jet基因與時(shí)差對(duì)果蠅壽命的調(diào)控研究

張佳星，平 勇

(上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240)

隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們對(duì)于健康的重視不斷加強(qiáng)，各項(xiàng)生物學(xué)研究也在不斷更新著我們對(duì)于健康及壽命的認(rèn)識(shí)，然而生物鐘的重復(fù)相移對(duì)健康的影響卻少有研究[1].現(xiàn)今，跨時(shí)區(qū)旅行以及輪班工作已司空見慣，由此我們難免會(huì)產(chǎn)生時(shí)差反應(yīng).受時(shí)差反應(yīng)困擾的人不在少數(shù)，而經(jīng)?？鐣r(shí)區(qū)出行使得人們不由擔(dān)心自己的身體健康，擔(dān)心記憶力衰退、身體代謝水平下降等一系列問(wèn)題[2].我們已知時(shí)差反應(yīng)會(huì)降低神經(jīng)敏銳度，導(dǎo)致許多疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)提高，其中一些疾病的患病幾率會(huì)隨著時(shí)間的推移日益累積，從而導(dǎo)致對(duì)身體健康的累積性傷害，因此也就提高了探究時(shí)差反應(yīng)對(duì)健康影響的必要性[3].毫無(wú)疑問(wèn)，哺乳動(dòng)物和果蠅的生活史存在較大差異，但鑒于其基本生物學(xué)過(guò)程的相似性，哺乳動(dòng)物和果蠅中可能會(huì)存在具有統(tǒng)一性的有效延長(zhǎng)壽命的機(jī)制.因此，果蠅的壽命研究可能會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物(包括人類)類似機(jī)制的分析提供有用性參考[4].果蠅一直是理想的節(jié)律、睡眠與壽命機(jī)制分析的動(dòng)物模型，我們可以通過(guò)突變體果蠅了解時(shí)差反應(yīng)和果蠅體內(nèi)的時(shí)差蛋白對(duì)于壽命的影響，從而為針對(duì)性探究倒時(shí)差的環(huán)境對(duì)人體生理反應(yīng)的影響提供實(shí)驗(yàn)和理論支持[5].

從藍(lán)細(xì)菌到人類的大部分生物體中，都發(fā)現(xiàn)具有約為24h周期性的內(nèi)生性晝夜節(jié)律鐘.生物體節(jié)律通常更接近LD周期(12h光照∶12h黑暗)，更接近它們的自然晝夜節(jié)律，這樣的內(nèi)生性晝夜節(jié)律鐘可能使內(nèi)部和外部節(jié)律之間的時(shí)差最小化[6].近年來(lái)，“時(shí)鐘基因”家族的克隆和特征研究，提高了我們對(duì)于果蠅及哺乳動(dòng)物生物鐘分子機(jī)制的理解.其中，Cry蛋白(Cryptochrome是一種藍(lán)光感受器[7-9])通過(guò)Jet蛋白(Jetlag是一種F-box蛋白[3])和啟動(dòng)分子時(shí)鐘重置的蛋白酶體，介導(dǎo)Tim蛋白(Timeless是一種光依賴時(shí)鐘蛋白[10-11])的快速光依賴性降解.當(dāng)果蠅暴露于光照條件下，體內(nèi)的Jet蛋白使其對(duì)光照敏感，從而對(duì)光照做出快速應(yīng)答.然而，Jet蛋白的功能性喪失使得果蠅對(duì)光照不敏感，不能夠?qū)庹兆鞒黾皶r(shí)的應(yīng)答，使得內(nèi)部和外部節(jié)律不協(xié)調(diào)，從而產(chǎn)生時(shí)差反應(yīng).果蠅的生物鐘對(duì)光照時(shí)間敏感，在大自然中，這種對(duì)光照作出快速應(yīng)答的方式，使得它們將內(nèi)置時(shí)鐘作為一個(gè)計(jì)時(shí)設(shè)備，生理活動(dòng)可以與季節(jié)變化同步，也使得它們?cè)诳鐣r(shí)區(qū)的時(shí)候，能夠快速適應(yīng)新的時(shí)區(qū)[12].已知慢性時(shí)差會(huì)加速果蠅的一種特定形式的運(yùn)動(dòng)老化(是一種年齡相關(guān)的運(yùn)動(dòng)障礙)，并且這種效應(yīng)可以通過(guò)改善晝夜節(jié)律所同步的環(huán)境變化而得到緩解[2].這些研究結(jié)果可能會(huì)促進(jìn)治療時(shí)差反應(yīng)和睡眠障礙的發(fā)展，并且可以提高我們對(duì)時(shí)鐘基因的改變?cè)谒吆蜕窠?jīng)精神障礙等方面所作出的遺傳貢獻(xiàn)的理解.

本研究率先利用jet基因突變體果蠅模型進(jìn)行睡眠與壽命監(jiān)測(cè)，從而探討jet基因和時(shí)差環(huán)境對(duì)果蠅壽命的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了jet基因的缺失對(duì)于果蠅壽命可能產(chǎn)生部分影響，對(duì)于果蠅中的Jet蛋白在果蠅壽命影響中的作用具有提示性意義，其作用機(jī)制與生物學(xué)意義還有待進(jìn)一步研究.

