮組、舒芬太尼組、芬太尼組NK細胞占淋巴細胞比例分別減少30.67%、28.36%、31.92%，與對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(P值分別<0.01、0.05)。各組間CD4/CD8比值的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

組別NCD3+T淋巴細胞CD3+CD4+Th細胞CD3+CD8+T淋巴細胞CD4/CD8NK細胞對照90.270±0.0070.179±0.0050.066±0.0032.79±0.090.091±0.007羥考酮110.330±0.012①0.212±0.009①0.083±0.004①2.60±0.080.063±0.004①舒芬太尼90.327±0.016①0.218±0.011①0.082±0.004①2.70±0.090.065±0.006②芬太尼100.277±0.018③0.182±0.0130.068±0.005③2.70±0.110.062±0.006①

與對照組比較：①P<0.01，②P<0.05；與羥考酮組比較：③P<0.05

2.3 不同阿片類藥物對血漿中細胞因子表達的影響 各組間IFN-γ含量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組間TNF-α含量的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，羥考酮組、舒芬太尼組和芬太尼組的TNF-α含量均顯著降低(P值均<0.01)，芬太尼組又顯著低于羥考酮組和舒芬太尼組(P值均<0.01)。各組間IL-6含量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組間IL-10含量的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組相比，羥考酮組和舒芬太尼組的IL-10含量均顯著升高(P值均<0.05)，而芬太尼組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組間IL-17A含量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組間Th1/Th2比值的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，芬太尼組的Th1/Th2比值顯著降低(P<0.01)，羥考酮組和舒芬太尼組雖有降低的趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)；芬太尼組的Th1/Th2比值也顯著低于羥考酮組和舒芬太尼組(P值均<0.05)。見表3。IL-2和IL-4含量因檢測值極低，故未進行統(tǒng)計學處理。

組別NIFN-γ(pg/mL)TNF-α(pg/mL)IL-6(pg/mL)IL-10(pg/mL)IL-17A(pg/mL)Th1/Th2對照93.22±1.3417.79±2.5010.75±2.052.42±0.630.86±0.181.58±0.08羥考酮105.31±2.788.54±1.70①③10.76±4.004.51±0.62②1.01±0.211.14±0.28④舒芬太尼145.54±2.358.61±1.32①③6.69±1.584.95±0.63②1.26±0.191.25±0.31④芬太尼101.93±0.343.85±0.38①9.13±1.513.52±0.260.90±0.170.53±0.65①

與對照組比較：①P<0.01，②P<0.05；與芬太尼組比較：③P<0.01，④P<0.05

3 討 論

腫瘤免疫相關(guān)的研究多集中在腫瘤局部的免疫，而全身的免疫系統(tǒng)可以監(jiān)測循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細胞和抗原，在預防腫瘤轉(zhuǎn)移和進展中更具有臨床意義[14]。本研究比較了3種臨床常用的阿片類藥物羥考酮、芬太尼和舒芬太尼對于荷結(jié)腸癌balb/c小鼠外周血和脾臟淋巴細胞組成比例和血清細胞因子的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于等效鎮(zhèn)痛劑量的芬太尼和舒芬太尼，5 mg/kg羥考酮對外周血中淋巴細胞比例的影響更輕微。

CD3、CD4、CD8是胸腺免疫細胞早期的分化抗原標志，經(jīng)過陽性選擇和陰性選擇，發(fā)育成熟的胸腺細胞才能進入外周血。最近北京大學張澤民研究團隊對來自12例結(jié)直腸癌初治患者外周血、癌組織和癌旁組織中的大量T淋巴細胞進行了單細胞全長轉(zhuǎn)錄組測序和分析，發(fā)現(xiàn)外周血中的CD4+T淋巴細胞以初始T淋巴細胞和效應細胞為主；CD8+T淋巴細胞以初始T淋巴細胞、中樞記憶細胞和最近活化的效應T淋巴細胞為主[15]。適應性免疫系統(tǒng)中，CD3+CD4+Th細胞是機體最主要的輔助抗腫瘤細胞，而CD3+CD8+T淋巴細胞是發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的主力軍[16]。新的研究發(fā)現(xiàn)，全身免疫包括外周血、脾臟等的CD4+T淋巴細胞亞群對于抗腫瘤免疫應答是必不可少的，甚至比CD8+T淋巴細胞更重要。Spitzer等[17]的研究結(jié)果表明，從治療成功的小鼠體內(nèi)提取免疫反應性CD4+T淋巴細胞注射到未治療動物的腫瘤中，與注射CD8+T淋巴細胞相比，其可以發(fā)揮更長時間的保護作用。他們通過新開發(fā)的scaffold平臺，發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細胞在協(xié)調(diào)、統(tǒng)籌全身各系統(tǒng)抗腫瘤免疫中發(fā)揮了主要作用。本研究觀察了3種阿片類藥物對CD3+T淋巴細胞、CD3+CD4+Th細胞和CD3+CD8+T淋巴細胞比例的影響，發(fā)現(xiàn)羥考酮對外周血免疫的影響較小，其在脾臟中甚至具有促進免疫的作用，而應用等效劑量的舒芬太尼和芬太尼后，外周血中這3類細胞的比例均有不同程度的下降。這與Ma等[18]在體外研究中觀察到的芬太尼呈劑量依賴性地降低臍帶單個核細胞中的CD4+、CD8+細胞的百分比和數(shù)量的結(jié)果相同。

