周芳，南楠，2，陳西華，賀斌，尹德東，盧文紅，傅龍龍，2，張博男，2，郭士格，2，梁敏，2，王介東，徐祥波*

(1.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730)

經(jīng)典的月經(jīng)發(fā)生假說(shuō)認(rèn)為，在分泌晚期，前列腺素(PGs)能促使子宮內(nèi)膜螺旋小動(dòng)脈收縮，加速內(nèi)膜缺血、壞死及血管的破裂，進(jìn)而使子宮內(nèi)膜崩解脫落，導(dǎo)致月經(jīng)的發(fā)生[1-3]。Pickles[4]首次在經(jīng)血中檢測(cè)到了PGs的存在，最終認(rèn)為這些脂溶性物質(zhì)為前列腺素E2(PGE2)和前列腺素F2α(PGF2α)。然而，有研究者認(rèn)為它們是高等靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)化的“廢棄物”，對(duì)月經(jīng)發(fā)生不具有始動(dòng)作用[5]。小鼠月經(jīng)模型為月經(jīng)機(jī)制的研究提供了重要的技術(shù)平臺(tái)。本研究小組前期在小鼠月經(jīng)模型的研究中，孕酮撤退前，COX抑制劑吲哚美辛和COX-2抑制劑Dup697能夠顯著抑制子宮內(nèi)膜的出血和崩解[6]，而COX是PGs的限速合成酶，本研究小組前期研究為PGs在月經(jīng)發(fā)生中的主導(dǎo)作用提供了進(jìn)一步的證據(jù)[7-9]。

子宮中主要PGs之一PGE2的功能主要是和血管擴(kuò)張有關(guān)[10-11]。PGE2通過(guò)與其相應(yīng)的受體結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，其受體屬于G偶聯(lián)蛋白受體，這些受體包括前列腺素E1受體(PTGER1)、前列腺素E2受體(PTGER2)、前列腺素E3受體(PTGER3)和前列腺素E4受體(PTGER4)[12]。其中，PTGER2主要在子宮組織的腔上皮下細(xì)胞表達(dá)，有研究表明，在妊娠大鼠子宮組織中，PTGER2在著床位點(diǎn)的腔上皮細(xì)胞中的第1～4天沒(méi)有表達(dá)，從第5天開(kāi)始，其mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)均升高，隨后從第7天開(kāi)始表達(dá)下降[13]。在人的月經(jīng)周期中，早期分泌期的PTGER1是月經(jīng)期的12.2倍，中期分泌期的PTGER2是增殖期的15.1倍[12]。本研究利用小鼠月經(jīng)模型，探討了月經(jīng)發(fā)生子宮組織中PGE2含量及其受體PTGER2的表達(dá)變化，為揭示其在月經(jīng)發(fā)生中的功能提供線索。

資料和方法

一、研究對(duì)象

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8～10周齡C57BL6雌鼠(SPFⅡ級(jí))。實(shí)驗(yàn)經(jīng)國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠在可控的條件下給予充足的水和食物，光照8：00～20：00，溫度(20±1)℃。

二、研究方法

1.建立小鼠月經(jīng)模型：根據(jù)前期研究建立小鼠生理性孕酮撤退月經(jīng)樣模型[14]。蛻膜化49 h后，移去孕酮皮下埋置管時(shí)記為0 h。分別在0 h、8 h、12 h、16 h和24 h取材，液氮中迅速冷凍后，于-80℃長(zhǎng)期保存。

2.PGE2蛋白質(zhì)含量的ELISA檢測(cè)：取不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠子宮組織，稱重，加入PBS緩沖液，手持勻漿器(Cole-Parmer，美國(guó))將小鼠子宮組織勻漿。離心，取上清，采用ELISA試劑盒(Cayman，美國(guó))檢測(cè)勻漿組織中PGE2蛋白質(zhì)含量，分光光度讀數(shù)值(Thermal Fisher，美國(guó))。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)子宮組織勻漿中PGE2的相對(duì)含量。

3.Ptger2 mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：將-80℃保存的子宮組織標(biāo)本，用TRIzol(Invitrogen，美國(guó))提取總RNA，42℃孵育3～5 min，消除基因組DNA。將總RNA與隨機(jī)引物及Oligo(dT)充分混合，25℃孵育10 min，42℃孵育50 min。85℃水浴孵育5 min后，冰上冷卻，將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。將各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠子宮組織cDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(Abm，加拿大)檢測(cè)Ptger2 mRNA表達(dá)，以β-Actin作為內(nèi)參，利用ΔΔCt的方法統(tǒng)計(jì)分析mRNA的相對(duì)表達(dá)量。所用引物見(jiàn)表1。

