蘇純潔，何前進(jìn)，毛偉明，張喜華，岑紅兵，張松柏

(1 荊門市第一人民醫(yī)院，湖北荊門448000；2 黃岡市中心醫(yī)院)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(以下稱肝癌)是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別居所有惡性腫瘤的第三位和第二位。雖然根治性手術(shù)是治療肝癌的最有效手段，但由于其早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時(shí)已錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，化療成為中晚期肝癌綜合治療的重要手段。但肝癌常產(chǎn)生多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象，導(dǎo)致化療效果明顯下降[1]。因此，探索引起肝癌MDR的機(jī)制具有重要意義。細(xì)胞程序性死亡受體1(PD-1)與其配體PD-L1屬于CD28/B7家族，是一對(duì)共刺激分子，具有負(fù)性調(diào)控作用。PD-1通過與其受體PD-1結(jié)合，可降低T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，繼而抑制T細(xì)胞的抗腫瘤作用，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除[2，3]。有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌、乳腺癌等腫瘤組織PD-L1表達(dá)明顯升高，且其表達(dá)越高，患者預(yù)后越差[4～6]。多藥耐藥基因1(MDR1)是ATP結(jié)合盒載體超家族成員之一，其基因編碼的蛋白產(chǎn)物P-gp可將細(xì)胞內(nèi)多種抗腫瘤藥物泵出細(xì)胞外，還可使抗腫瘤藥物在細(xì)胞內(nèi)再分布，從而使抗腫瘤藥物無法有效殺滅腫瘤細(xì)胞。P-gp高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞MDR的主要原因[7,8]。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織PD-L1表達(dá)與MDR1表達(dá)密切相關(guān)[9]。但二者在原發(fā)性肝癌組織中的關(guān)系尚不清楚。為此，我們進(jìn)行了如下研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2013年3月～2016年12月黃岡市中心醫(yī)院手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本各90例份。標(biāo)本來源患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)檢查，明確原發(fā)性肝癌診斷；②均接受肝癌根治性手術(shù)；③術(shù)前未接受過任何抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性肝癌者；②入院前已接受過化療、放療或其他抗腫瘤治療者；③伴有嚴(yán)重營養(yǎng)不良、精神障礙或不愿參與本研究者。其中，男63例、女27例，年齡27～69歲、平均46.5歲，乙肝表面抗原陽性72例。本研究經(jīng)黃岡市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

人肝癌細(xì)胞株Huh7，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。鼠抗人PD-L1單克隆抗體，美國Proteintech公司；鼠抗人MDR1、β-actin單克隆抗體，美國Santa Cruz公司。即用型SABC免疫組化染色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。TRIzol、SYBR?Green PCR Master Mix、Lipofectamine2000，美國Life Technologies公司；RIPA裂解液，美國Sigma公司。PD-L1過表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-PD-L1，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。所有引物序列由武漢谷歌生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 原發(fā)性肝癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織PD-L1、MDR1表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片；將切片置于65 ℃烤箱內(nèi)烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；10%山羊血清封閉，37 ℃孵育1 h，分別加入鼠抗人PD-L1單克隆抗體、鼠抗人MDR1單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜；次日，滴加山羊抗鼠二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。采用雙盲法由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片，結(jié)果有爭議時(shí)請(qǐng)第三位病理科醫(yī)師閱片，以兩個(gè)相同結(jié)果為準(zhǔn)。PD-L1陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒；MDR1陽性染色定位于細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒。參照文獻(xiàn)[4,9]評(píng)判PD-L1、MDR1陽性表達(dá)情況。

