張相鋒, 楊曉絨, 焦子偉

(伊犁師范學(xué)院 微生物資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 伊寧 835000)

羊肚菌隸屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizales),羊肚菌科(Morchellaceae)，羊肚菌屬 (Morchella)[1-2]。羊肚菌具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和較強(qiáng)的保健功能，具有增強(qiáng)肌體免疫力、抗疲勞、抗衰老、護(hù)胃、降血壓和降血脂等作用,是一種珍貴、稀有的食藥用真菌[3]。野生羊肚菌數(shù)量有限，過(guò)度采摘必然會(huì)導(dǎo)致數(shù)量急劇下降，為滿足市場(chǎng)需求，人工栽培成為有效的解決途徑。但在國(guó)內(nèi)外羊肚菌人工栽培技術(shù)探索過(guò)程中，由于子實(shí)體發(fā)生受溫度、濕度、土壤營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境因素的限制，其產(chǎn)量和品質(zhì)的穩(wěn)定性問(wèn)題一直是無(wú)法攻克的難題[4]。 羊肚菌國(guó)內(nèi)外人工栽培技術(shù)研究中都有一個(gè)共同的技術(shù)要點(diǎn)就是覆蓋羊肚菌野外發(fā)生的土壤，否則不出菇。由此可見(jiàn)，羊肚菌的栽培不僅要求覆土，而且要求覆土中含有特定刺激其結(jié)實(shí)機(jī)制的有益因子[5]。土壤中除了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育起主要影響的就是豐富的微生物。土壤微生物群落在維持營(yíng)養(yǎng)方面起著至關(guān)重要的作用，土壤微生物多樣性直接影響土壤酶活性進(jìn)而影響土壤養(yǎng)分的代謝，決定土壤肥力[6-7]。國(guó)內(nèi)羊肚菌專家朱斗錫于2001年最早提出人工栽培中的土壤伴生菌，他指出土壤伴生菌對(duì)羊肚菌人工栽培子實(shí)體起著非常重要的作用[8]。謝占玲等[9]于2008年采用平板培養(yǎng)法，對(duì)野生羊肚菌根際微生物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)克勒克酵母屬是極為重要的微生物成員之一，并首次發(fā)現(xiàn)，毛霉是羊肚菌的伴生菌，該發(fā)現(xiàn)對(duì)羊肚菌子實(shí)體栽培有著極為重要的指導(dǎo)意義。土壤微生物多樣性研究的方法很多，如變性梯度凝膠電泳(DGGE)[10]、末端限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)[11]、磷脂脂肪酸法(PLFA )[12]、高通量測(cè)序(High-throughput sequencing)[13]、BIOLOG微平板技術(shù)[14]等。基于分子生物學(xué)的方法簡(jiǎn)便快捷，信息量大，無(wú)需分離培養(yǎng)就可以反映微生物的群落結(jié)構(gòu)信息，但無(wú)法獲得有關(guān)微生物群落總體活性與代謝功能的信息[14-21]。 BIOLOG-ECO方法從代謝的角度直觀地反映微生物種群的總體活性，不可培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)底物供應(yīng)也有響應(yīng)，可以明確環(huán)境微生物功能多樣性的代謝特征，由于操作簡(jiǎn)單、獲得數(shù)據(jù)量豐富，受到眾多研究者的青睞[14,16-21]。BIOLOG-ECO在作物根際土壤微生物多樣性研究方面得到廣泛的應(yīng)用[22-25]。而在野生羊肚菌根際土壤微生物多樣性研究方面的應(yīng)用鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究用BIOLOG-ECO方法測(cè)定羊肚菌根際微生物群落結(jié)構(gòu)，為促進(jìn)羊肚菌人工栽培技術(shù)發(fā)展，提高產(chǎn)量和穩(wěn)定性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 取材區(qū)域概況 研究區(qū)域位于新疆伊犁昭蘇縣境內(nèi)，選取羊肚菌多年高發(fā)區(qū)(81°24′39.06″E，43°05′52.65″N，海拔2 042 m)，山坡雪松林下，黑色腐質(zhì)土。

