米酒中6種醇的氣相色譜外標法測定研究

唐開永，周鴻翔*，劉彩婷，陳 爍，王曉丹，邱樹毅，肖甜甜

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 貴陽 550025）

米酒是典型的、以糯米為原料發(fā)酵而成的釀造酒，乙醇和高級醇是米酒主要的醇類物質(zhì)，其含量直接影響米酒的口感及風(fēng)味。高級醇主要由正丙醇、異丁醇、異戊醇、己醇、β-苯乙醇組成，在發(fā)酵過程中經(jīng)由糖代謝、氨基酸機構(gòu)化途徑形成[1]。研究表明[2-4]，適量的高級醇可以豐富酒的口感及風(fēng)味，但超過一定濃度時，酒體變得不協(xié)調(diào)，飲后容易出現(xiàn)頭暈、后苦、上頭等癥狀，長時間積累于體內(nèi)而造成機體損傷[5]，甚至死亡[6]。

目前，發(fā)酵酒中高級醇的測定方法有分光光度法、氣相色譜（gas chromatography，GC）法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法。米酒酒精度較低，用國標GB/T 13662—2018《黃酒》中的酒精計法測定時，蒸餾過程操作繁瑣、浪費材料，且誤差大[7]。隨著毛細管柱的發(fā)展，以其較高的柱效、優(yōu)異的惰性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用[8]。GC對高級醇的測定多采用WAX和FFAP等色譜柱[9]，其研究對象多為啤酒和白蘭地[10-11]。國內(nèi)外對于發(fā)酵酒中乙醇及高級醇的分析檢測研究較多，曾詩雨等[12]用超純水處理標樣采集色譜數(shù)據(jù)建立校正表，固相微萃取-氣相色譜（solid phase microextractiongaschromatography，SPME-GC）法測定米酒中的乙醇；林玲等[13]采用直接進樣，HP-INNOWAX柱測定黃酒中高級醇含量；CHUNG H等[14]采用直接進樣，CP WAX-57柱測定韓國米酒中甲醛、高級醇含量；盧珍華等[15]采用蒸餾結(jié)合GC的方測定糯米酒中高級醇。但目前氣相色譜對乙醇及高級醇測定的研究僅限于成品酒，米酒釀造過程中的乙醇及高級醇檢測鮮有研究。無論直接進樣或蒸餾后超純水定容再進樣，都有大量水進入色譜柱而造成固定相流失，縮短色譜柱的壽命；對釀造過程中乙醇及高級醇含量測定方法的研究，有利于及時把控米酒釀造情況、改善因米酒高級醇含量高而等實際生產(chǎn)問題。對于米酒釀造業(yè)的發(fā)展具有深遠意義。

本研究以米酒發(fā)酵酒為對象，甲醇作為溶劑數(shù)倍稀釋處理，致力于建立米酒釀造過程中，對乙醇、丙醇、β-苯乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、己醇等多種醇同時測定的方法，為米酒釀造酒在生產(chǎn)中，對酒精度及高級醇含量的控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對把控米酒釀造生產(chǎn)和產(chǎn)品的控制具有深遠意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

米酒：實驗室自制。

1.1.2 試劑

乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、己醇、β-苯乙醇（純度均≥99.95%）：美國Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜純）：臺灣昌泰有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A型氣相色譜儀（配有7693自動進樣器、10μL自動進樣針、HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.25μm）色譜柱）：美國安捷倫公司；FA1004電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

參照《色譜理論基礎(chǔ)》[16]，選用不同極性色譜柱：強極性柱HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）[13]、弱極性柱HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）[17]、中強極性柱DB-FFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）[18]作為乙醇及高級醇定量分析的目標色譜柱。由于溶劑甲醇與乙醇沸點較低且較接近，高級醇各組分之間的沸點跨度較寬，選擇分流進樣、程序升溫的方式采集數(shù)據(jù)，以初始溫度（35℃、40℃、45℃、50 ℃、55 ℃），分流比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）、空氣流量（200 mL/min、250 mL/min、300 mL/min、350 mL/min、400 mL/min）、升溫速率（第一階段（8℃/min、12℃/min、16℃/min、20℃/min）、第二階段（30℃/min、40℃/min、50℃/min、60℃/min））等，以分離度R，保留值（k'）及分析時間（tm）為分離柱柱效的依據(jù)確定色譜條件。

1.3.2 色譜峰的定性

量取各組分高級醇標準品5 μL、乙醇1 mL分別裝入10 mL容量瓶中，用甲醇定容；得到單一標準液；分別取單一標準液1 mL至10 mL容量瓶混合并用甲醇定容。先用混合溶液進樣，分析色譜圖出峰情況，確定色譜柱以及色譜條件；再單一標準品溶液進樣，確定各組分保留時間。

1.3.3 乙醇及高級醇的定量

定量方法：外標法

取乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、己醇、β-苯乙醇，用甲醇定容，配制得到1#～8#梯度濃度6種醇的混合標準溶液。