4.PTGER2蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)：小鼠子宮組織用4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)制備石蠟切片(Leica，德國(guó))。將切片脫蠟并水化，用枸櫞酸緩沖液(pH6.0)95～98℃水浴孵育20 min進(jìn)行抗原修復(fù)。再加入3%H2O2室溫孵育10 min，用PTGER2抗體對(duì)子宮切片進(jìn)行免疫組化染色，孵育兔抗鼠PTGER2多克隆抗體(Abcam，美國(guó))，按照二抗試劑盒(北京中杉金橋)方法孵育羊抗兔多克隆抗體，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，在顯微鏡下觀察，待顯色合適時(shí)終止。PBS中浸泡清洗后，用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，中性樹(shù)膠封片。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

5.PTGER2蛋白Western blot檢測(cè)：用蛋白提取試劑盒(Thermo Fisher，美國(guó))提取小鼠子宮組織總蛋白，加入適量蛋白酶抑制劑Cocktail(Merck，美國(guó))；取20 μl蛋白溶液進(jìn)行SDC-PAGE凝膠電泳(Bio-Rad，美國(guó))，隨后轉(zhuǎn)移至0.25 μm PVDF膜(Merck，美國(guó))；分別進(jìn)行目標(biāo)蛋白PTGER2(Abcam，美國(guó))和β-Actin(北京康為世紀(jì)生物)的蛋白免疫印跡，最后用ECL發(fā)光試劑盒(北京全式金生物)檢測(cè)其表達(dá)情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel表對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩樣本之間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠月經(jīng)模型子宮組織中PGE2的含量

PGE2在子宮內(nèi)膜崩解脫落期即孕酮撤退0～24 h子宮組織中的含量變化顯示，PGE2在整個(gè)過(guò)程呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)(圖1)。在0 h和8 h PGE2含量較低，隨著時(shí)間的推移，在孕酮撤退12 h，逐漸增加(P<0.01)，而在孕酮撤退16 h，PGE2含量達(dá)到最大值(P<0.01)；在孕酮撤退24 h，略有下降，但仍顯著高于0 h(P<0.01)。在孕酮撤退12～24 h顯著高于0 h和8 h(P<0.01)；孕酮撤退12～16 h是子宮內(nèi)膜崩解脫落的關(guān)鍵期，此時(shí)PGE2含量顯著增加，提示PGE2對(duì)子宮內(nèi)膜的崩解脫落起重要作用。

相互比較，*P<0.01圖1 小鼠月經(jīng)模型孕酮撤退后0～24 h子宮組織PGE2蛋白表達(dá)

二、PGE2受體PTGER2蛋白在小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜崩解期的定位

PTGER2蛋白在孕酮撤退的0～24 h定位于整個(gè)蛻膜化區(qū)域，且未呈現(xiàn)區(qū)域性的變化。在孕酮撤退的0 h，PTGER2的陽(yáng)性信號(hào)較弱，主要定位于腔上皮下的基質(zhì)細(xì)胞區(qū)域和整個(gè)蛻膜化區(qū)域；在孕酮撤退的8 h，陽(yáng)性信號(hào)定位與0 h相似；在孕酮撤退的16 h，陽(yáng)性信號(hào)明顯增強(qiáng)，主要定位于蛻膜化整個(gè)區(qū)域的細(xì)胞漿中，顏色呈深棕色，雖然信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，但其定位并未呈現(xiàn)出區(qū)域性的特征；在孕酮撤退的24 h，陽(yáng)性信號(hào)較16 h有所減弱，主要定位于中間蛻膜化剝脫壞死的區(qū)域(圖2)。

三、Ptger2 mRNA與PTGER2蛋白在小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜崩解期的表達(dá)

在孕酮撤退后0 h，Ptger2 mRNA表達(dá)水平相對(duì)較低；隨后在孕酮撤退后8 h和16 h，雖然此時(shí)子宮內(nèi)膜崩解的程度進(jìn)一步加大，但是此時(shí)Ptger2 mRNA與0 h相比，無(wú)顯著變化(P>0.05)；在孕酮撤退后24 h，Ptger2 mRNA的表達(dá)較孕酮撤退后0～16 h顯著升高(P<0.01)(圖3)。

同時(shí)，對(duì)PGE2受體PTGER2在孕酮撤退0～24 h 的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)PTGER2蛋白質(zhì)在整個(gè)子宮內(nèi)膜崩解過(guò)程即孕酮撤退的0～24 h中的表達(dá)并沒(méi)有顯著變化(P>0.05)(圖4)。

A和a：孕酮撤退后0 h；B和b：孕酮撤退后8 h；C和c：孕酮撤退后16 h；D和d：孕酮撤退后24 h左排為低倍視野(×100)；右排為低倍視野中黑色方框區(qū)域的放大圖像(×400)；箭頭示典型陽(yáng)性著色圖2 小鼠月經(jīng)模型崩解期0～24 h的子宮組織PTGER2蛋白表達(dá)(免疫組化染色)

與其他各時(shí)間點(diǎn)比較,*P<0.01圖3 小鼠月經(jīng)模型孕酮撤退后0～24 h子宮組織Ptger2 mRNA表達(dá)