1.1.2 土壤樣品采集 該區(qū)域野生羊肚菌采集后，根下分0～10 cm(土層1)，10～20 cm(土層2)，20～30 cm(土層3)三個(gè)土層采集土樣，然后將相應(yīng)土層土樣混合放入自封袋于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 土壤處理 將不同土層土樣在25 ℃條件下活化24 h，稱取新鮮土樣5 g置于無(wú)菌三角瓶中，加入45 mL無(wú)菌生理鹽水，25 ℃、150 r/min恒溫震蕩30 min，靜置30 min，取上清液稀釋1 000倍為接種液[26]。

1.2.2 土壤微生物群落功能多樣性測(cè)定 采用BIOLOGTM-ECO測(cè)試板(ECO MicroPlate，美國(guó)Matrix Technologies Corporation)分析微生物群落功能多樣性。根據(jù)其化學(xué)特性將Biolog-ECO微平板31種碳源分為氨基酸類6種，羧酸類5種，糖類12種，聚合物類4種，胺類2種，酚類2種[27-28]。在超凈工作臺(tái)上，將1.2.1的接種液用八道排槍向ECO板各培養(yǎng)孔加入150 μL， 每張板每個(gè)樣品3次重復(fù)。接種好的微孔板放入自制帶透氣孔的保鮮盒，底部鋪6層濕紗布保濕。將保鮮盒置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、 72、96、120、144、168 h在Thermo ScientificTMMultiskanTMGO 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀讀取OD590值。

孔的顏色平均變化率(Average well color development， AWCD)：AWCD=∑(Ci-R)/n，式中Ci為第i個(gè)非對(duì)照孔的吸光值，R為對(duì)照孔的吸光值，n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù),本實(shí)驗(yàn)為31種碳源。

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)：H′=-∑PilnP，式中Pi表示第i個(gè)非對(duì)照孔中的吸光值與所有非對(duì)照孔吸光值總和的比值。

豐富度指數(shù)(S)是指被利用的碳源的總數(shù)目，該研究中為每孔中(Ci-R)的值大于0.1的孔數(shù)。

Pielou均勻度指數(shù)(E)：E=H′/lnS,式中S為被利用的碳源總數(shù)。

Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(D)：D=1-∑P2i。

McIntosh 指數(shù)(U)是基于群落物種多維空間上的 Euclidian 距離的多樣性指數(shù)，U=∑ni2,式中，ni 是第 i 孔的相對(duì)吸光值(C-R)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0軟件和CANOCO 4.5進(jìn)行分析，采用EXCEL2007軟件作圖。用方差分析不同采樣土層土壤微生物AWCD之間差異。微生物AWCD值在0～96 h變化趨勢(shì)相對(duì)穩(wěn)定，參考鄭麗萍等[20]的方法選取了72 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用主成分分析微生物群落利用碳源差異[29]，統(tǒng)計(jì)分析概率為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物碳源利用動(dòng)力學(xué)分析

2.1.1 各土層土壤微生物AWCD變化特征 AWCD是衡量微生物利用單一碳源能力的重要指標(biāo)，反映了土壤微生物代謝活性的強(qiáng)弱。由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各土層微生物利用碳源能力呈逐漸增加，在觀測(cè)周期內(nèi)的AWCD持續(xù)升高。3個(gè)土層AWCD變化趨勢(shì)表現(xiàn)為土層1>土層2>土層3，其中土層1的變化趨勢(shì)顯著高于土層2和土層3，但土層2和土層3的總體變化趨勢(shì)差異不顯著。從圖1還可以看出，在培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí)3個(gè)土層AWCD值存在顯著差異(P<0.05),仍然表現(xiàn)為土層1>土層2>土層3，因此后續(xù)一些特征數(shù)的計(jì)算均采用培養(yǎng)72 h的數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行。

圖1 羊肚菌根際土壤微生物群落AWCD變化Fig.1 AWCD changes of soil microflora in the rhizosphere of WildMorchella

2.1.2 各土層土壤微生物對(duì)各類碳源的利用特征 Biolog代謝指紋圖譜是指微生物對(duì)ECO板上不同碳源的利用能力圖，從圖2可以看出隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各土層對(duì)六大類碳源的利用率逐漸增加，總體表現(xiàn)為利用6種碳源總能力為土層1>土層2>土層3，這與3個(gè)土層AWCD動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)一致，但是3個(gè)土層對(duì)糖類碳源的利用率均不高。