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中用到的果蠅有w1118、yw;jetc;+、yw;jetr;+ 3種基因型[3,13]，均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保種.實(shí)驗(yàn)中用到的果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(Drosophila Activity Monitoring System, DAMS)購(gòu)于美國(guó)Trikinetics公司，普通體式顯微鏡購(gòu)于意大利OPTIKA公司，果蠅時(shí)差反應(yīng)培養(yǎng)的光照裝置購(gòu)于上海良亮燈飾電器有限公司，透明食物管購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司.

1.2 方法

1.2.1 果蠅培養(yǎng)

果蠅在標(biāo)準(zhǔn)玉米麥芽糖糊精培養(yǎng)基上，12h光照∶12h黑暗(LD)環(huán)境下培養(yǎng)，其周期(T)為24h，光照周期為12h(即T=24h;LD 12h∶12h).所有果蠅都在明暗12h交替，溫度25℃的環(huán)境中培養(yǎng).實(shí)驗(yàn)中所用到的果蠅都挑選羽化8h以內(nèi)的雄果蠅[14].

1.2.2 果蠅睡眠節(jié)律活動(dòng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)

挑選羽化8h以內(nèi)的雄性果蠅，單只放入65mm×5mm的特制果蠅管中，置于果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(DAMS)中，每種基因型需平行測(cè)試15～30只.將環(huán)境參數(shù)設(shè)置為L(zhǎng)D環(huán)境，早上9點(diǎn)燈亮，晚上9點(diǎn)燈滅，另一組環(huán)境參數(shù)設(shè)置為DD環(huán)境，持續(xù)黑暗.待果蠅適應(yīng)環(huán)境3～5d后開始正式測(cè)試，以1min/次的頻率記錄下果蠅的活動(dòng)次數(shù).5～7d后結(jié)束監(jiān)測(cè)，收集整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[15].果蠅的睡眠與哺乳動(dòng)物類似，大多是生活在12h明暗交替的環(huán)境中，利用DAMS系統(tǒng)進(jìn)行紅外線的檢測(cè)，基于果蠅每分鐘的活動(dòng)次數(shù)，判斷及估算果蠅的睡眠時(shí)間，其測(cè)試值與實(shí)際值相比較，誤差在可接受范圍內(nèi)，由各因素導(dǎo)致的睡眠水平的不同可以區(qū)分顯著性.

在數(shù)據(jù)分析中，標(biāo)準(zhǔn)睡眠曲線圖通過(guò)統(tǒng)計(jì)果蠅每30min內(nèi)的平均睡眠時(shí)間繪制.果蠅睡眠時(shí)間及用于描述睡眠行為的參數(shù)計(jì)算使用R語(yǔ)言程序?qū)崿F(xiàn).正態(tài)分布的兩種基因型參數(shù)的顯著性差異比較采用student’st-test，多種基因型的比較則采用one-way ANOVA.兩種比較分別通過(guò)Sigma Plot、SPSS統(tǒng)計(jì)軟件實(shí)現(xiàn).

1.2.3 果蠅壽命監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)

分別挑選羽化8h以內(nèi)的w1118、yw;jetc;+、yw;jetr;+ 3種基因型的雄果蠅，每種基因型的雄果蠅分別放入10個(gè)透明食物管中，每管10只果蠅.將3種基因型的果蠅各10管(共30管)，放入明暗12h交替，溫度25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此為一組.第1組果蠅在正常LD的光照周期下培養(yǎng)，為對(duì)照組；第2組果蠅每7d一次，調(diào)整其光照周期提前8h，其他條件與對(duì)照組一致，命名為提前組；第3組果蠅每7d一次，調(diào)整其光照周期延遲8h，其他條件與對(duì)照組一致，命名為延后組.實(shí)驗(yàn)開始后，在每組果蠅的光照狀態(tài)下，每天記錄死亡果蠅的數(shù)量，每3d更換一次食物，直至每組果蠅全部死亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)束.

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

獲得的數(shù)據(jù)通過(guò)Sigma Plot、Coreldraw、Lifespan等軟件分析并作圖.對(duì)于壽命檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，先進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄與數(shù)據(jù)匯總，接著將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Lifespan程序包中，R語(yǔ)言環(huán)境為3.3.2，編程軟件為R Studio.根據(jù)所統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)，進(jìn)行生存分析，繪制不同基因型及不同生存環(huán)境下的果蠅存活率數(shù)據(jù)圖.數(shù)據(jù)完全根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法所獲得，每組數(shù)據(jù)分析采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SEM).對(duì)于成正態(tài)分布的數(shù)據(jù)一般通過(guò)student’st-test和生存分析比較(多組).對(duì)壽命監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)主要采用生存分析，分為兩組比較和兩組以上比較.當(dāng)*P<0.05，即為有顯著性差異，同時(shí)設(shè)定**P<0.01，***P<0.001.

