彭小雨， 曾偉主， 周景文， 徐國強*

(1.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122; 2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室， 江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

α-酮戊二酸作為重要的二元羧酸，參與微生物體內(nèi)的三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝，在碳氮平衡的中間代謝過程中起著至關(guān)重要的作用[1]。丙酮酸又稱2-氧代丙酸、α-酮基丙酸、乙酰甲酸，是最重要的氧代羧酸之一[2]。丙酮酸參與細(xì)胞體內(nèi)的能量代謝，并在其中扮演著至關(guān)重要的角色[3]。此外，丙酮酸主要是作為多種藥物合成的前體物質(zhì)，如L-酪氨酸、L-色氨酸、丙氨酸以及L-多巴[2]。同時，α-酮戊二酸和丙酮酸的市場價高達12 000～15 000 美元/kg，在食品、制藥、精細(xì)化學(xué)以及動物飼料等行業(yè)均具有廣泛的應(yīng)用[4-5]。目前，α-酮戊二酸和丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)主要以化學(xué)合成法為主。由于高昂的生產(chǎn)成本以及環(huán)境污染嚴(yán)重等不可避免的缺點限制了酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)，也決定了化學(xué)合成法必將被一些新興生物技術(shù)方法所取代[6]。酶法因具有生產(chǎn)成本低、環(huán)保等優(yōu)點受到學(xué)者的關(guān)注，但是轉(zhuǎn)化率低是該方法的致命缺點[4,7]。而微生物發(fā)酵法不僅對環(huán)境污染小，還具有環(huán)保性和較高的轉(zhuǎn)化率。因此，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酮酸是非常具有競爭力的生產(chǎn)方法。本實驗室在前期工作中篩選出1株過量積累α-酮戊二酸的硫胺素營養(yǎng)缺陷型菌株YarrowialipolyticaWSH-Z06[8]。但在用菌株YarrowialipolyticaWSH-Z06生產(chǎn)α-酮戊二酸的過程中總是伴隨著副產(chǎn)物丙酮酸的積累。研究者們采用了多種策略(如發(fā)酵優(yōu)化、代謝改造)來減少丙酮酸的積累。首先，分別對pH和補料進行調(diào)控，從而優(yōu)化發(fā)酵條件來降低丙酮酸的產(chǎn)量[9-11]。雖然取得了較好的效果，但還存在一定的缺陷。通過改造酵母的代謝途徑來降低丙酮酸的產(chǎn)量引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。Zhou等[12]嘗試通過代謝工程改造的方式來降低丙酮酸的產(chǎn)量，即調(diào)節(jié)乙酰輔酶A的代謝途徑，丙酮酸的產(chǎn)量減少到20.2 g/L。同年，Yin等[13]又通過調(diào)節(jié)Y.lipolyticaWSH-Z06細(xì)胞內(nèi)丙酮酸羧化途徑來控制丙酮酸的代謝，最后丙酮酸的產(chǎn)量從35.2 g/L降到了13.5 g/L。但是卻不能完全將副產(chǎn)物丙酮酸消除。α-酮戊二酸和丙酮酸聯(lián)產(chǎn)作為一種新思路被本研究室前期工作者提出[14]。α-酮戊二酸和丙酮酸的市場價格比較接近以及具有廣泛的應(yīng)用價值，使α-酮戊二酸和丙酮酸聯(lián)產(chǎn)更具經(jīng)濟性。此外，隨著現(xiàn)代分離技術(shù)的快速發(fā)展，對于有機酸分離的報道也很多[15-17]。尤其是反應(yīng)萃取法在分離丙酮酸方面越來越受關(guān)注，并取得了較好的結(jié)果[18-19]。這也為α-酮戊二酸和丙酮酸的聯(lián)產(chǎn)提供了可行性依據(jù)。本研究預(yù)通過優(yōu)化發(fā)酵條件達到α-酮戊二酸和丙酮酸聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)量最大化，為后續(xù)的分離提取做準(zhǔn)備，也為實現(xiàn)α-酮戊二酸和丙酮酸工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株YarrowialipolyticaWSH-Z06 C3(保藏編號為CCTCCNO：M20714)，為硫胺素缺陷型菌株，由本研究室前期的工作中誘變選育[8]。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 種子培養(yǎng)基：葡萄糖 20，大豆蛋白 10，磷酸氫二鉀 1.0，硫酸鎂 0.5。固體培養(yǎng)基中加入20瓊脂。115 ℃滅菌15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：粗甘油100，乙酸鈉 6，硫酸銨 3，磷酸二氫鉀 3， 硫酸鎂 1.2，氯化鈉 0.5，磷酸氫二鉀 0.1，硫胺素6×10-7(過濾除菌)，115 ℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備 ZYZQ-VAF型恒溫培養(yǎng)箱，上海醫(yī)療器械研究所；HH-B11·420BS型電熱恒溫?fù)u床，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；Eppendorf 5418高速離心機，德國Eppendorf 公司；UV-2450型紫外-可見光分光光度計，日本Shimadzu公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司；T&J-Dtype 15 L發(fā)酵罐，上海迪必爾生物技術(shù)有限公司；G154DWS型高壓滅菌鍋，無錫醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 ①菌種活化：從-80 ℃保存的甘油管里蘸取一定量的菌，在平板上劃線培養(yǎng)大約48 h之后，挑取單菌落于500 mL液體培養(yǎng)基中，其中裝液量為50 mL，培養(yǎng)時間17～18 h，培養(yǎng)溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min；②一級種子培養(yǎng)：取100 μL液體活化好的菌種，用接種環(huán)將其劃線于茄型瓶中，培養(yǎng)時間24 h，培養(yǎng)溫度28 ℃；③二級種子培養(yǎng)(搖瓶)：將茄瓶活化好的菌種挑取1環(huán)左右接種于500 mL種子培養(yǎng)基中，其中裝液量50 mL，培養(yǎng)時間17～18 h，培養(yǎng)溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min；④搖瓶培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的二級種子液接種于滅好菌的搖瓶里，接種量為10% (體積比)，培養(yǎng)溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min；⑤二級種子培養(yǎng)(發(fā)酵罐)：將茄瓶活化好的菌種挑取4環(huán)左右接種于2 L種子培養(yǎng)基中，其中裝液量200 mL，培養(yǎng)時間17～18 h，培養(yǎng)溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min；⑥發(fā)酵罐培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的二級種子培養(yǎng)液接種于滅好菌的發(fā)酵罐中，其中裝液量70%，培養(yǎng)溫度28 ℃，罐壓0.035 MPa，接種量10% (體積比)。轉(zhuǎn)速和通氣量根據(jù)罐的大小做適當(dāng)調(diào)整。