圖2 不同土層根際微生物對(duì)Biolog-ECO板31種碳源利用動(dòng)態(tài)Fig.2 Dynamics of utilization of 31 carbon sources in biolog-eco plates byMorchellarhizosphere soil microorganisms in different soil layers

圖3所示為培養(yǎng)72 h、單一碳源利用情況。對(duì)于氨基酸類碳源，土層1對(duì)L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸的利用能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于土層2和土層3。土層3對(duì)L-天冬氨酸利用能力高于其他2個(gè)土層。土層2對(duì)甘氨酰-L-谷氨酸利用能力略高于土層1，差異不明顯，但二者均顯著高于土層3。綜合評(píng)估3個(gè)碳源對(duì)氨基酸類碳源利用能力是土層1>土層2>土層3，這與前面的兩個(gè)結(jié)果保持一致。

對(duì)于多聚物類碳源的利用情況，土層1對(duì)吐溫-40、吐溫-80級(jí)肝糖原利用能力均高于其他2個(gè)土層，僅有α-環(huán)式糊精的利用土層2高于其他2個(gè)土層。而且綜合評(píng)估3個(gè)土層對(duì)聚合物類碳源利用能力仍然是土層1>土層2>土層3，這與前面的兩個(gè)結(jié)果也保持一致。

對(duì)于羧酸類碳源的利用，3個(gè)土層差異不大，僅在γ-羥基丁酸和D-葡萄胺酸差異較明顯。對(duì)于糖類碳源3個(gè)土層僅在D-甘露醇、N-乙酰基-D-葡萄胺和D,L-α-甘油三種糖類碳源利用上存在顯著差異，表現(xiàn)為土層1>土層2>土層3，但是其他糖類碳源3個(gè)土層差異不明顯。對(duì)于胺類碳源利用，土層1顯著高于其他2個(gè)土層。對(duì)于酚酸類碳源的利用，土層3顯著高于其他2個(gè)土層。

圖3 羊肚菌不同土層根際土壤微生物對(duì)31種碳源的利用Fig.3 Utilization of 31 carbon sources by Morchellarhizosphere soil microorganisms in different soil layersA:羊肚菌根際不同土層微生物對(duì)氨基酸類碳源的利用；B:羊肚菌根際不同土層微生物對(duì)多聚物類碳源的利用；C:羊肚菌根際不同土層微生物對(duì)羧酸類碳源的利用；D:羊肚菌根際不同土層微生物對(duì)糖類碳源的利用；E:羊肚菌根際不同土層微生物對(duì)酚酸類碳源的利用；F:羊肚菌根際不同土層微生物對(duì)胺類碳源的利用A:Utilization of carbon source of amino acids byMorchellarhizosphere soil microorganisms in different soil layers；B:Utilization of carbon source of polymer byMorchellarhizosphere soil microorganisms in different soil layers；C:Utilization of carboxyl carbon source byMorchellarhizosphere soil microorganisms in different soil layers；D:Utilization of carbohydrate carbon source byMorchellarhizosphere soil microorganisms in different soil layers；E:Utilization of carbohydrate carbon source byMorchellarhizosphere soil microorganisms in different soil layers；F:Utilization of amine carbon source byMorchellarhizosphere soil microorganisms in different soil layers

2.1.3 羊肚菌根際土壤微生物群落利用碳源的主成分分析 根據(jù)主成分分析(圖4)，第1主成分為63.29%，第2主成分為34.78%，共占98.07%。不同土層間距離的大小表示土層間的相似程度，距離越近相似程度越高。土層1、土層2及土層3三土層間距離基本相當(dāng)，說(shuō)明其差異性相當(dāng)。不同土層在不同碳源投影點(diǎn)的相對(duì)位置(箭頭)代表該碳源在該類型的重要程度，即大小程度，順著箭頭的方向，表示重要程度越大，反之，表示重要程度越小。從圖4中可以明顯看出，與土層1相關(guān)的碳源類型遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于土層2和土層3，土層2相關(guān)的碳源類型高于土層3。