2 結(jié) 果

2.1 w1118果蠅與yw;jetc;+、yw;jetr;+果蠅的標(biāo)準(zhǔn)睡眠曲線圖比較

由于Amita Sehgal等[3]關(guān)于jet基因型的研究工作中采用了w1118野生型果蠅為對(duì)照組，進(jìn)行節(jié)律分析，得出了jet突變體果蠅具有時(shí)差反應(yīng)這一結(jié)論.由此，為探尋jet基因型與野生型果蠅在時(shí)差反應(yīng)中對(duì)壽命的影響關(guān)系，我們也延續(xù)這一標(biāo)準(zhǔn)，采用w1118基因型的果蠅進(jìn)行睡眠以及壽命實(shí)驗(yàn).首先，為排除w1118與yw品系的果蠅遺傳背景的影響，比較分析并統(tǒng)計(jì)兩種基因型的果蠅每30min的睡眠時(shí)間以及白天睡眠總量、夜間睡眠總量、全天睡眠總量等，做出睡眠曲線圖與睡眠柱狀圖(圖1).

圖1 w1118與yw的睡眠差異比較Fig.1 The comparison of w1118 and yw in sleep difference(a) w1118與yw的睡眠趨勢(shì)圖，每個(gè)點(diǎn)表示果蠅30min睡眠總量平均值，測(cè)試中果蠅處于LD環(huán)境.(b) w1118與yw白天、夜間及全天睡眠總量柱狀圖，均值比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)(n.s.: 無(wú)顯著性差異).

比較得出，w1118與yw品系的果蠅在睡眠節(jié)律與睡眠量等方面并無(wú)顯著性差異(n.s.)，由此，我們可以排除兩者之間的遺傳背景不同可能會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)的影響，可以進(jìn)一步利用兩種jet突變體果蠅，與對(duì)照組果蠅的睡眠狀況進(jìn)行比較分析.

實(shí)驗(yàn)中將w1118作為對(duì)照組，yw;jetc;+、yw;jetr;+作為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行睡眠監(jiān)測(cè)，收集整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2，圖3所示.我們分別統(tǒng)計(jì)了3種基因型果蠅每30min的睡眠時(shí)間、白天睡眠總量、夜間睡眠總量、全天睡眠總量、全天睡眠次數(shù)和每段全天睡眠平均持續(xù)時(shí)間等睡眠參數(shù)來(lái)定量描述果蠅的睡眠狀況.

圖2 LD條件下，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組睡眠趨勢(shì)圖Fig.2 Sleep trends in control and experimental groups under LD condition每個(gè)點(diǎn)表示果蠅30min睡眠總量平均值，測(cè)試中果蠅處于LD環(huán)境.

圖3 LD條件下，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組白天、夜間及全天 睡眠總量柱狀圖Fig.3 Bar graph of day-time, night-time, and total in control and experimental groups under LD condition均值比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，**P<0.01,***P<0.001.

由睡眠曲線可以看出，實(shí)驗(yàn)組的曲線位于對(duì)照組上方.分析指出，相比于對(duì)照組(w1118)，實(shí)驗(yàn)組的果蠅(yw;jetc;+，yw;jetr;+)白天和夜間的睡眠時(shí)間均顯著性增加，其中對(duì)照組白天和夜間睡眠分別為(247.9310±3.1435)min和(356.1494±3.5507)min,而實(shí)驗(yàn)組與之相對(duì)應(yīng)的值分別有(296.0000±4.3549)min和(528.0000±3.8087)min(yw;jetc;+)，(447.3846±2.9812)min和(432.3077±3.6210)min(yw;jetr;+).

根據(jù)以上數(shù)據(jù)，我們可以得出，兩種jet突變體果蠅在一天中的睡眠總量均顯著高于野生型果蠅，進(jìn)而推測(cè)果蠅神經(jīng)元內(nèi)Jet蛋白功能的喪失會(huì)導(dǎo)致睡眠總量的升高，提示Jet蛋白本身可能在果蠅睡眠調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，生物鐘環(huán)路的變化也可能與睡眠時(shí)間的延長(zhǎng)存在相關(guān)性.

2.2 w1118果蠅與yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅的睡眠參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析

圖4 LD條件下對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組平均 每分鐘活動(dòng)量柱狀圖Fig.4 Bar graph of the average activity per minute in the control and experimental groups under LD condition均值比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，n.s.： 無(wú)顯著性差異.

對(duì)w1118、yw;jetc;+、yw;jetr;+基因型雄果蠅的標(biāo)準(zhǔn)睡眠數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)3種基因型果蠅的全天睡眠總量及睡眠次數(shù)，并得出平均睡眠時(shí)間，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.為了排除對(duì)照組果蠅與實(shí)驗(yàn)組果蠅自身活動(dòng)性差異可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，我們檢測(cè)了yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅活動(dòng)性與w1118果蠅是否一致.采用平均每分鐘的活動(dòng)量為參數(shù)進(jìn)行比較，如圖4所示.

由圖4可知，yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅與w1118果蠅的平均每分鐘活動(dòng)量并無(wú)顯著性差異，yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅的活動(dòng)性表現(xiàn)正常，并未對(duì)睡眠量的升高造成顯著影響，同時(shí)，也驗(yàn)證了Amita Sehgal等關(guān)于jet基因型的研究工作中的結(jié)論，jet突變體果蠅在LD條件下的活動(dòng)性保持正常.因此，我們可以排除對(duì)照組果蠅與實(shí)驗(yàn)組果蠅自身活動(dòng)性差異可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響.

