饒震紅， 王明安， 陳蓁蓁， 張 莉*

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院， 北京 100083; 2. 山東師范大學(xué) 化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院， 山東 濟(jì)南 250014)

1 引 言

玉米醇溶蛋白(Zein)是玉米中含量最高的儲藏蛋白，其氨基酸序列中超過50%是疏水性氨基酸殘基，溶劑乙醇的含量及pH高低影響著玉米醇溶蛋白的性能[1]。研究表明玉米醇溶蛋白在醇的水溶液中可以自組裝成微球形成納米結(jié)構(gòu)[2]，微球結(jié)構(gòu)是包埋的理想形態(tài)，因此玉米醇溶蛋白是傳遞物質(zhì)的良好載體[3]。作為天然疏水兩親性高分子材料，玉米醇溶蛋白在藥物緩釋材料的應(yīng)用以及利用包埋技術(shù)保護(hù)物質(zhì)生物活性方面的研究成為當(dāng)今的熱點(diǎn)。Joye研究了玉米醇溶蛋白封裝白藜蘆醇的可能性[4]；Gao研究了基于玉米醇溶蛋白和丙二醇海藻酸鈉的二元配合物槲皮素的傳遞作用[5]。

生物大分子二級結(jié)構(gòu)因結(jié)合而發(fā)生的變化會導(dǎo)致蛋白質(zhì)整體性質(zhì)的改變[15]，為此本文利用熒光光譜、紫外光譜、ATR-FTIR傅里葉紅外光譜和核磁共振氫譜探究檸檬黃與兩親性玉米醇溶蛋白的相互作用，分析檸檬黃的加入對玉米醇溶蛋白構(gòu)象的影響，為玉米醇溶蛋白擴(kuò)展應(yīng)用范圍及檸檬黃合成色素的合理使用提供借鑒資料。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

LS55型熒光光度計(jì)、Lambda 650紫外-可見分光光度計(jì)(PerkinElmer公司)；IS10傅里葉紅外光譜儀(Thermo公司)；Avance DPX 300 核磁共振波譜儀(Bruker公司)；AB104-N分析天平(Mettler公司)。

玉米醇溶蛋白(北京百靈威科技有限公司，含量98%)用85%的乙醇超聲溶解，配成5.3×10-2g/mL的儲備液；檸檬黃(阿拉丁試劑有限公司)結(jié)構(gòu)式見圖1，用純凈水配成1.0×10-3mol/L的儲備液，于陰涼暗處存放，用時分別逐級稀釋到所需濃度。實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

圖1 檸檬黃的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 熒光光譜分析

在若干只10 mL比色管中，均加入1.00 mL玉米醇溶蛋白溶液和不同濃度的檸檬黃溶液，用85%乙醇溶液稀釋定容，混合均勻后，于不同溫度下放置1 h，固定激發(fā)波長λex=280 nm，狹縫寬度5.0/5.0 nm,發(fā)射波長在280～410 nm范圍，掃描熒光光譜。設(shè)置激發(fā)波長范圍200～300 nm，發(fā)射波長范圍260～380 nm，狹縫寬度5.0/5.0 nm，激發(fā)波長每遞增5 nm掃描一次，得到玉米醇溶蛋白和檸檬黃與玉米蛋白結(jié)合后的三維熒光譜。

2.2.2 紫外差譜分析

室溫下，若干支10 mL比色管中加入固定量的玉米醇溶蛋白溶液，再分別加入不同濃度的檸檬黃溶液，定容混合均勻，并放置1 h后，在270～320 nm范圍內(nèi)，以85%乙醇溶液為空白溶液，掃描各溶液的紫外光譜。記錄吸收強(qiáng)度及最大吸收波長的變化，計(jì)算吸收強(qiáng)度的差值。

2.2.3 ATR-FTIR傅里葉紅外分析及自去卷積計(jì)算

利用Thermo公司 IS10所帶的衰減全反射ATR附件測定溶液的紅外光譜，掃描范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)64，數(shù)據(jù)間隔0.482 cm-1，分辨率4 cm-1。將一定濃度的玉米醇溶蛋白溶液與檸檬黃溶液按2∶1混合均勻，放置達(dá)到平衡后直接置于ATR附件上面，使用OMNIC 9軟件進(jìn)行紅外光譜掃描。再用Peakfi V4軟件對酰胺Ⅰ帶區(qū)域進(jìn)行去卷積計(jì)算。