1.2.2 細(xì)胞干重的測定 細(xì)胞干重(DCW)的測定根據(jù)參考文獻[8]：測定在570 nm處菌液的OD值，根據(jù)預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)線換算(OD570∶DCW (g/L) = 0∶0.223)。

1.2.3 α-酮戊二酸、丙酮酸以及甘油的測定 取800 μL發(fā)酵液于14 000 r/min下離心3 min，將上清液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，然后經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，進行高效液相色譜分析。

1.2.4 色譜分析條件 根據(jù)參考文獻[8]色譜條件為流動相 5 mmol/L H2SO4，流速 0.6 mL/min，柱溫 40 ℃，注射量 10 μL，檢測器、紫外吸收檢測器和示差折光檢測器，波長 210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶水平上發(fā)酵條件的確定

2.1.1 氮源濃度對酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響 種子液的活力對于發(fā)酵產(chǎn)酸效果有很大的影響，當(dāng)種子液的活力很強時，不僅有利于菌體的快速生長，而且還能維持較強的產(chǎn)酸能力。而在整個種子液活化過程中，氮源作為種子液培養(yǎng)基中的重要組成部分，主要用于微生物的生長和含氮代謝物的合成[20]。本研究主要以大豆蛋白粉為氮源，考察了8種不同的氮源濃度對于酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響。根據(jù)酮酸在發(fā)酵過程中的積累情況來確定種子培養(yǎng)基的最佳氮源濃度。由圖1可知，丙酮酸隨著種子液中氮源濃度的增加而降低，而菌體干重的變化趨勢和丙酮酸的變化趨勢相反?？赡艿脑蚴?，在較低的氮源濃度下，菌體生長緩慢，進而導(dǎo)致發(fā)酵液中的溶氧升高，而高溶氧又有利于丙酮酸的積累。當(dāng)?shù)礉舛葹? g/L時，α-酮戊二酸產(chǎn)量達到最高，為14.9 g/L。但是當(dāng)?shù)礉舛葹? g/L時，酮酸總產(chǎn)量最高。所以從酮酸的總產(chǎn)量來說，當(dāng)?shù)礉舛葹? g/L時，有利于酮酸的積累。

圖1 種子液中不同氮源濃度對發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of various nitrogen concentration in the seed culture on fermentation