對(duì)于實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的睡眠量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，yw;jetc;+基因型果蠅的全天睡眠時(shí)間總量顯著高于w1118果蠅(**P<0.01)，且平均睡眠時(shí)間顯著高于w1118果蠅(***P<0.001)，從而，全天睡眠次數(shù)顯著低于w1118果蠅(***P<0.001)(圖5(a)).進(jìn)一步分析全天睡眠參數(shù)顯示，yw;jetr;+果蠅全天睡眠次數(shù)并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，而平均每段睡眠的持續(xù)時(shí)間卻從平均(37.0349±1.4653)min/次提高到(48.6631±2.0521)min/次，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異.yw;jetc;+果蠅全天睡眠次數(shù)顯著降低，由平均(21.1609±0.8903)次降低到(13.5667±0.9455)次，而平均每段睡眠的持續(xù)時(shí)間卻從平均(37.0349±1.4653)min/次提高到(76.2802±3.0607)min/次，且具有顯著性差異(圖5(b)).這也就意味著，兩種同類型jet突變體果蠅的睡眠總量的提升是由促進(jìn)了睡眠狀態(tài)的維持所引起的.

圖6 DD條件下，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組睡眠趨勢(shì)圖Fig.6 Sleep trends in control and experimental groups under DD condition

以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，在LD條件下，兩種同類型jet突變體果蠅的睡眠時(shí)間顯著高于對(duì)照組果蠅，其睡眠次數(shù)相對(duì)較少，每次睡眠持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng).果蠅體內(nèi)Jet蛋白的缺失可能會(huì)促進(jìn)睡眠質(zhì)量的提升，提示了Jet蛋白功能的缺失反而能促進(jìn)果蠅睡眠的維持，出現(xiàn)嗜睡癥狀(嗜睡是果蠅中一種以睡眠量過(guò)量為特征的現(xiàn)象，其以白天睡眠量顯著升高為主要特征).

為了進(jìn)一步探究jet基因的缺失是否會(huì)對(duì)DD(Dark Dark)條件下突變體果蠅的睡眠有類似的影響，我們對(duì)置于DD條件下的w1118、yw;jetc;+、yw;jetr;+基因型的雄果蠅的標(biāo)準(zhǔn)睡眠數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示.

對(duì)于DD條件下，實(shí)驗(yàn)組果蠅和對(duì)照組果蠅的睡眠狀態(tài)，我們選用與LD條件下相同的參數(shù)進(jìn)行比較分析，由睡眠曲線(圖7)可以看出，實(shí)驗(yàn)組的曲線位于對(duì)照組上方.相比于對(duì)照組(w1118)，實(shí)驗(yàn)組的果蠅(yw;jetc;+，yw;jetr;+)白天和夜間的睡眠時(shí)間均顯著性增加，其中對(duì)照組白天和夜間睡眠分別為(162.8333±3.8602) min和(251.5000±3.7976) min,而實(shí)驗(yàn)組與之相對(duì)應(yīng)的值分別有(205.6061±4.1871) min和(499.2424±3.5707) min(yw;jetc;+)，(384.6667±4.4799) min和(497.8333±3.9815) min(yw;jetr;+).

同樣的，為了排除對(duì)照組果蠅與實(shí)驗(yàn)組果蠅自身活動(dòng)性差異可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，我們檢測(cè)了在DD條件下yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅活動(dòng)性與w1118果蠅是否一致.采用平均每分鐘的活動(dòng)量為參數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果如圖8所示.

圖7 DD條件下，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組白天、夜間及全天睡眠總量柱狀圖Fig.7 Bar graph of day-time, night-time, and total in control and experimental groups under DD condition均值比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，***P<0.001.

圖8 DD條件下對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組平均每分鐘 活動(dòng)量柱狀圖Fig.8 Bar graph of the average activity per minute in the control and experimental groups under DD condition均值比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，n.s.： 無(wú)顯著性差異.

在DD條件下，yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅與w1118果蠅的平均每分鐘活動(dòng)量并無(wú)顯著性差異，突變體果蠅的活動(dòng)性與對(duì)照組活動(dòng)性一致，yw;jetc;+，yw;jetr;+果蠅的活動(dòng)性表現(xiàn)正常，并未對(duì)睡眠量的升高造成顯著影響.

對(duì)于實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的睡眠量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，與LD條件下表現(xiàn)相同的是，yw;jetc;+與yw;jetr;+基因型果蠅的全天睡眠時(shí)間總量均顯著高于w1118果蠅(***P<0.001)，且平均睡眠時(shí)間顯著高于w1118果蠅(***P<0.001).全天睡眠參數(shù)(圖9)顯示，與w1118相比，yw;jetc;+與yw;jetr;+果蠅全天睡眠次數(shù)顯著降低，由平均(37.0333±1.1304)次降低到(20.3333±1.1072)次和(26.4667±1.3661)次，而平均每段睡眠的持續(xù)時(shí)間卻從平均(11.2479±0.8173) min/次提高到(39.2554±1.6289) min/次和(46.7309±3.0450) min/次，且具有顯著性差異.數(shù)據(jù)表明，在DD條件下，突變體果蠅睡眠的異常與LD條件下基本保持一致.