2.2.4 核磁共振氫譜分析

配制一定濃度的檸檬黃溶液和一定濃度的檸檬黃與玉米醇溶蛋白相互作用達(dá)到平衡的溶液，分別放于核磁管中進(jìn)行氫譜分析。核共振頻率300 MHz，zg30脈沖序列，掃描次數(shù)6，弛豫時間2 s，譜寬7 183 Hz，脈沖寬度(P1)10.70 μs。

3 結(jié)果與討論

3.1 檸檬黃與玉米醇溶蛋白相互作用的熒光光譜

玉米醇溶蛋白溶液與不同濃度的檸檬黃溶液混合后，所得熒光光譜如圖2所示。結(jié)果表明隨著檸檬黃濃度的增加，玉米醇溶蛋白在305.5 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，存在明顯的熒光猝滅現(xiàn)象，最大發(fā)射波長微弱藍(lán)移。

從同步熒光光譜同樣觀察到熒光猝滅現(xiàn)象，如圖3所示，固定玉米醇溶蛋白的濃度，隨著檸檬黃濃度的增加，玉米醇溶蛋白的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。Δλ=60 nm時表現(xiàn)為玉米醇溶蛋白中色氨酸殘基的光譜特征，Δλ=15 nm時表現(xiàn)為玉米醇溶蛋白中酪氨酸殘基的光譜特征[16]，酪氨酸和色氨酸的峰位均發(fā)生了不同程度的紅移。說明檸檬黃的加入使得氨基酸殘基微環(huán)境的疏水性降低，對玉米醇溶蛋白的構(gòu)象產(chǎn)生了顯著的影響。

圖2 不同濃度的檸檬黃與玉米醇溶蛋白的熒光光譜(T=299 K)

Fig.2 Fluorescence spectra of zein with different concentrations of tartrazine(T=299 K)

c(Zein)=4.7×10-4g/mL ;c(Tartrazine)(a～g): 0，2.0×10-5，4.0×10-5，6.0×10-5，8.0×10-5，1.0×10-4，1.2×10-4mol/L。

圖3 檸檬黃與玉米醇溶蛋白的同步熒光光譜。 (a)Δλ=15 nm；(b)Δλ=60 nm。

Fig.3 Synchronous fluorescence spectrum of tartrazine-zeinsystem. (a) Δλ=15 nm. (b) Δλ=60 nm.

三維熒光光譜能夠同時完整地表達(dá)出熒光強(qiáng)度隨激發(fā)和發(fā)射波長變化的信息。從玉米醇溶蛋白加入檸檬黃前后變化的三維等高線圖譜(圖4)可以觀察到等高線特征譜中的2個峰Peak A和Peak B的熒光強(qiáng)度值隨著檸檬黃的加入明顯降低，在相同的條件下，峰A降低了49%，峰B降低了29%。Peak A是蛋白質(zhì)典型的熒光峰，Peak B主要體現(xiàn)了蛋白質(zhì)肽鏈的結(jié)構(gòu)特征。從表1的特征參數(shù)可知加入檸檬黃后，玉米醇溶蛋白Peak A斯托克斯位移發(fā)生紅移，Peak B 斯托克斯位移幾乎未變。

圖4 玉米醇溶蛋白與檸檬黃混合液三維熒光光譜等高線圖。(a)c(Zein)=1.1×10-4g/mL,c(Tartrazine)=0 mol/L； (b)c(Zein)=1.1×10-4g/mL，c(Tartrazine)=3.0×10-5mol/L。

Fig.4 Three-dimensional fluorescence contour diagram of tartrazine-zein. (a)c(Zein)=1.1×10-4g/mL,c(Tartrazine)=0 mol/L. (b)c(Zein)=1.1×10-4g/mL，c(Tartrazine)=3.0×10-5mol/L.

