9號(hào)染色體倒位攜帶對(duì)于胚胎染色體及妊娠結(jié)局的影響

陳歡，沈鑒東，謝佳孜，孫雪萍，崔毓桂，劉嘉茵，吳畏

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，南京 210029)

染色體結(jié)構(gòu)異常的基礎(chǔ)是染色體發(fā)生斷裂及斷裂后的異常重接。臨床上較常見的染色體結(jié)構(gòu)異常主要有：易位(相互易位，羅伯遜易位)、倒位、片段缺失(末端缺失、中間缺失)、片段插入、環(huán)狀染色體、雙著絲粒染色體、等臂染色體等。染色體倒位又細(xì)分為臂間倒位和臂內(nèi)倒位。臂內(nèi)倒位(paracentric inversion)某一染色體臂內(nèi)發(fā)生二次斷裂后，所形成的中間片段旋轉(zhuǎn)180°重接，即形成臂內(nèi)倒位。臂間倒位(pericentric inversion)一條染色的長(zhǎng)臂和短臂各發(fā)生一次斷裂后，形成的臂間倒位重接。世界上已報(bào)告的臂內(nèi)倒位已有23種，臂間倒位24種[1]。其中，9號(hào)染色體的臂間倒位[inv(9)]較為多見，在人群中發(fā)生率為1%～3%，在亞洲人群中發(fā)生率最低約0.25%[2-4]。從遺傳物質(zhì)的得失角度看，這種結(jié)構(gòu)變化沒(méi)有導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的丟失，因此具有倒位染色體的個(gè)體一般不具有臨床表型，被稱為攜帶者，被認(rèn)為是與異常表型無(wú)關(guān)的染色體微小重排[4-6]。inv(9)一般被認(rèn)為是染色體多態(tài)性，但研究發(fā)現(xiàn)inv(9)與不育、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局可能相關(guān)[2，7-17]或可能存在特發(fā)性生殖障礙[18]，inv(9)對(duì)妊娠結(jié)局的影響仍存在爭(zhēng)議。復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)是指與同一性伴侶連續(xù)遭受2次或2次以上在妊娠20周前的胎兒(體重≤500 g)丟失者，病因復(fù)雜，包括遺傳因素、解剖異常、內(nèi)分泌異常、感染因素、免疫紊亂和血栓前狀態(tài)等，仍有接近半數(shù)的患者原因不明，臨床上稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)。已知的因素中50%～60%的早期自然流產(chǎn)是由于胚胎染色體異常所致[19-21]。因此，RSA是胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(Preimplantation genetic test for aneuploidies，PGT-A)的指征。對(duì)于inv(9)特別是合并流產(chǎn)史患者，是否需要行PGT-A仍然是困惑的問(wèn)題[22]。本研究通過(guò)分析攜帶inv(9)的不孕癥患者PGT-A胚胎檢測(cè)及妊娠結(jié)局，為攜帶inv(9)的不孕癥患者是否需要行(PGT-A)以及何種類型需要行PGT-A提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2007年9月至2018年6月在本中心接受PGT-A治療的165對(duì)RSA夫婦的診療過(guò)程及妊娠結(jié)局。其中一方攜帶inv(9)的30對(duì)夫婦為A組；未攜帶inv(9)的135對(duì)夫婦為B組。所有這些患者均采用中心常規(guī)的PGT-A治療流程。

二、研究方法

1.控制性促排卵：所有患者采用合適的方案促排卵。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18 mm左右給予HCG注射，36 h后行陰道超聲介導(dǎo)下取卵術(shù)。根據(jù)患者情況選擇新鮮周期或復(fù)蘇周期移植。

2.受精、卵裂、胚胎移植情況：取卵術(shù)后第1日觀察卵子受精情況，雙原核(2PN)卵子作為正常受精卵。觀察至D3或D5、D6行卵裂期胚胎(卵裂球活檢)或囊胚期胚胎(滋養(yǎng)細(xì)胞活檢)活檢取樣。

3.胚胎檢測(cè)：使用熒光原位雜交(FISH)、微陣列-比較基因組雜交(aCGH)或二代測(cè)序技術(shù)(NGS)。選擇檢測(cè)為正常/平衡信號(hào)的胚胎移植。

4.妊娠結(jié)局隨訪：移植后2周測(cè)血清β-HCG；HCG陽(yáng)性者停經(jīng)50 d左右行陰道超聲檢查，觀察宮腔內(nèi)孕囊數(shù)目和胎心管搏動(dòng)以確定臨床妊娠，統(tǒng)計(jì)胚胎種植率和臨床妊娠率等；停經(jīng)70天再次超聲檢查確定胚胎發(fā)育情況；后期電話隨訪本周期妊娠結(jié)局，統(tǒng)計(jì)流產(chǎn)率和胎兒畸形率、性別、出生體重、妊娠孕周及有無(wú)先天畸形等情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者基本情況比較