圖9 DD條件下全天睡眠次數(shù)與平均睡眠時(shí)間柱狀圖Fig.9 Bar graph of sleep bout number and sleep bout duration under DD condition(a) 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的全天睡眠次數(shù)；(b) 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的全天睡眠平均時(shí)間.均值比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，***P<0.001.

通過(guò)DD條件下兩種突變體果蠅睡眠量和睡眠狀態(tài)的分析，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了LD條件下的推測(cè)，果蠅體內(nèi)Jet蛋白的缺失可能會(huì)促進(jìn)睡眠量的增加，jet基因的缺失使得果蠅的睡眠量出現(xiàn)異常，出現(xiàn)嗜睡癥狀.

2.3 jet突變體果蠅的壽命曲線

圖10 正常光照下對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的壽命曲線圖Fig.10 Life curve of the control group and the experimental groups under normal light cycle conditions在正常12h∶12h光照周期情況下，野生型果蠅生存狀況良好，呈現(xiàn)良好的壽命分布，突變體果蠅yw;jetc;+，ywjetr;+與正常果蠅的存活率呈現(xiàn)顯著性差異(yw;jetc;+和w1118： ***P<0.001; ywjetr;+和w1118： ***P<0.001).

為了探究Jet蛋白的功能性喪失對(duì)于果蠅壽命的影響，我們首先進(jìn)行了正常環(huán)境條件下的果蠅壽命監(jiān)測(cè).分別統(tǒng)計(jì)w1118、yw;jetc;+、yw;jetr;+基因型的雄果蠅在正常LD光照周期下的壽命，將壽命數(shù)據(jù)導(dǎo)入R語(yǔ)言程序包，利用Lifespan程序[16]作出存活率曲線圖，每種基因型的果蠅約100只.

從圖10可以看出，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在前45d左右的存活率基本保持一致，在壽命的后程階段，3種基因型的果蠅呈現(xiàn)不同的趨向.w1118果蠅存活率下降趨勢(shì)較為平緩，基本保持平穩(wěn)下降，yw;jetc;+果蠅的存活率在83d左右呈現(xiàn)斷崖式下降，總體存活率高于對(duì)照組果蠅，yw;jetr;+果蠅呈現(xiàn)出較為迅速的下降趨勢(shì).對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組果蠅壽命趨勢(shì)可以明顯區(qū)分和比較.

2.4 不同的時(shí)差條件對(duì)jet突變體果蠅壽命的影響

圖11 (a) w1118、(b) yw;jetc;+和(c) ywjetr;+ 在3種光照周期條件下的壽命曲線圖Fig.11 Life curve of w1118(a) , yw;jetc;+(b) and yw;jetr;+(c) under three light cycles(a)w1118基因型的果蠅正常情況下與提前組和延后組的存活率并無(wú)太大差異. (b), (c)相較于對(duì)照組，提前組和延后組的生存狀況良好.

為了解在不同時(shí)差環(huán)境中，Jet蛋白的功能性喪失對(duì)果蠅的壽命有何影響，我們進(jìn)行了正常果蠅與突變體果蠅在不同的時(shí)差條件下的壽命比較.分別統(tǒng)計(jì)了w1118、yw;jetc;+、yw;jetr;+基因型的雄果蠅在提前組和延后組(見材料與方法)情況下的壽命，與正常環(huán)境周期下的果蠅進(jìn)行自身對(duì)照.對(duì)w1118基因型的果蠅在正常條件下以及提前組和延后組條件下的存活率數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖.根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，對(duì)照組果蠅的壽命為(67.7692±1.8634) d，提前組果蠅為(65.2874±2.1301) d，延后組果蠅為(70.3333±1.4514) d.從圖11(a)中可以看出，相對(duì)于對(duì)照組果蠅，每隔7d將光照周期提前8h所產(chǎn)生的時(shí)差，使得本身不具有時(shí)差反應(yīng)的野生型果蠅在壽命上并無(wú)太大改變(n.s.)，而延后組的果蠅壽命有輕微的延長(zhǎng)(*P<0.05).在正常光照時(shí)間周期持續(xù)到第50天時(shí)，對(duì)照組果蠅有75只存活，光照周期每周提前的果蠅有72只存活，經(jīng)歷光照周期延遲的果蠅有80只存活，在當(dāng)存活率到達(dá)50%時(shí)，對(duì)照組果蠅的壽命已經(jīng)到達(dá)69d，光照周期每周提前的果蠅壽命達(dá)到68d，經(jīng)歷光照周期延遲的果蠅壽命為72d.在野生型果蠅體內(nèi)，其正常功能的實(shí)現(xiàn)需要依靠各種時(shí)鐘蛋白的相互調(diào)控.在很大程度上，整個(gè)節(jié)律系統(tǒng)必須依靠外部及內(nèi)部分子的變化來(lái)維持正常的內(nèi)生性生物鐘的調(diào)控.它們通過(guò)協(xié)調(diào)多種組織和細(xì)胞分子的活動(dòng)，不斷地進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而維持其日常的生理和行為活動(dòng).這種內(nèi)源性節(jié)律調(diào)控對(duì)光線急劇或輕微變化(如閃電和滿月)而言相對(duì)難以適應(yīng)，但對(duì)黎明和黃昏以及適應(yīng)季節(jié)變化導(dǎo)致的日長(zhǎng)時(shí)間變化非常敏感[17].w1118果蠅本身有完整的時(shí)鐘蛋白調(diào)控系統(tǒng)，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Jet蛋白與Cry蛋白的結(jié)合，引起Tim蛋白的下調(diào)，來(lái)對(duì)光照條件的變化進(jìn)行快速應(yīng)答，進(jìn)而維持整個(gè)生命周期的調(diào)控[18].