按照優(yōu)化的色譜條件，標準品梯度濃度由低到高的順序：1#～8#標樣依次進樣，每個濃度進樣3次，以各組分標樣梯度濃度為橫坐標，3次測定峰面積的平均值為縱坐標，建立校正表，得到各組分的定量線性關(guān)系；將混合標準溶液不斷稀釋濃度進樣分析，記錄信噪信號值，確定各組分的定量限及檢出限。

1.3.4 驗證試驗

（1）重復(fù)性和穩(wěn)定性：取米酒25 mL，用甲醇定容至50 mL，靜置30 min，過0.22 μm有機膜，雙通道同時進樣，每1d測定一次，連續(xù)測定5 d，每次重復(fù)3次，每次測定結(jié)果為3次測定的峰面積均值，并計算各組分的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

（2）精密度：取10 mL實驗室發(fā)酵米酒加入50 mL容量瓶，用甲醇定容，靜置30 min，過0.22 μL有機膜，雙通道同時進樣，連續(xù)進樣5次，外標法定量，并計算各組分的RSD。

（3）準確度：量取10 mL的米酒發(fā)酵液20份，5份一組（4組），1組用甲醇定容至50 mL，作為本底值，另外3組分別加0.5mL1.3.3中配制的混合標準溶液3#、5#、6#，用甲醇定容為50mL，靜置30min，過膜，進樣分析。計算各組分的回收率，回收率=（加標樣品測定值-樣品測定值）/加標值×100%[19]。

1.3.5 酒樣的處理及分析

分別量取10mL、5mL、2mL、1mL米酒發(fā)酵液于10mL容量瓶中，用甲醇定容稀釋（1、2、5、10）倍，靜置30 min（沉淀多糖及蛋白質(zhì)等大分子絮狀物），取上清液過0.22 μm有機膜，進樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化色譜條件

對三根不同極性色譜柱進行柱效分析比較，結(jié)果見表1。

表1 色譜柱的分離柱效Table 1 Separation column efficiency of chromatographic columns

HP-5色譜柱的氣相色譜圖如圖1所示，甲醇與乙醇的分離度（R）＜1，k'＜0.2（在tm少的同時，0.2≤k'≤20時，色譜柱分離度效果越好）[20]，兩者的分離效果不佳，通過改變色譜條件，也不能改善甲醇與乙醇的分離效果。因此，HP-5色譜柱不適合測定以甲醇為溶劑的乙醇酒樣。

圖1 HP-5色譜柱測定酒樣的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of wine sample with HP-5 column

色譜柱DB-FFAP和HP-INNOWAX的標準品氣相色譜圖見圖2。

由圖2可知，第一個色譜峰為溶劑甲醇，乙醇及各高級醇與酒樣譜圖一一對應(yīng)且彼此分離。由表1和圖2分析優(yōu)化得到本實驗的最佳氣相色譜條件如下：進樣量1 μL；分流比為40∶1；進樣口、檢測器溫度250 ℃；氫氣流量30 mL/min；空氣流量300mL/min；分流流量40mL/min；總流量44mL/min；進樣器溫度250℃；平均線速度25.812cm/s；柱流量1.0mL/min；程序升溫：初始溫度45℃，保持3min，16℃/min升溫至120℃，保持3 min，以50℃/min升溫至220℃，保持2 min。

圖2 DB-FFAP（A）和HP-INNOWAX（B）色譜柱條件下混合標準品的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of mixed standards with DB-FFAP(A)and HP-INNOWAX(B)columns

DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱的色譜圖峰形對稱，各高級醇組分均能完全分離，甲醇與乙醇峰均有重疊，通過調(diào)節(jié)分流比、升溫速率、進樣量等實現(xiàn)色譜條件，使得甲醇峰與乙醇峰實現(xiàn)完全分離；本研究就色譜柱HP-INNOWAX及色譜柱DB-FFAP采用雙通道進樣方法做進一步驗證實驗。

2.2 組分的定量關(guān)系及檢測限

雙通道色譜柱同時進行數(shù)據(jù)采集，以信噪比為10（S/N≈10）為定量限濃度，接近信噪比為3（S/N≈3）為檢測限濃度，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，建立線性方程。得到表2所示的線性范圍、相關(guān)系數(shù)R2、定量限（limit of quantitation，LOQ）及檢出限（limit of detection，LOD）等。

表2 DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱分析各組分的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Table 2 Linear relation,correlation coefficient,LOD and LOQ of each component analysis by DB-FFAP and HP-INNOWAX chromatographic columns

由表2可知，乙醇含量為0.3%vol～19.2%vol，5種高級醇的含量為1.2～204.8 mg/L，DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱的峰面積與含量的線性關(guān)系均良好，各組分的相關(guān)系數(shù)R2在0.999 01～0.999 86，R2均＞0.999，定量限范圍分別為0.42～0.056 mg/L和0.028～0.041 mg/L，檢出限范圍分別為0.022～0.039 mg/L和0.010～0.024 mg/L，兩根色譜柱測定乙醇性能相似，測定高級醇時，HP-INNOWAX色譜柱較DB-FFAP色譜柱的檢出限低。說明在一定濃度范圍內(nèi)，兩根色譜柱在本研究的色譜條件下，6種醇分析檢測的線性關(guān)系良好。