2.1.2 接種密度對酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響 接種量的大小對產(chǎn)物的形成有一定的影響。接種量過低，會延長發(fā)酵周期；接種量過大，菌體快速生長，容易導(dǎo)致溶解氧不足而降低產(chǎn)物的積累。基于此，本研究主要在搖瓶水平上考察了2組不同的初始OD值(5、15)對酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響，分別考察每組接種體積的不同百分比對酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響。由圖2A可知，當(dāng)初始接種量OD值為5，接種量在1%～6%(體積分?jǐn)?shù))之間時，酮酸的總產(chǎn)量沒有顯著變化，平均在27.6 g/L，α-酮戊二酸和丙酮酸分別為16.2、11.4 g/L；當(dāng)接種體積大于6%時，α-酮戊二酸和丙酮酸的產(chǎn)量較之前都有所提高，尤其當(dāng)接種體積為12%時，酮酸總產(chǎn)量高達39.9 g/L，α-酮戊二酸和丙酮酸的產(chǎn)量分別為19.2、20.7 g/L，比之前1%～6%(體積分?jǐn)?shù))提高了18.5% (16.2 g/L)、81.6% (11.4 g/L)。

由圖2B可知，當(dāng)初始接種量OD值為15，接種量為6%(體積分?jǐn)?shù))時，酮酸總產(chǎn)量達到最大，為23.9 g/L。但是從初始接種量OD值的角度來比較，可以很明顯地觀察到，當(dāng)初始接種量OD值為5時的酮酸的總產(chǎn)量普遍高于初始接種量OD值為15時的酮酸總產(chǎn)量?？赡艿脑蚴?，初始接種量過高會導(dǎo)致菌體消耗甘油快速生長，而不利于有機酸的積累；當(dāng)菌體量過低，甘油利用率降低，也會延長整個發(fā)酵周期。綜合考慮，最佳接種條件為初始OD值5，接種量12%(體積分?jǐn)?shù))。

圖2 接種量對發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)酮酸的影響Fig.2 Effects of inoculation concentration on fermentationA：初始OD值為5；B：初始OD值為15A： InitialODvalue was 5; B： InitialODvalue was 15

2.2 發(fā)酵罐水平上硫胺素濃度對酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響

實驗菌株YarrowialipolyticaWSH-Z06 C3為硫胺素營養(yǎng)缺陷型菌株。硫胺素是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的輔因子。此外，在酵母代謝途徑中，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的協(xié)同作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A和二氧化碳，而α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體又是調(diào)控三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵點。所以說在酵母聯(lián)產(chǎn)酮酸的發(fā)酵過程中，硫胺素是一個至關(guān)重要的因素。本研究在15 L發(fā)酵罐水平上考察了4種不同濃度的外源硫胺素對于酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響。

由圖3可知，在4種不同硫胺素濃度條件下，當(dāng)硫胺素濃度為0.2 μg/L時，α-酮戊二酸和丙酮酸的總產(chǎn)量最高，為78.2 g/L，比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了57.9%。但是丙酮酸的產(chǎn)量因硫胺素濃度變化差異比較顯著。隨著硫胺素濃度的下降，丙酮酸產(chǎn)量反而升高；推測可能是硫胺素濃度影響了丙酮酸脫氫酶復(fù)合體系的酶活。硫胺素作為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體系的輔因子形式存在，隨著初始硫胺素濃度的降低，丙酮酸脫氫酶復(fù)合體系的酶活降低，抑制了丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A和CO2，從而導(dǎo)致流入三羧酸循環(huán)途徑的碳代謝流減少。而對于α-酮戊二酸的產(chǎn)量變化不大，主要包括兩方面原因。一方面流入三羧酸循環(huán)的碳通量減少，進而導(dǎo)致α-酮戊二酸的產(chǎn)量減少。其次，硫胺素的缺乏抑制了α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體系的酶活，減少了α-酮戊二酸的分解代謝。這和早期本實驗室在搖瓶水平上做的硫胺素濃度的優(yōu)化結(jié)果基本上趨于一致[8]，隨著硫胺素濃度的增加，菌體干重增加，丙酮酸產(chǎn)量降低。當(dāng)硫胺素濃度在一定范圍區(qū)間，α-酮戊二酸的產(chǎn)量不會受到很大的影響。這也說明找到一個合適的硫胺素濃度對于酮酸聯(lián)產(chǎn)具有很重要的意義。