基因型為yw;jetc;+的果蠅在提前組和延后組的光照條件中，受光照周期變化的影響，其生存狀況良好，在果蠅壽命的后程，其存活率顯著高于對(duì)照組.由圖11(b)可知，在正常光照時(shí)間周期持續(xù)到第50天時(shí)，對(duì)照組果蠅有71只存活，光照周期每周提前的果蠅依然有81只存活，經(jīng)歷光照周期延遲的果蠅有79只存活，在當(dāng)存活率到達(dá)50%時(shí)，對(duì)照組果蠅的壽命為83d，光照周期每周提前的果蠅壽命達(dá)到89d，經(jīng)歷光照周期延遲的果蠅壽命為86d.根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，對(duì)照組果蠅的壽命為(71.6296±2.7848) d，提前組果蠅為(80.7416±2.5626) d，延后組果蠅為(73.1684±3.0426) d.對(duì)于yw;jetc;+基因型的突變體果蠅，逐步推進(jìn)或延后其光照周期，延長(zhǎng)了該突變體果蠅的壽命，即時(shí)差條件可能會(huì)有利于其生存，給予其一定的時(shí)差環(huán)境可能會(huì)對(duì)其自身的壽命調(diào)控機(jī)制起到一定的正向作用.

基因型為yw;jetr;+的果蠅在提前組和延后組的光照條件中，也顯示了同樣的趨勢(shì)(圖11(c)).根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，對(duì)照組果蠅壽命為(62.1529±1.5556) d，提前組為(65.9111±2.6990) d，延后組為(71.8421±2.3074) d.在正常光照時(shí)間周期持續(xù)到第50天時(shí)，對(duì)照組果蠅有67只存活，光照周期每周提前的果蠅有73只存活，經(jīng)歷光照周期延遲的果蠅有80只存活，在當(dāng)存活率到達(dá)50%時(shí)，對(duì)照果蠅的壽命已經(jīng)到達(dá)64d，光照周期每周提前的果蠅壽命達(dá)到76d，經(jīng)歷光照周期延遲的果蠅壽命為82d.同樣地，我們可以得出與yw;jetc;+果蠅類似的推論，對(duì)于yw;jetr;+果蠅來(lái)說(shuō)，逐步推進(jìn)或延后其光照周期，延長(zhǎng)了該突變體果蠅的壽命，即時(shí)差條件可能會(huì)有利于其生存.

表1總結(jié)了3種基因型的果蠅在不同的環(huán)境條件下的兩個(gè)生存標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)： 果蠅達(dá)到50%存活率的天數(shù)以及在第50天果蠅的存活率.在9組實(shí)驗(yàn)下，分別對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的每個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)境中得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析.

表1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在不同的條件下的兩個(gè)生存標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)

注：Nx表示每組果蠅的數(shù)量，N1=91,N2=87,N3=87,N4=95,N5=89,N6=95,N7=85,N8=90,N9=95.

注： -表示無(wú)顯著性差異比較，n.s.表示不存在顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(生存分析比較).

表2總結(jié)了對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在3種時(shí)差條件下的顯著性差異比較.在比較分析中，我們提出兩個(gè)問(wèn)題： 兩種基因型的果蠅在不同的時(shí)差環(huán)境中的生存能力是否有顯著差異；jet突變體果蠅在不同的時(shí)差條件下的平均生存率是否顯著大于正常環(huán)境下的平均值？結(jié)果表明： 在突變體果蠅的生存實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是50%存活率的天數(shù)標(biāo)準(zhǔn)還是在第50天存活的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)，都表現(xiàn)出了在時(shí)差環(huán)境下，其壽命的延長(zhǎng).僅考慮這3種周期性時(shí)差的環(huán)境，清楚地表明了一點(diǎn)，對(duì)于jet突變體果蠅來(lái)說(shuō)，給予相應(yīng)的時(shí)差環(huán)境，有利于其壽命的延長(zhǎng).而對(duì)于野生型果蠅w1118來(lái)說(shuō)，每隔7d將生物鐘提前8h并沒(méi)有對(duì)其生長(zhǎng)造成顯著影響，然而每隔7d將生物鐘延后8h的情況對(duì)其壽命有輕微影響，總體來(lái)說(shuō)，并沒(méi)有太大差異.已有研究表明，在光照情況下，野生型果蠅對(duì)光照反應(yīng)敏感，內(nèi)置生物周期可以對(duì)光照周期的改變作出快速應(yīng)答，調(diào)控Tim蛋白的降解，進(jìn)而調(diào)控整個(gè)節(jié)律系統(tǒng)[3].由此我們可以推測(cè)，正是這種對(duì)光反應(yīng)的快速應(yīng)答，使得光照周期的改變并不能對(duì)其產(chǎn)生明顯影響，可能對(duì)壽命的影響也微乎其微.