1.3 PD-L1過表達(dá)對(duì)MDR1表達(dá)的影響

1.3.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng) Huh7細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液一次，待細(xì)胞生長融合約80%時(shí)，按1∶4傳代。取傳3代、對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取傳3代、對(duì)數(shù)生長期Huh7細(xì)胞，接種于6孔板，每孔6×105個(gè)。隨機(jī)分為觀察組、對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合約60%時(shí)，觀察組和對(duì)照組分別加入1.2 μg Lipofectamine2000包裹的pEGFP-PD-L1和pEGFP-N1質(zhì)粒，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.3 PD-L1、MDR1 mRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè) ①PD-L1、MDR1 mRNA表達(dá)：采用real-time PCR法。收集兩組繼續(xù)培養(yǎng)48 h細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，提取的細(xì)胞總RNA濃度和純度合格。取總RNA 1 μg，按cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按照SYBR?Green PCR Master Mix(2×)試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：PD-L1上游引物5′-TTCAGGGACGGATAAAGCTG-3′，下游引物5′-CGTCTCTGAGCTTCACGTTG-3′，擴(kuò)增溫度59 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物片段93 bp；MDR1上游引物5′-ATATCAGCAGCCCACATCAT-3′，下游引物5′-GAAGCACTGGGATGTCCGGT-3′，擴(kuò)增溫度60 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物片段154 bp；β-actin上游引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，下游引物5′-GCTCGCTCCAACCGACTGC-3′，擴(kuò)增溫度60 ℃，擴(kuò)增產(chǎn)物片段171 bp。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板1.5 μL，上下游引物各0.2 μL，SYBRGreen Mix 10 μL，ddH2O 8.1 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s共33個(gè)循環(huán)，最后95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。②PD-L1、MDR1蛋白表達(dá)：采用Western blotting法。收集兩組繼續(xù)培養(yǎng)48 h細(xì)胞，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量合格。然后加入上樣緩沖液，100 ℃水浴，使蛋白充分變性。取變性蛋白20 μg，SDS-PAGE(5%濃縮膠、12%分離膠)分離蛋白。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗人PD-L1、MDR1、β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光，暗室中顯影、定影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)性肝癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織PD-L1、MDR1表達(dá)比較 原發(fā)性肝癌組織與癌旁正常組織PD-L1陽性表達(dá)率分別為57.8%(52/90)、26.7%(24/90)，MDR1陽性表達(dá)率分別為55.6%(50/90)、30.0%(30/90)。原發(fā)性肝癌組織PD-L1、MDR1陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織(P均<0.01)。

2.2 原發(fā)性肝癌組織PD-L1表達(dá)與MDR1表達(dá)的關(guān)系 90例份原發(fā)性肝癌組織中，PD-L1陽性表達(dá)52例份，其中MDR1陽性表達(dá)42例份、陰性表達(dá)10例份；PD-L1陰性表達(dá)38例份，其中MDR1陽性表達(dá)8例份、陰性表達(dá)30例份。Spearman秩相關(guān)分析顯示，原發(fā)性肝癌組織PD-L1表達(dá)與MDR1表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.594，P<0.01)。

2.3 兩組轉(zhuǎn)染48 h PD-L1、MDR1表達(dá)比較 見表1。

表1 兩組轉(zhuǎn)染48 h PD-L1、MDR1表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

3 討論

近年來，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，全世界每年約有70萬新發(fā)病例。目前，原發(fā)性肝癌的總體治療效果仍不理想，大部分患者因腫瘤轉(zhuǎn)移而喪失根治性手術(shù)治療機(jī)會(huì)，化療成為中晚期肝癌綜合治療的重要手段，但MDR現(xiàn)象導(dǎo)致化療效果明顯下降[7]。因此，逆轉(zhuǎn)MDR成為近年肝癌治療中的研究熱點(diǎn)。

肝癌的發(fā)生是一個(gè)多基因參與、多途徑調(diào)控的復(fù)雜過程，免疫抑制和免疫逃逸在其發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制與免疫逃逸和腫瘤細(xì)胞PD-L1過表達(dá)密切相關(guān)[2,3]。腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，可使T細(xì)胞不能識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[2,3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤組織PD-L1高表達(dá)，且其表達(dá)越高，患者預(yù)后越差[10～13]。本研究結(jié)果顯示，原發(fā)性肝癌組織PD-L1陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，與以往報(bào)道一致。除了肝癌細(xì)胞免疫抑制和免疫逃逸外，在綜合治療過程中還易出現(xiàn)化療耐藥現(xiàn)象。目前認(rèn)為，化療耐藥的產(chǎn)生與肝癌細(xì)胞中耐藥蛋白過表達(dá)密切相關(guān)。其中，MDR1及其蛋白產(chǎn)物P-gp與肝癌化療耐藥的關(guān)系最為密切[7,8]。P-gp是一種跨膜糖蛋白，具有能量依賴性藥泵功能，能主動(dòng)將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵至細(xì)胞外，降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥性[7,8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌組織MDR1陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，與以往文獻(xiàn)[7,8]報(bào)道一致。有研究認(rèn)為，肝癌組織MDR1高表達(dá)的原因與缺氧、低糖微環(huán)境及HBV感染有關(guān)[14，15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌組織PD-L1表達(dá)與MDR1表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，說明PD-L1過表達(dá)也可能是引起肝癌MDR的原因之一。為進(jìn)一步觀察PD-L1表達(dá)與MDR1表達(dá)的關(guān)系，本研究觀察了PD-L1過表達(dá)對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞MDR1表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組轉(zhuǎn)染48 h PD-L1、MDR1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組。說明PD-L1除了參與肝癌細(xì)胞的免疫抑制和免疫逃逸外，還可參與肝癌的化療耐藥。

綜上所述，原發(fā)性肝癌組織PD-L1表達(dá)明顯升高，其表達(dá)變化可能與肝癌化療耐藥有關(guān)。