表1 三維熒光特征參數(shù)

3.2 檸檬黃對玉米醇溶蛋白紫外差示光譜分析

檸檬黃在紫外區(qū)有吸收，因而采用變化后與變化前的紫外吸收光譜差來考察檸檬黃對玉米蛋白構(gòu)象的影響，如圖5所示。在選擇的實(shí)驗(yàn)條件下，玉米醇溶蛋白在 278 nm有特征吸收峰，主要由玉米醇溶蛋白分子中酪氨酸和色氨酸殘基上芳雜環(huán)π-π*躍遷引起。隨著檸檬黃濃度的增加，玉米醇溶蛋白在278 nm處的吸收峰值逐漸降低，呈現(xiàn)減色效應(yīng)，最大吸收波長沒有變化。說明檸檬黃與玉米醇溶蛋白發(fā)生了作用，由于檸檬黃結(jié)構(gòu)中存在較大空間位阻，以及羧酸鈉鹽和磺酸鹽的存在，不影響共軛程度，卻改變了吸光系數(shù)。

c(Zein)=1.05×10-4g/mL ;c(Tartrazine) (a～e):5.1×10-6,1.0×10-5,2.0×10-5,3.0×10-5,0 mol/L

圖5 玉米醇溶蛋白與檸檬黃作用的紫外差譜

Fig.5 UV difference spectra of zein-tartrazine

3.3 傅立葉紅外光譜分析及自去卷積計(jì)算

圖6 玉米醇溶蛋白(a)及檸檬黃與玉米醇溶蛋白結(jié)合(b)的ATR-FTIR譜

Fig.6 ATR-FTIR spectra of zein(a) and tartrazine bound to zein(b)

紅外譜圖中的酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)是研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)最有價(jià)值的區(qū)域。這一區(qū)域多種譜峰重疊，形成一個寬的強(qiáng)吸收峰。將紅外譜圖進(jìn)行基線校準(zhǔn)，經(jīng)SavitskGolay函數(shù)做5點(diǎn)平滑處理。選取酰胺Ⅰ帶區(qū)域，用Peakfi V4軟件得到傅立葉自去卷積曲線，在二階導(dǎo)數(shù)譜圖基礎(chǔ)上用高斯曲線進(jìn)行多次擬合，使得殘差最小，得到完全可分辨的各子峰圖譜，結(jié)果如圖7所示。根據(jù)分開峰的位置，確定子峰的歸屬，每一種子峰對應(yīng)著蛋白質(zhì)中一種二級結(jié)構(gòu)，通過計(jì)算子峰的積分面積，求出各種二級結(jié)構(gòu)的相對百分含量[17-18]，面積百分比見表2。

圖7 酰胺Ⅰ帶傅里葉去卷積曲線與二階導(dǎo)數(shù)曲線的擬合。(a)玉米醇溶蛋白；(b)玉米醇溶蛋白-檸檬黃。

Fig.7 Fitting of Fourier I-band Fourier deconvolution curve with second derivative curve. (a) Zein. (b) Zein-Tartrazine.

表2 酰胺Ⅰ帶子峰的位置、相對面積和歸屬

從表2中的數(shù)據(jù)可知，玉米醇溶蛋白與檸檬黃結(jié)合后α螺旋結(jié)構(gòu)從13.7%增加為25.1%，增加了83.2%，β-折疊從46%減小為43.5%，降低了5.4%；無規(guī)卷曲消失，β-轉(zhuǎn)角從14.24%增加為31.4%，增加了121%。α螺旋結(jié)構(gòu)含量增加很多，說明分子間存在比較大的疏水作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)多肽鏈結(jié)構(gòu)收縮。檸檬黃與玉米蛋白結(jié)合紅外光譜中指紋區(qū)吸收強(qiáng)度明顯降低，也是α螺旋結(jié)構(gòu)顯著變化引起的。β-轉(zhuǎn)角的特定構(gòu)象一定程度上取決于與它組成的氨基酸，因?yàn)楦彼峋哂袚Q裝結(jié)構(gòu)和固定的角，它在一定程度上迫使β-轉(zhuǎn)角形成，而在玉米蛋白中脯氨酸的含量較大，使得檸檬黃與玉米蛋白結(jié)合β-轉(zhuǎn)角改變很大，無規(guī)則卷曲消失，推測是檸檬黃的加入對脯氨酸結(jié)構(gòu)的影響。通過核磁共振氫譜氫原子化學(xué)位移的變化，也可以觀察到這種現(xiàn)象。