共納入165例患者。其中inv(9)攜帶組(A組)30例，非inv(9)攜帶組(B組)135例。A組未移植與無(wú)可移植胚胎均為2例，B組未移植6例、無(wú)可移植胚胎25例。兩組患者中無(wú)可移植胚胎者原因?yàn)槁涯讣?xì)胞質(zhì)量差、未形成囊胚或胚胎檢測(cè)染色體異常。

A組與B組間女方體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)FSH、AMH水平相比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B組患者的既往流產(chǎn)次數(shù)及女方平均年齡顯著高于A組(P<0.05)(表1)。B組患者既往流產(chǎn)次數(shù)多于A組可能與其女方年齡大相關(guān)。

二、患者促排卵治療實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

兩組間獲卵數(shù)、受精率以及獲胚數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；B組獲卵數(shù)、平均移植胚胎數(shù)顯著低于A組，而胚胎種植率顯著高于A組(P<0.05)(表2)。A組患者獲卵數(shù)高于B組可能與B組患者年齡偏大有關(guān)。

表1 患者的基本情況(±s)

注：與A組比較，*P<0.05

表2 患者的促排卵治療實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[(±s)，%]

注：與A組比較，*P<0.05

三、患者妊娠結(jié)局比較

一次取卵周期中，A組移植人數(shù)為26人，總移植周期為34周期，每移植周期臨床妊娠率為58.8%，活產(chǎn)率為44.1%，每取卵周期累積妊娠率為76.9%，流產(chǎn)率為25.0%；B組移植人數(shù)為104人，總移植周期為125周期，每移植周期臨床妊娠率為61.6%，活產(chǎn)率為51.2%，每取卵累積妊娠率為74.0%，流產(chǎn)率為16.9%。A組與B組的妊娠率、活產(chǎn)率及流產(chǎn)率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

四、胚胎檢測(cè)結(jié)果比較

A組檢測(cè)胚胎數(shù)209枚，結(jié)果異常胚胎130枚，胚胎染色體異常率為62.2%。其中通過(guò)NGS或array CGH進(jìn)行胚胎檢測(cè)有75枚，染色體異常率為46.6%，但異常染色體均非9號(hào)染色體。

B組活檢胚胎數(shù)532枚，胚胎染色體異常率51.5%。

A組胚胎檢測(cè)染色體異常率顯著高于B組(P<0.05)(表4)。統(tǒng)計(jì)A、B組胚胎檢測(cè)結(jié)果，≥3條染色體異常較多見，A組有4枚而B組有63枚，多倍體異常A組有1枚而B組有2枚，單一胚胎染色體異常分布情況見圖1。A組1、2、7、13、15、16、18、21染色體異常率較高，但整體來(lái)看染色體異常分布無(wú)明顯集中，而B組8、15、16、21、22號(hào)染色體異常概率較高。

表3 患者一次取卵周期妊娠結(jié)局(%)

注：累計(jì)妊娠率為累計(jì)至2018年6月一次取卵周期累計(jì)妊娠數(shù)/移植夫婦數(shù)

表4 患者胚胎檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(%)

注：嵌合體胚胎屬于胚胎檢測(cè)異常；與A組比較，*P<0.05

圖1 兩組胚胎檢測(cè)結(jié)果分布統(tǒng)計(jì)

討 論

關(guān)于inv(9)是否影響生育一直未有定論，部分學(xué)者認(rèn)為從遺傳學(xué)的角度看，某種變異的人群發(fā)生率>1%，即為正常多態(tài)性，9號(hào)染色體臂間倒位在各版的ISCN中都被列為染色體的正常多態(tài)性改變，其攜帶者由于遺傳物質(zhì)未有明顯增減，故可能沒(méi)有表型效應(yīng)。但有一些學(xué)者認(rèn)為inv(9)與其他倒位一樣，雖然沒(méi)有遺傳物質(zhì)丟失，但由于基因的排列順序發(fā)生變化，倒位理論上可形成倒位圈，可能引起位置效應(yīng)，從而影響配子、胚胎全染色體組拷貝數(shù)變化，從而引起流產(chǎn)、不孕不育等臨床表現(xiàn)[2，7，13-15，23]。這些學(xué)者提出兩種機(jī)制，一種認(rèn)為倒位本身可能在減數(shù)分裂過(guò)程中妨礙配對(duì)的同源染色體；第二種機(jī)制就是染色體間存在的相互效應(yīng)，認(rèn)為inv(9)可以影響其他染色體配對(duì)，因?yàn)?號(hào)同源染色部分單體未配對(duì)而干擾其他的二價(jià)染色體配對(duì)分離[24-26]。

