章曉樂，遲令侃，張瓊，王萍，齊聰*

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 1.婦科；2.輔助生殖科，上海 201203)

子宮內(nèi)膜損傷是宮腔手術(shù)或感染損傷子宮內(nèi)膜基底層，導(dǎo)致上皮、間質(zhì)細胞再生障礙，新生血管形成受損，子宮內(nèi)膜難以完成自我修復(fù)，嚴重者往往造成宮腔粘連(IUAs)[1-2]。Salzani等[3]報道人工流產(chǎn)術(shù)后子宮內(nèi)膜損傷發(fā)生率高達37.6%，而我國上海2014年的研究報道稱58.3%的IUAs患者有宮腔操作史[4]。中重度IUAs分解手術(shù)后再粘連率高達62.5%[4]。IUAs的發(fā)生與子宮內(nèi)膜干細胞數(shù)量減少甚至缺失、纖維細胞合成大量的細胞外基質(zhì)(ECM)有關(guān)。ECM中膠原蛋白如Ⅰ型膠原α1鏈(COLIA1)的異常累積，是IUAs形成的主要基礎(chǔ)[5]。ECM降解相關(guān)的因子有基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制物-1(TIMP-1)。目前診斷子宮內(nèi)膜損傷情況的金標準是宮腔鏡下子宮內(nèi)膜病理活檢，檢測內(nèi)膜組織中MMP-9、TIMP-1、COLIA1等指標表達，但內(nèi)膜活檢具有創(chuàng)傷性，患者依從性差，無法在臨床上普及使用，而通過非侵入性方法收集月經(jīng)血則簡單易行[6]。諸多研究已經(jīng)證實，月經(jīng)血中含有大量子宮內(nèi)膜細胞[6-7]，故推測取月經(jīng)血的離心沉淀物替代內(nèi)膜組織行以上指標檢測具有可行性。本文通過前瞻性研究對IUAs患者月經(jīng)血中COLIA1、MMP-9、TIMP-1表達水平的變化進行觀察，并嘗試探討其臨床意義。

一、資料與方法

1.研究對象及分組：選擇2017年3月至2018年6月在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院婦產(chǎn)科就診、經(jīng)宮腔鏡明確診斷的IUAs患者30例為IUAs組。IUAs的診斷參考2015年《宮腔粘連臨床診療中國專家共識》，粘連性質(zhì)分為膜性粘連、纖維性粘連和肌性粘連；根據(jù)分級評分標準9～18分為中度粘連，19～28分為重度粘連。選擇同期無性生活、于我院體檢的志愿者女性30例作為對照組。兩組入組標準：(1)既往月經(jīng)規(guī)律；(2)經(jīng)陰道或腹部B超監(jiān)測：無IUAs以外的明顯器質(zhì)性病變；(3)性激素檢測正常范圍；(4)育齡期婦女(23～35歲)，非高危人工流產(chǎn)患者；(5)近2個月未接受任何生殖激素類藥物。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均已簽署知情同意書。

2.標本采集：囑兩組女性月經(jīng)第2天來院取材，有性生活者留取月經(jīng)血3 ml(于后穹隆內(nèi)5 ml針筒去針抽取)，無性生活者清洗外陰后，針筒去針抽取自然排出陰道、留置于彎盤內(nèi)的不含血塊的經(jīng)血3 ml，均放置于抗凝管內(nèi)保存。加入適量溶血劑，顛倒混勻，4℃ 10 00 rpm離心5 min后，棄上清液，取沉淀組織。采用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測MMP-9、TIMP-1、COLIA1 mRNA的表達水平，按照Trizol試劑盒(購自美國賽默飛公司)說明書，提取兩組對象的總RNA，檢索GenBank數(shù)據(jù)庫目的序列，采用Primer 5.0引物設(shè)計與分析軟件設(shè)計引物(表1)，各標本取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并于20 μl反應(yīng)體系(cDNA2.0 μl，上下游引物各0.3 μl，2×SYBR Green 10 μl，去離子水補足至20 μl)中進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)在美國ABI Quantstudio5熒光定量PCR儀上進行，結(jié)果以MMP-9/β-actin、TIMP-1/β-actin、COLIA1/β-actin值表示。

表1 qRT-PCR引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長度

二、結(jié)果

1.兩組對象基本資料比較：IUAs組患者中中度粘連16例，重度粘連14例；患者年齡24～33歲，平均(28.72±4.77)歲，平均體重指數(shù)(BMI)(21.94±2.45)kg/m2，月經(jīng)周期平均(30.17±3.68)d。對照組年齡23～32歲，平均(27.57±4.15)歲，平均BMI(21.67±2.67)kg/m2，平均月經(jīng)周期(29.93±2.47)d。兩組年齡、BMI、月經(jīng)周期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性(表2)。

2.兩組對象月經(jīng)血中MMP-9、TIMP-1、COLIA1 mRNA表達水平比較：使用qRT-PCR檢測MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表達水平發(fā)現(xiàn)，IUAs組的MMP-9相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)；TIMP-1的相對表達量兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)；IUAs組MMP-9/TIMP-1的相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)(表3)。