3 討 論

在果蠅的睡眠監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)中，我們可以發(fā)現(xiàn)，兩種同類型jet突變體果蠅的睡眠時(shí)間顯著高于對(duì)照組果蠅，其睡眠次數(shù)相對(duì)較少，每次睡眠時(shí)間較長(zhǎng)，這種表現(xiàn)的異常也就提示了Jet蛋白功能的缺失反而能促進(jìn)果蠅睡眠的維持，出現(xiàn)嗜睡癥狀.在3組壽命監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)中，兩種jet突變體壽命在時(shí)差環(huán)境中表現(xiàn)出顯著性延長(zhǎng)，而對(duì)照組果蠅則沒(méi)有明顯變化.由突變體基因型和對(duì)照組基因型的睡眠及壽命比較可知，兩種同類型jet突變體的睡眠量的增加對(duì)于正常條件下壽命的影響可能不具有相關(guān)性.

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次展示，對(duì)于jet突變體果蠅，在時(shí)差條件下，Jet蛋白功能的缺失可能有利于其壽命的延長(zhǎng)，起到正向的環(huán)境誘導(dǎo)作用.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，野生型果蠅本身表達(dá)Jet蛋白，并且可以及時(shí)對(duì)光照作出應(yīng)答，然而利用轉(zhuǎn)基因手段，使得遺傳學(xué)上保守的jet基因不能正常表達(dá)，類似于給予果蠅人為的不利條件，將其置于時(shí)差環(huán)境中，可能會(huì)起到類似挽救的作用，從而在宏觀上表現(xiàn)出壽命的顯著性延長(zhǎng)，而對(duì)于野生型果蠅則沒(méi)有類似的作用.一般認(rèn)為，睡眠量減少與壽命降低有顯著性關(guān)聯(lián)，但是鮮有睡眠量的增加與壽命的延長(zhǎng)有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性的研究.分析認(rèn)為，w1118果蠅的睡眠量保持正常狀態(tài)，具有正常的生物鐘環(huán)路，而影響野生型果蠅壽命的方式和途徑有多種，其中，比較常見的有JNK、MAPK、mTOR、Wnt、Notch和Hippo信號(hào)傳導(dǎo)途徑等，涉及到自噬、翻譯、糖酵解、氧化磷酸化、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答、神經(jīng)發(fā)生、睡眠和對(duì)DNA損傷的反應(yīng)等[19-20].本文的實(shí)驗(yàn)探究中，以野生型果蠅作為對(duì)照，利用突變體果蠅尋找內(nèi)部節(jié)律與外部環(huán)境中的關(guān)聯(lián)，果蠅睡眠量的變化可能受多種途徑和方式的共同影響，使得果蠅壽命作出一定的改變，其中的影響途徑較為復(fù)雜，并未表現(xiàn)出一致性.所以，我們?cè)谔骄績(jī)烧咧g聯(lián)系的可能性的同時(shí)，不否認(rèn)其過(guò)程中其他內(nèi)置因素對(duì)于結(jié)果的影響，由此表現(xiàn)出壽命與睡眠長(zhǎng)度未完全一致.