本研究中inv(9)攜帶者的胚胎檢測(cè)結(jié)果中并未見與inv(9)相關(guān)的染色體變異，可能會(huì)有專家認(rèn)為這一點(diǎn)本身就足以說(shuō)明9號(hào)染色體臂間倒位與不良妊娠結(jié)局沒(méi)有關(guān)聯(lián)，但是考慮胚胎染色體異常率較單純RSA患者高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(所有病例已經(jīng)針對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)檢查了目前可做的檢查，未見異?；蛘哂邢嚓P(guān)異常已做處理復(fù)查未見異常)。胚胎染色體異常一般與母親年齡相關(guān)，而B組女方平均年齡大于A組。綜上我們可以認(rèn)為inv(9)可能通過(guò)干擾其他染色體二價(jià)體形成分離導(dǎo)致胚胎染色體異常率增加趨勢(shì)，從而引起流產(chǎn)、胎兒畸形等臨床表現(xiàn)。關(guān)于這種染色體間相互作用目前有兩種假說(shuō)，一是認(rèn)為與兩條9號(hào)染色體間異染色質(zhì)長(zhǎng)度差異相關(guān)，且有實(shí)驗(yàn)研究證明倒位至少需涉及染色體總長(zhǎng)的30%才能產(chǎn)生重組染色體[25，27]，當(dāng)涉及染色體總長(zhǎng)的50%以上時(shí)，重組染色體風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，重組配子的頻率與倒置染色體的比例直接相關(guān)[28-29]。另一種則認(rèn)為與斷裂位點(diǎn)的位置相關(guān)，認(rèn)為若有一個(gè)斷裂點(diǎn)位于G顯帶暗區(qū)，由于缺少同源性會(huì)發(fā)生異型聯(lián)會(huì)[30]，或認(rèn)為染色體有重組熱點(diǎn)簇的存在，重組體的形成取決于特定區(qū)域中熱點(diǎn)的存在和數(shù)量以及重組頻率[31]。此外有的關(guān)于唐氏綜合征家族的研究揭示了父母任一方inv(9)與子代唐氏綜合征發(fā)生率的增加直接相關(guān)。分析倒位增加了染色體不分離的風(fēng)險(xiǎn)，與染色體間相互作用的假說(shuō)相一致。有研究認(rèn)為異染色質(zhì)特別是9號(hào)染色體，在減數(shù)分裂期間影響近端著絲粒染色體(13、14、15、21、22、Y)分離[14，27，32-34]。但依據(jù)我們的研究inv(9)攜帶者胚胎染色體異常率較高，但其無(wú)明顯分布特點(diǎn)，并未觀察到端著絲粒染色體異常檢出率增加。inv(9)的這種染色體間相互作用的機(jī)制尚不明確，需要分子水平上進(jìn)行更多的研究，以了解染色體斷裂點(diǎn)的重要性。且本研究樣本數(shù)少，有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。但由于這種染色體間相互效應(yīng)，推薦inv(9)攜帶且有多次流產(chǎn)史者可考慮PGT-A。

染色體臂內(nèi)倒位攜帶者，減數(shù)分裂過(guò)程通過(guò)倒位圈產(chǎn)生4種類型配子，1種正常，其中1種倒位攜帶，其余2種含有部分重復(fù)和缺失的無(wú)著絲粒片段或雙著絲粒染色體，使得半數(shù)配子的形成出現(xiàn)障礙，或出現(xiàn)半數(shù)畸形或無(wú)功能的配子，致使婚后多年不孕；同時(shí)，雙著絲粒染色體和無(wú)著絲粒片段在有絲分裂中為不穩(wěn)定性畸變，雙著絲粒在合體的早期分裂中形成染色體橋，即使能懷孕，其后代在很早期即死亡[35]。納入樣本中僅有1例臂內(nèi)倒位行PGT-A助孕，其胚胎檢測(cè)染色體異常率高，但本研究中臂內(nèi)倒位樣本量太少，有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，inv(9)可能有增加其他染色體異常率的趨勢(shì)，導(dǎo)致流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)增加。對(duì)于inv(9)攜帶同時(shí)伴有多次流產(chǎn)史、不良孕產(chǎn)史者可考慮PGT-A助孕；而無(wú)反復(fù)流產(chǎn)史或不良孕史等，僅inv(9)攜帶的不孕患者，常規(guī)IVF/ICSI助孕即可。