表2 兩組對象基本資料比較(±s)

表3 兩組對象月經(jīng)血中MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表達水平比較(±s)

注：與正常組比較，*P<0.05

3.月經(jīng)血中MMP-9/TIMP-1、COLIA1表達與IUAs粘連特征的關(guān)系：在中度及重度IUAs患者月經(jīng)血中，MMP-9/TIMP-1的相對量分別為(4.59±1.93)、(2.34±1.89)，二者比較有顯著性差異(P=0.024)。在膜性、纖維性及肌性粘連中MMP-9/TIMP-1的相對表達量分別為(5.11±1.76)、(3.01±1.57)、(2.27±1.39)，組間比較有顯著性差異(P=0.046)；纖維性粘連與肌性粘連組間比較無顯著性差異(P>0.05)。膜性、纖維性及肌性粘連中COLIA1的相對表達量分別為(3.44±1.72)、(4.32±1.73)、(6.25±1.34)，組間比較有顯著性差異(P=0.041)；膜性粘連與纖維性粘連組間比較無顯著性差異(P>0.05)(表4)。提示MMP-9/TIMP-1、COLIA1的表達可能與IUAs的嚴重程度及粘連性質(zhì)有關(guān)。

表4 不同程度、性質(zhì)粘連患者月經(jīng)血中MMP-9/TIMP-1、COLIA1表達水平比較(±s)

注：與重度粘連比較，*P<0.05；與纖維性、肌性粘連比較，aP<0.05；與膜性、纖維性粘連比較，bP<0.05

三、討論

月經(jīng)期子宮內(nèi)膜中的功能層從基底層崩解脫離，內(nèi)膜與血液混合排出[8]。經(jīng)血包含月經(jīng)血液，還含有部分子宮內(nèi)膜[9]。育齡期女性在月經(jīng)期子宮內(nèi)膜調(diào)亡剝脫，但在隨后的月經(jīng)周期中內(nèi)膜能自我完成無疤痕修復(fù)。子宮內(nèi)膜的再生能力暗示子宮內(nèi)膜可能存在干細胞，其在內(nèi)膜增殖的動態(tài)平衡和再生中起關(guān)鍵作用[10]。故月經(jīng)血可以成為當今液體活檢標本的來源及子宮內(nèi)膜干細胞庫。

本研究將月經(jīng)血作為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)，月經(jīng)血離心沉淀的組織物中，COLIA1隨著IUAs程度加重表達增加。大量研究證實：子宮內(nèi)膜受損后導(dǎo)致纖維化因子大量產(chǎn)生，刺激成纖維細胞合成大量的ECM，ECM合成和降解紊亂，導(dǎo)致ECM過度沉積，纖維粘連形成[5]，尤其是ECM中膠原的異常累積，含量迅速增加，成為纖維化的主要間質(zhì)，是IUAs形成的主要基礎(chǔ)。同時在組織標本的研究中發(fā)現(xiàn)，IUAs嚴重的患者，ECM中COLIA1的異常累積也較多[11]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，較正常女性，IUAs患者月經(jīng)血中COLIA1的表達增加，并隨IUAs程度的加重表達顯著。

眾多研究證實MMP-9、TIMP-1主要調(diào)節(jié)ECM成分的沉積和降解，并且廣泛分布于子宮內(nèi)膜，與子宮內(nèi)膜周期性增生和剝脫相一致，參與月經(jīng)發(fā)生、內(nèi)膜重塑、內(nèi)膜血管修復(fù)等[12-13]。其中MMP-9屬于明膠酶，能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原、彈性蛋白、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等，還可促進血管基底膜的降解。TIMPs是MMPs活性的天然抑制因子[14]。TIMP的過度表達抑制了MMPs的活性，使ECM降解減少，ECM的合成與降解失衡，致使ECM在子宮內(nèi)膜組織中聚集，抑制正常子宮內(nèi)膜組織生長，子宮內(nèi)膜組織逐漸被纖維結(jié)締組織所取代，導(dǎo)致IUAs形成[15]。我們研究發(fā)現(xiàn)IUAs組月經(jīng)血中的MMP-9顯著低于正常組，與成九梅等[16]、尚雪等[17]對子宮內(nèi)膜標本的研究結(jié)果一致。MMPs/TIMPs的平衡是維持ECM內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和完整的決定因素[18]。本研究發(fā)現(xiàn)IUAs組的MMP-9相對表達量和MMP-9/TIMP-1比值顯著低于正常組，并且MMP-9/TIMP-1比值隨著IUAs程度加重而減少。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)IUAs患者月經(jīng)血中存在與ECM降解相關(guān)因子的表達，提示臨床上或許可以選用月經(jīng)血對IUAs程度進行無創(chuàng)評估。但因為研究納入樣本量較少，結(jié)果可能存在一定偏倚，后續(xù)需進一步擴大樣本量加以分析討論，以期為通過月經(jīng)血判斷IUAs程度及IUAs治療效果評估等提供實驗依據(jù)。