圖4 小鼠月經(jīng)模型孕酮撤退后0～24 h子宮組織PTGER2蛋白表達(dá)

討 論

本研究探索了PGE2及其受體PTGER2在小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜崩解期中的含量以及蛋白表達(dá)變化。本研究首先探討PGE2在子宮內(nèi)膜的崩解期即孕酮撤退的0～24 h各時(shí)間點(diǎn)的含量變化，發(fā)現(xiàn)在12～16 h時(shí)子宮內(nèi)膜的崩解期顯著增加，此時(shí)是子宮內(nèi)膜崩解關(guān)鍵期，提示PGE2對(duì)子宮內(nèi)膜的崩解可能起重要作用。PGE2的功能主要是和血管擴(kuò)張有關(guān)。有研究表明，月經(jīng)經(jīng)血中的PGE2水平是血清或腹膜液體中的2～3倍[15]。PGE2和PGF2α在月經(jīng)周期的分泌期增殖表達(dá)均升高，甚至貫穿表達(dá)于整個(gè)月經(jīng)周期[16-17]，我們的研究結(jié)果與其一致。

PTGER2作為一種刺激性G蛋白偶聯(lián)受體，PGE2誘導(dǎo)的PTGER2激活可激活腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)cAMP水平升高和蛋白激酶A的激活。PTGER2也可激活糖原合酶激酶3β和β-連環(huán)蛋白途徑[18]。PTGER2存在于牛的子宮內(nèi)膜中，其伴隨著內(nèi)膜中外植體生長(zhǎng)因子的表達(dá)和細(xì)胞增殖表達(dá)而增加，預(yù)測(cè)其與子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)密切相關(guān)[19]。有研究表明，在子宮內(nèi)膜異位癥婦女腹膜液中PGE2的含量較高，高濃度的PGE2對(duì)異位內(nèi)膜的生存和生長(zhǎng)中起著重要作用[20]。PGE2能夠促進(jìn)含有PTGER2的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa細(xì)胞系中HIF-1αmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。COX-2抑制劑可以明顯地減小子宮蛻膜區(qū)的大小，但PGE2可以恢復(fù)被COX抑制劑所抑制的子宮的蛻膜化過(guò)程。有研究者發(fā)現(xiàn)Ptger2-/-小鼠雖然可以正常著床，但著床的位點(diǎn)數(shù)量明顯減少。這可能由于Ptger2-/-小鼠中PGE2與其受體偶聯(lián)，通過(guò)Gs激活腺苷酸環(huán)化酶，彌補(bǔ)了由于PTGER2缺失引起的cAMP不足。

而本研究中，PTGER2在子宮內(nèi)膜崩解脫落期，mRNA的水平在除孕酮撤退的24 h之外，均無(wú)顯著性變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其蛋白水平在此過(guò)程中并無(wú)顯著性變化。同時(shí)免疫組化的結(jié)果顯示，PTGER2在子宮內(nèi)膜崩解剝脫的進(jìn)程中，在子宮中的分布并沒(méi)有顯著的區(qū)域性特征。PGE2的含量在崩解期特別是子宮內(nèi)膜崩解關(guān)鍵期顯著增加，然而其受體PTGER2無(wú)論在mRNA還是蛋白質(zhì)水平并無(wú)顯著變化，這提示PGE2對(duì)子宮內(nèi)膜崩解剝脫可能通過(guò)PGE2含量的增加來(lái)實(shí)現(xiàn)，而不是通過(guò)其受體PTGER2表達(dá)的增加來(lái)實(shí)現(xiàn)。

我們發(fā)現(xiàn)Ptger2 mRNA在孕酮撤退的24 h表達(dá)顯著升高，此時(shí)子宮內(nèi)膜完全脫落，新的腔上皮細(xì)胞已經(jīng)被覆完全，修復(fù)啟動(dòng)，提示這可能與崩解后的脫落有緊密關(guān)系，而此時(shí)的蛋白質(zhì)并未出現(xiàn)此種情況，考慮mRNA翻譯到蛋白質(zhì)具有一定的時(shí)間差。在本研究中并未對(duì)其后的24 h PTGER2蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步研究，以探討PGE2及其受體PTGER2對(duì)修復(fù)期子宮內(nèi)膜的修復(fù)作用。

子宮內(nèi)膜異常出血是影響女性生殖健康的重要因素。月經(jīng)從青春期后開(kāi)始出現(xiàn)，直到更年期結(jié)束，占據(jù)女性的一生中較長(zhǎng)時(shí)間。月經(jīng)期的身體健康，對(duì)女性生活質(zhì)量影響重大。臨床上關(guān)于月經(jīng)疾病的痛經(jīng)、閉經(jīng)和功能失調(diào)性子宮出血的發(fā)生機(jī)制并不明確。了解正常月經(jīng)發(fā)生的作用機(jī)制，才能在臨床中找到治療靶點(diǎn)。