3.4 核磁共振光譜分析

核磁共振氫譜可以提供原子水平上結(jié)構(gòu)信息的變化。圖8是檸檬黃與玉米醇溶蛋白結(jié)合前后的核磁共振譜圖。檸檬黃可以完全溶解于水，是極性的；微量的也可以溶于乙醇。當(dāng)以DMSO為溶劑時，檸檬黃和玉米醇溶蛋白都處于低極性環(huán)境，3個質(zhì)子峰從結(jié)合前的δ7.97，7.70，7.41到1 h后相應(yīng)地變?yōu)棣?.94、7.66，7.37，略微地向高磁場移動，說明檸檬黃與玉米醇溶蛋白功能區(qū)的芳香族氨基酸發(fā)生了π-π相互作用，作用程度比較弱，而且4 h后化學(xué)位移沒有變動。當(dāng)以重水為溶劑時，重水促進(jìn)微量玉米醇溶蛋白的溶解，在極性環(huán)境下，1 h后，3個質(zhì)子峰從與玉米醇溶蛋白結(jié)合前δ7.81,7.73,7.43相應(yīng)地變?yōu)棣?.04,7.82,7.63，化學(xué)位移有了明顯的低場位移，4 h后，化學(xué)位移未再變化。說明在以重水為溶劑的極性環(huán)境下，檸檬黃與玉米醇溶蛋白的芳香族氨基酸發(fā)生了強(qiáng)烈的π-π相互作用，向低場移動明顯。這種變化與溶劑的極性有關(guān)，與作用時間的長短無關(guān)。

圖8 檸檬黃與玉米醇溶蛋白結(jié)合前后的核磁共振氫譜。(a)檸檬黃，溶劑DMSO;(b)檸檬黃-玉米醇溶蛋白，溶劑DMSO;(c)檸檬黃,溶劑D2O;(d)檸檬黃-玉米醇溶蛋白，溶劑D2O。

Fig.8 Nuclear magnetic resonance (1H-NMR) spectra before and after the combination of tartrazine and zein. (a) Tartrazine, solvent DMSO. (b) Tartrazine-zein， solvent DMSO. (c) Tartrazine, solvent D2O. (d) Tartrazine-zein， solvent D2O.

3.5 檸檬黃與玉米蛋白相互作用力判斷

通過Stern-Volmer方程定量描述熒光猝滅作用的機(jī)制[19]，F(xiàn)0/F=1+KSV[Q]=1+kqτ0[Q],其中F0和F分別為無猝滅劑和有猝滅劑時玉米醇溶蛋白的熒光強(qiáng)度，[Q]為檸檬黃的濃度，KSV為動態(tài)猝滅常數(shù)，kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)，τ0是無猝滅劑時玉米蛋白的熒光壽命，數(shù)值為10-8s。根據(jù)Stern-Volmer方程，猝滅劑濃度對熒光強(qiáng)度比擬合應(yīng)得到直線方程，由于檸檬黃與玉米醇溶蛋白結(jié)合得到的曲線嚴(yán)重地向Y軸彎曲，產(chǎn)生熒光內(nèi)濾效應(yīng)，因此利用Fcorr=Fobs×e(Aex+Aem)/2對熒光強(qiáng)度進(jìn)行修正[20]。根據(jù)不同溫度下玉米醇溶蛋白熒光猝滅光譜，繪制F0/F-[Q]的關(guān)系圖，進(jìn)而求得猝滅常數(shù)KSV和速率常數(shù)kq，結(jié)果見表3。由表中的數(shù)據(jù)可知，檸檬黃與玉米醇溶蛋白結(jié)合的KSV隨溫度的升高先增大后減小，但kq均大于2.0×1010L·mol-1·s-1，熒光猝滅性質(zhì)復(fù)雜。

表3 在不同溫度下玉米醇溶蛋白與檸檬黃結(jié)合的線性方程與猝滅常數(shù)