已知果蠅節(jié)律研究中，Tim蛋白對(duì)光敏感，即使是短暫的光脈沖也會(huì)觸發(fā)Tim蛋白的降解，體內(nèi)Tim蛋白水平的變化可以重置分子時(shí)鐘，并引起生物鐘的重置[21-22].進(jìn)一步研究指出，Jet與Cry相互作用在果蠅體內(nèi)非常重要，能夠保障高效的光誘導(dǎo)的Tim降解[21].一般有兩種方式： Cry與Tim的結(jié)合可以修飾Tim，使它可以結(jié)合Jet誘導(dǎo)降解；另一種是Jet-Cry復(fù)合物與Tim結(jié)合，從而誘導(dǎo)Tim降解，因此Jet-Cry復(fù)合物對(duì)于Tim的修飾是引起Tim蛋白快速光依賴性降解的重要部分[3,23].已知不同的基因操作和環(huán)境干預(yù)可延長(zhǎng)果蠅的壽命[4]，環(huán)境因素會(huì)對(duì)jet時(shí)鐘基因影響其壽命產(chǎn)生一定作用，并且功能性的生物鐘改變能防止果蠅過(guò)早老化，由此，jet突變體果蠅由于特定的遺傳和/或環(huán)境因素而顯示出復(fù)雜的壽命變異性模式[24].果蠅的廣義抗逆性可能是在整個(gè)物種中延長(zhǎng)成年壽命的主要機(jī)制，其抗性機(jī)制在不同的基因型中表達(dá)延長(zhǎng)的壽命表型可能會(huì)涉及不同的遺傳、分子和生理機(jī)制[5].一方面，在jet突變體果蠅中，Jet蛋白功能的喪失引起了Tim蛋白的不充分降解，其內(nèi)置周期性調(diào)節(jié)不完全，可能會(huì)引起自身調(diào)節(jié)機(jī)制的損害，而在外部施加時(shí)差環(huán)境之后，可能會(huì)使得環(huán)境條件接近其內(nèi)生環(huán)境，表現(xiàn)出壽命的延長(zhǎng)[24-25].另一方面，F(xiàn)-box蛋白Jetlag參與了生物鐘的重置機(jī)制，普遍認(rèn)為，Jet是Skp1/Cullin/F-Box(SCF)E3泛素連接酶復(fù)合物組分，其在Cry存在的情況下與Tim以光依賴的方式結(jié)合.這種相互作用促進(jìn)Tim的泛素化和降解，而突變體果蠅在Tim的泛素化方面效果較差[10].SCF復(fù)合物調(diào)節(jié)許多不同的細(xì)胞和發(fā)育過(guò)程,Jet與SkpA(果蠅中的幾種Skp1同源物之一)相互作用.skpA是表達(dá)最豐富的果蠅skp1相關(guān)基因，果蠅SkpA是SCF泛素連接酶的一個(gè)組成部分，它調(diào)節(jié)細(xì)胞和中心體周期之間的聯(lián)系.SkpA在調(diào)節(jié)中心體復(fù)制，核內(nèi)復(fù)制，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞周期蛋白E積累等方面發(fā)揮重要作用[26].而在突變體果蠅中，Jet蛋白含量的變化使得其不可避免地對(duì)與SkpA的相互作用產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而通過(guò)SCF復(fù)合物造成對(duì)整個(gè)生命周期的影響.同時(shí)，jet基因?qū)λダ?、心律失常等都有一定的影響，我們推測(cè)jet的缺失可能不是主要通過(guò)對(duì)下游基因tim的表達(dá)調(diào)控引起睡眠異常，而是通過(guò)多種途徑對(duì)生物周期產(chǎn)生影響.

在哺乳動(dòng)物中，我們會(huì)經(jīng)常認(rèn)為時(shí)差反應(yīng)會(huì)帶來(lái)健康的危害以及壽命的減短，本文利用jet突變體果蠅首次發(fā)現(xiàn)時(shí)差環(huán)境下，可能會(huì)有利于該時(shí)差蛋白缺失果蠅壽命的延長(zhǎng).我們推測(cè)，野生型果蠅自身合成Jet蛋白，可及時(shí)對(duì)光照作出應(yīng)答，利用轉(zhuǎn)基因手段，使得其體內(nèi)本應(yīng)正常表達(dá)的jet基因不能參與正常的時(shí)差蛋白調(diào)控后，可以認(rèn)為是人為的給予果蠅以時(shí)差蛋白的缺失，其內(nèi)部穩(wěn)態(tài)環(huán)境受到破壞，當(dāng)在外部環(huán)境中給予一定時(shí)差后，影響了相關(guān)時(shí)差蛋白的調(diào)控，從而影響相關(guān)激素水平及蛋白水平的調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響到壽命的調(diào)控.而對(duì)于野生型果蠅，其本身內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定，給予時(shí)差環(huán)境后，對(duì)其內(nèi)部穩(wěn)態(tài)并無(wú)明顯改變，由此并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的作用.我們認(rèn)為，進(jìn)一步探究jet突變體果蠅壽命延長(zhǎng)現(xiàn)象的原因可能的方向是，在jet突變體果蠅中，Jet蛋白的缺失引起了Tim蛋白的不充分降解，其內(nèi)置周期性調(diào)節(jié)不完全，引起內(nèi)置環(huán)境的損害，而在外部施加時(shí)差環(huán)境之后，維持在環(huán)境條件接近其內(nèi)生環(huán)境中，表現(xiàn)出壽命的延長(zhǎng)，另一種可能的方向是Jet蛋白含量的變化使得其對(duì)與SkpA的相互作用產(chǎn)生一定影響，進(jìn)而通過(guò)SCF復(fù)合物造成對(duì)整個(gè)生命周期的影響.這些結(jié)果提示，今后可以利用果蠅的jet突變體模型，深入研究時(shí)差蛋白對(duì)果蠅內(nèi)部節(jié)律及激素水平調(diào)節(jié)的神經(jīng)環(huán)路和細(xì)胞分子基礎(chǔ).

時(shí)差環(huán)境是如何對(duì)生物產(chǎn)生影響的？在生物界中，科學(xué)的闡述生物體內(nèi)如何對(duì)快速的光周期的變化作出應(yīng)答是十分必要的.在果蠅中存在的與時(shí)差反應(yīng)有重要聯(lián)系的Jet蛋白，以及與它具有高度相似性的哺乳動(dòng)物F-box蛋白的功能尚未有清晰的確定.我們未來(lái)的工作將進(jìn)一步研究控制Jet蛋白水平變化的條件因素和分子機(jī)制，進(jìn)而觀察在果蠅體內(nèi)，時(shí)鐘蛋白水平的變化對(duì)果蠅內(nèi)環(huán)境所產(chǎn)生的多方面影響，后續(xù)可以探究時(shí)差環(huán)境使得jet突變體果蠅壽命延長(zhǎng)的分子機(jī)制，從而對(duì)人類的壽命研究有所提示.