本研究結(jié)果顯示，各組外周血和脾臟中CD4/CD8比值的差異均無統(tǒng)計學意義，進一步說明阿片類藥物并不是通過特異性地消耗或增殖CD4+或CD8+這一類型的細胞而改變CD3+CD4+Th細胞和CD3+CD8+T淋巴細胞所占淋巴細胞的比例，而可能是通過影響胸腺中的細胞發(fā)育成熟[19-20]或提高外周血中異常細胞的比例，甚至是改變淋巴細胞的歸巢和遷移實現(xiàn)的[21]。Filipczak-Bryniarska等[22]的研究比較了嗎啡、丁丙諾菲、羥考酮對健康小鼠皮膚超敏反應的影響，表明羥考酮幾乎不影響皮膚超敏反應；而體外研究[23]的結(jié)果表明，羥考酮會抑制IL-6等炎性細胞因子分泌。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果均提示，羥考酮對于機體免疫系統(tǒng)的抑制作用較小。

羥考酮注射液在歐美國家廣泛應用，但在中國于2013年底才上市。羥考酮因其具有內(nèi)臟鎮(zhèn)痛的優(yōu)勢，在結(jié)腸癌術(shù)后鎮(zhèn)痛中的使用越來越普遍。與羥考酮相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)方面的研究比較缺乏。有研究[24]發(fā)現(xiàn)，羥考酮的C6被羰基取代，并且C7～8存在單鍵結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)在促進其鎮(zhèn)痛作用的同時減少免疫抑制。此外，阿片類藥物通過直接作用于μ型阿片受體3激活細胞膜上與阿片受體耦聯(lián)的鈣離子通道，導致細胞內(nèi)鈣增加，激活下游信號通路，增加NF-κB抑制蛋白a(iKBa)的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性，抑制NF-κB與細胞核內(nèi)特定DNA啟動基因結(jié)合，從而抑制T淋巴細胞和Th1細胞因子IL-2、IFN的表達[25]。因此，從羥考酮與μ受體的親和力推測其免疫抑制較小，但其相關(guān)機制還需要進一步研究。

本研究中，外周血中淋巴細胞比例與脾臟中并不一致。在外周血中，對照組的淋巴細胞比例與羥考酮組接近，并且兩組的CD3+T淋巴細胞、CD3+CD4+Th細胞和CD3+CD8+T淋巴細胞所占比例均高于舒芬太尼組和芬太尼組。在脾臟中，羥考酮組的淋巴細胞比例與舒芬太尼組接近，并且兩者的CD3+T淋巴細胞、CD3+CD4+Th細胞和CD3+CD8+T淋巴細胞所占比例均高于對照組和芬太尼組。脾臟是外周發(fā)生免疫應答的主要場所，具有大量樹突狀細胞，而相關(guān)研究[26-27]結(jié)果表明舒芬太尼能夠促進臍樹突狀細胞發(fā)育成熟。由此推測，給予舒芬太尼后，通過促進樹突狀細胞提呈腫瘤抗原，活化增殖脾臟中的抗腫瘤免疫細胞。而NK細胞是天然的免疫細胞，無需抗原提呈細胞的輔助，因此可以解釋脾臟中的NK細胞比例與外周血中的趨勢相同。有研究[28]發(fā)現(xiàn)，大劑量的芬太尼通過抑制外周的NK細胞殺傷功能(NKCC)促進腫瘤的肺轉(zhuǎn)移和提高癌細胞的存活率，與本研究結(jié)果相似。不同的免疫區(qū)間接觸的抗原類型和數(shù)量不同，免疫細胞的組成和結(jié)構(gòu)、所屬的神經(jīng)支配、內(nèi)分泌作用也不同，因此即使在相同的藥物作用下，在不同的免疫區(qū)間也可能出現(xiàn)不同的結(jié)果。

血漿細胞因子主要由免疫細胞分泌。成熟的Th細胞進一步功能分化為Th1和Th2等類型的細胞。正常機體的Th1/Th2處于平衡狀態(tài)，腫瘤患者的Th1/Th2偏移與不良的預后相關(guān)。Greeneltch等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2比值較低的結(jié)腸癌患者術(shù)后總體生存時間僅(35.5±5.0)個月，而Th1/Th2比值較高的患者為83.5個月，因此偏Th2的免疫類型更不利于結(jié)腸癌患者的康復。本研究在檢測前只給予小鼠阿片類藥物，并未予其他刺激，因此主要反映的是腫瘤小鼠的基礎(chǔ)免疫功能，通過檢測發(fā)現(xiàn)芬太尼組中血清Th1/Th2比值<1，反應偏Th2型免疫。之前也有研究結(jié)果表明，嗎啡抑制Th1型細胞因子IFN-γ[30]，促進體外[31]和體內(nèi)[32]IL-4產(chǎn)生，通過Fas/Fas配體依賴性激活誘導的Th1細胞死亡[33]。腫瘤的抗免疫功能主要依靠Th1型免疫細胞占優(yōu)勢的免疫狀態(tài)，Th2偏移型的免疫細胞促進腫瘤進展[34-35]。本研究結(jié)果顯示，芬太尼組Th1/Th2比值<1，說明Th2型的免疫細胞占優(yōu)勢，可能是促進腫瘤進展的因素之一，間接表明芬太尼與其他兩種阿片類藥物相比，更不適合用于腫瘤機體。

綜上所述，羥考酮對種植結(jié)腸癌細胞株的小鼠的免疫功能抑制最小。與舒芬太尼、芬太尼相比，羥考酮可能是避免腫瘤手術(shù)后腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移更安全的阿片類藥物。