檸檬黃與玉米醇溶蛋白的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可以通過lg[(F0-F)/F]=nlg[Q]+lgKa進(jìn)行計(jì)算。lg[(F0-F)/F]與lg[Q]呈線性關(guān)系，通過線性擬合得到斜率和截距，進(jìn)而可以求得在不同溫度下檸檬黃與玉米醇溶蛋白的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，結(jié)果見表4。從數(shù)據(jù)可以看到，檸檬黃與玉米醇溶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1.0，結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而增大，具有動態(tài)猝滅的特征，結(jié)合紅外光譜和核磁共振氫譜及Stern-Volmer方程計(jì)算結(jié)果，推斷檸檬黃與玉米醇溶蛋白的結(jié)合符合靜態(tài)與動態(tài)同時存在的混合猝滅機(jī)制[21]，機(jī)制的存在形式與溫度關(guān)系很大。在低溫時Ka值為103，比高溫104低一個數(shù)量級，說明檸檬黃與玉米醇溶蛋白的親和力在低溫時較弱。

表4 不同溫度下檸檬黃與玉米醇溶蛋白的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

檸檬黃與玉米醇溶蛋白的結(jié)合力可以通過Van’t Hoff 公式計(jì)算反應(yīng)的焓變ΔH和熵變ΔS，根據(jù)符號進(jìn)行作用力類型的判斷[22]。當(dāng)ΔH>0，ΔS>0時為疏水作用力；當(dāng)ΔH<0，ΔS<0為氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔH<0，ΔS>0時為靜電作用力。

lnK=-ΔH/RT+ ΔS/R，

(1)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK,

(2)

式中：R為氣體摩爾常數(shù)，K為結(jié)合常數(shù)，計(jì)算結(jié)果列入表5。從表5可知，檸檬黃與玉米醇溶蛋白在3個不同的溫度下，反應(yīng)的ΔG均小于0，表明檸檬黃與玉米醇溶蛋白之間的結(jié)合是自發(fā)反應(yīng)。ΔH>0，ΔS>0，說明檸檬黃與玉米蛋白之間主要是疏水作用力，與1H NMR觀察到的強(qiáng)烈的芳環(huán)間π-π相互作用吻合。

表5 檸檬黃與玉米醇溶蛋白結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

Tab.5 Thermodynamic parameters for the binding of tartrazine to zein

T/KΔH/(kJ·mol-1)ΔS/(J·mol-1·K-1)ΔG/(kJ·mol-1)28875.7331.9-19.9299331.9-23.6309331.9-26.9

4 結(jié) 論

通過熒光光譜、紫外光譜、紅外光譜及核磁共振氫譜對檸檬黃與玉米醇溶蛋白的結(jié)合特點(diǎn)進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，檸檬黃與玉米醇溶蛋白的結(jié)合比較復(fù)雜，雖然物質(zhì)間的結(jié)合是自發(fā)的，而且結(jié)合常數(shù)較大，但檸檬黃溶液本身是極性溶劑，在低極性的環(huán)境中，對玉米醇溶蛋白的構(gòu)象有一定程度的影響，α螺旋結(jié)構(gòu)的改變量很大，β轉(zhuǎn)角的改變也非常突出，是靜態(tài)與動態(tài)同時存在的混合猝滅機(jī)制，分子間主要以疏水作用力結(jié)合。當(dāng)玉米醇溶蛋白溶于重水處于極性環(huán)境中時，加入檸檬黃，核磁共振氫譜中質(zhì)子的化學(xué)位移改變很大，說明在極性環(huán)境下玉米醇溶蛋白疏水域暴露，與檸檬黃結(jié)合，其構(gòu)象變化。作為理想載體應(yīng)能夠通過特定的途徑將承載的外源物質(zhì)轉(zhuǎn)入既定目標(biāo)，而且要有良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性，在傳遞過程中維持物質(zhì)本性的存在，具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與承載物質(zhì)沒有明顯的非特異性吸附。因此，玉米醇溶蛋白不是檸檬黃理想的搭載體，對于檸檬黃的輸送與包埋都會產(chǎn)生不利影響。