2.3 發(fā)酵罐水平上溶氧對酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響

2.3.1 不同溶氧水平對酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響 氧是影響微生物生理和代謝的重要環(huán)境因子，尤其在微生物發(fā)酵過程中，溶氧會影響發(fā)酵的穩(wěn)定性[21]。再加上實驗菌株YarrowialipolyticaWSH-Z06 C3屬于好氧菌株，溶氧水平的變化會影響菌體的生長、代謝途徑以及產(chǎn)物積累情況。所以本研究在15 L發(fā)酵罐水平上考察了4種不同溶氧水平(10%、30%、50%、75%)對YarrowialipolyticaWSH-Z06 C3聯(lián)產(chǎn)酮酸的影響。結(jié)果如圖4所示，隨著溶氧水平的提高，菌體快速生長，加快了甘油的消耗，能夠有效地縮短發(fā)酵時間。溶氧水平在10%～50%之間，發(fā)酵前120 h時，α-酮戊二酸產(chǎn)量隨著溶氧水平的提高而提高。但是在發(fā)酵后期，較低的溶氧有利于α-酮戊二酸的快速積累。研究表明，在低溶氧條件下，流入三羧酸循環(huán)的代謝通量減少；在高溶氧條件下，流入三羧酸循環(huán)的代謝通量增加[22]。α-酮戊二酸屬于三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，進而生成較多的α-酮戊二酸。所以α-酮戊二酸產(chǎn)量在30%～50%溶氧水平下高于在10%溶氧水平下。而30%溶氧水平高于50%溶氧水平，推測可能是在30%的溶氧水平下糖酵解途徑生成丙酮酸與三羧酸循環(huán)達到碳平衡。在75%高溶氧水平下，α-酮戊二酸和丙酮酸產(chǎn)量反而下降。推測在高溶氧條件下，細(xì)胞呼吸加快，產(chǎn)生過量的ATP；而過量的ATP又會抑制糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，進而導(dǎo)致丙酮酸生產(chǎn)速率下降[23]。細(xì)胞溶氧水平在10%～50%之間時，隨著溶氧水平的提高，丙酮酸產(chǎn)量增加?？赡艿脑蚴?，在溶氧較充足條件下，NADH通過呼吸鏈氧化，糖酵解速率更快，從而導(dǎo)致丙酮酸產(chǎn)率提高[24]。

圖3 不同硫胺素濃度中甘油消耗、α-酮戊二酸、丙酮酸、菌體濃度的變化情況Fig.3 Time courses of glycerol,α-ketoglutaric acid,pyruvic acid and dry cell weight under different thiamine concentrations

圖4 不同溶氧水平中甘油消耗、α-酮戊二酸、丙酮酸、菌體濃度的變化情況Fig.4 Time courses of glycerol,α-ketoglutaric acid,pyruvic acid and dry cell weight in different dissolved oxygen level

2.3.2 階段溶氧調(diào)控策略對酮酸聯(lián)產(chǎn)的發(fā)酵情況 根據(jù)2.3.1的結(jié)果可知，較高的溶氧水平有利于菌體的生長和甘油的消耗，相對較低的溶氧水平不僅有利于酮酸的積累，而且可以減少無效的ATP消耗。因此為了使菌株的生長情況和產(chǎn)酸能力達到最佳，對溶氧水平進行了階段調(diào)控策略。在發(fā)酵前期溶氧水平設(shè)定為50%，當(dāng)菌體干重達到8 g/L時，溶氧水平控制為30%，直到發(fā)酵結(jié)束。結(jié)果如圖5所示，采用兩段溶氧調(diào)控策略以后，即能保持較高的轉(zhuǎn)化率(0.65 g/g)和生產(chǎn)強度(0.54 g/(L·h))，在120 h酮酸總產(chǎn)量高達64.7 g/L，相比于30%和50%的溶氧水平酮酸總產(chǎn)量分別提高了74.9%和21.2%。采用兩階段溶氧調(diào)控可以實現(xiàn)酮酸聯(lián)產(chǎn)的高生產(chǎn)量、高產(chǎn)率和高生產(chǎn)強度的相對統(tǒng)一。

圖5 15 L發(fā)酵罐階段調(diào)控對酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響Fig.5 Effect of two-stage control on the co-production of keto acids in 15 L fermentor

3 討 論

本研究探索了不同條件對酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響，發(fā)現(xiàn)硫胺素濃度以及溶氧水平對于酮酸聯(lián)產(chǎn)具有很大的影響。當(dāng)硫胺素的濃度為0.2 μg/L時，酮酸總產(chǎn)量高達78.2 g/L，對比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了57.9%。解脂亞洛酵母屬于硫胺素營養(yǎng)缺陷型菌株。低濃度硫胺素有利于酮酸的聯(lián)產(chǎn)，但是菌體密度降低，進而甘油消耗減慢，發(fā)酵周期延長。這也是采用低濃度硫胺素聯(lián)產(chǎn)酮酸的不足。在保證酮酸產(chǎn)量的同時，通過適當(dāng)提高硫胺素的濃度來縮短發(fā)酵周期。此外，通過對比不同溶氧水平酮酸聯(lián)產(chǎn)的情況發(fā)現(xiàn)，較高溶氧有利于菌體快速生長，發(fā)酵周期也大大縮短，但是不利于酮酸的積累。低溶氧水平不僅不利于酮酸的積累，也大大延長了發(fā)酵周期。根據(jù)所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在菌體生長階段，溶氧水平調(diào)控在50%左右；在代謝積累產(chǎn)物階段，溶氧水平控制在30%左右，有利于提高酮酸的總產(chǎn)量。同時也會大大縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)效率，也將為酮酸聯(lián)產(chǎn)實現(xiàn)工業(yè)化提供參考。