2.3 方法的重復(fù)性試驗

圖3 DB-FFAP（A）和HP-INNOWAX（B）色譜柱分析各組分的重現(xiàn)性試驗結(jié)果Fig.3 Results of reproducibility tests of each component analysis by DB-FFAP(A)and HP-INNOWAX(B)chromatographic columns

采用雙通道DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱對5倍甲醇處理的發(fā)酵米酒同時進行5次數(shù)據(jù)采集，6種醇的峰面積如圖3所示。

由圖3可知，DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱各組分的峰面積表現(xiàn)平穩(wěn)，沒有太大差異，且色譜柱DB-FFAP與HP-INNOWAX各組分峰面積的RSD分別在0.1%～1.9%和0.1%～1.5%范圍內(nèi)波動，說明發(fā)酵酒樣在稀釋5倍時，DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱的重復(fù)性均良好。

2.4 方法的精密度試驗

采用雙通道DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱對5倍甲醇處理的發(fā)酵米酒，同時進樣分析測定5次，測定結(jié)果見表3。

表3 DB-FFAP和HP-INNOWAX色譜柱分析各組分的精密度試驗結(jié)果Table 3 Results of precision tests of each component analysis by DB-FFAP and HP-INNOWAX chromatographic columns

由于測定結(jié)果的相對標準偏差（relative standard devi ation，RSD）數(shù)值越低，方法的精密度越高[21]。由表3可知，在測定稀釋5倍的米酒發(fā)酵液時，色譜柱HP-INNOWAX各組分的RSD在1.79%～3.39%范圍內(nèi)（＜5%），但DB-FFAP色譜柱除異戊醇的RSD=4.53%外，其他成分的RSD均＞5%，且測定β-苯乙醇的RSD高達13.09%。結(jié)果表明，色譜柱HP-INNOWAX測定稀釋5倍的米酒發(fā)酵液精密度良好。

2.5 方法的加標回收率試驗

向樣品中加標測定加標回收率驗證方法的準確度。測定加入高、中、低3個水平的回收率及平均回收率，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，6種醇類的平均回收率在90.89%～96.53%范圍內(nèi)，RSD為0.11%～3.02%（＜5%）。結(jié)果表明，此方法檢測米酒發(fā)酵液中乙醇及高級醇含量的誤差小，在一定范圍內(nèi)，滿足樣品測定的要求，表明該方法的測定結(jié)果準確度較高。

表4 HP-INNOWAX色譜柱分析各組分的加標回收率試驗結(jié)果Table 4 Results of standard recovery rate tests of each component analysis by HP-INNOWAX chromatographic column

續(xù)表

2.6 米酒樣品中6種醇的測定

在發(fā)酵前期，發(fā)酵體系含大量水系和有機大分子，用甲醇作溶劑分別1倍、2倍、5倍、10倍稀釋酒樣，解決因直接進樣而導(dǎo)致的進樣針推阻和柱流失問題色譜柱HP-INNOWAX外標定量測定米酒發(fā)酵液不同倍數(shù)稀釋下各組分的含量，結(jié)果見表5。

表5 不同稀釋倍數(shù)米酒乙醇及高級醇含量測定結(jié)果及相對標準差Table 5 Determination results and relative standard deviation of ethanol and higher alcohol contents in rice wine with different dilution ratio

由表5可知，與原液酒樣對比，稀釋2倍～5倍時RSD值均＜5%，分析結(jié)果與原液測定值差異不大，但當稀釋10倍濃度時，除異丁醇、異戊醇、己醇RSD＜5%外，其他醇測定值偏差較大。因此，本方法確定以甲醇稀釋5倍米酒發(fā)酵液為樣品前處理，直接進樣分析測定米酒中乙醇及高級醇的含量。

3 結(jié)論

本研究以米酒為研究對象，建立米酒釀造過程中乙醇及高級醇含量的測定方法，通過優(yōu)化色譜條件，選擇出分離效果較好的色譜柱DB-FFAP和HP-INNOWAX；5倍甲醇稀釋處理，雙通道色譜柱同時進樣分析比較，兩根色譜柱的精密度實驗驗證：色譜柱DB-FFAP的RSD高達16%，色譜柱HP-INNOWAX各種醇的RSD均小于5%，表明DB-FFAP色譜柱不適合本方法對米酒發(fā)酵過程對乙醇及高級醇的測定；用HP-INNOWAX色譜柱做高、中、低3種不同加標濃度的回收率試驗，平均回收率為90.89%～96.53%，RSD＜5%。與前人研究方法比較，本研究方法樣品分析時間短，用時14.88 min，由此表明，HP-INNOWAX色譜柱的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和準確度均良好，并且省時；綜合考慮進樣針及色譜柱等耗材的維護及損耗，不同倍數(shù)甲醇處理酒樣的色譜分析，確定5倍甲醇稀釋發(fā)酵米酒酒樣。該方法省時，高效、穩(wěn)定、準確，且實用性強，可應(yīng)用于米酒釀造工業(yè)生產(chǎn)上對乙醇及高級醇的實時監(jiān)測。