圖4 野生羊肚菌根際土壤微生物碳源利用PCA分析Fig.4 PCA analysis of microbial carbon sources in rhizosphere soil of wildMorchella C1:丙酮酸甲脂;C2:吐溫-40;C3:吐溫-80;C4:α-環(huán)式糊精;C5:肝糖;C6:D-纖維二糖;C7:α-D-乳糖;C8:β-甲基D-葡萄糖苷;C9:D-木糖;C10:I-赤藻糖醇;C11:D-甘露醇;C12:N-乙酰基-D-葡萄胺;C13:D-葡萄胺酸;C14:葡萄糖-1-磷酸鹽;C15:D,L-α-甘油;C16:D-半乳糖內(nèi)酯;C17:D-半乳糖醛酸;C18:2-羥苯甲酸;C19:4-羥基苯甲酸;C20:γ-羥基丁酸;C21:衣康酸;C22:α-丁酮酸;C23:D-蘋果酸;C24:L-精氨酸;C25:L-天冬酰胺酸;C26:L-苯基丙氨酸;C27:L-絲氨酸;C28:L-蘇氨酸;C29:甘氨酰-L-谷氨酸;C30:苯乙基胺;C31:腐胺C1:Pyruvic Acid Methyl Ester;C2:Tween-40;C3:Tween-80;C4:α-Cyclodextrin;C5:Glycogen;C6:D-Cellobiose;C7:α-D-Lactose;C8:β-Methyl-D-Glucoside;C9:D-Xylose;C10:I-Erythritol;C11:D-Mannitol;C12:N-Acetyl-D-Glucosamine;C13:D-Glucosaminic Acid;C14:Glucose-1-Phosphate;C15:D,L-α-Glycerol;C16:D-Galactonic Acid y-Lactone;C17:D-Galacturonic Acid;C18:2-Hydroxy Benzoic Acid;C19:4-Hydroxy Benzoic Acid;C20:γ-Hydroxybutyric Acid;C21:Itaconic Acid;C22:α-Ketobutyric Acid;C23:D-Malic Acid;C24:L-Arginine;C25:L-Asparagine;C26:L-Phenylalanine;C27:L-Serine;C28:L-Threonine;C29:Glycyl-L-Glutamic Acid;C30:Phenylethyl-amine;C31: Putrescine

2.2 各土層土壤微生物多樣性指數(shù)比較分析

由圖5可以看出土層1在AWCD、多樣性指數(shù)U、多樣性指數(shù)H′、豐富度指數(shù)S、均勻度指數(shù)E及優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D六項(xiàng)指標(biāo)上與其他2個(gè)土層存在顯著差異(P<0.05)，其中AWCD、多樣性指數(shù)U、多樣性指數(shù)H′、豐富度指數(shù)S、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D均顯著高于其他2個(gè)土層。均勻度指數(shù)E表現(xiàn)為土層3顯著高于其他2個(gè)土層(P<0.05)，土層1的均勻度指數(shù)最低，均勻度指數(shù)越高，菌落一致性越好，但是多樣性越低，這從另外一個(gè)方面反映了土層1的微生物功能多樣性是最豐富的。多樣性指數(shù)結(jié)果表現(xiàn)為土層1>土層2>土層3，這與碳源利用的主成分分析結(jié)果是一致的。

圖5 羊肚菌不同土層根際土壤微生物培養(yǎng)72 h的各種指標(biāo)比較Fig.5 Comparison of various indexes ofMorchellarhizosphere soil microorganisms in different soil layers after 72 h culture

3 討 論

菌根土壤與非菌根土壤微生物多樣性差別不大[30-31]，但是在仿生栽培過(guò)程中覆蓋羊肚菌發(fā)生地表層土壤確實(shí)有促進(jìn)羊肚菌發(fā)生的現(xiàn)象。雖然羊肚菌的發(fā)生受多種因素的影響，其中包括溫度、濕度、土壤等多個(gè)方面，土壤因素包括土壤理化因素和生物因素，而土壤理化因素和生物因素之間是相互影響的。生物因素主要是指土壤中的微生物。

在自然條件下，羊肚菌對(duì)環(huán)境條件具有特殊而又嚴(yán)格的要求，只有在特定環(huán)境條件下才能產(chǎn)生，而羊肚菌子實(shí)體發(fā)生的先導(dǎo)因素是土壤中是否存在能夠產(chǎn)生菌核的因子，決定羊肚菌菌核產(chǎn)生的因素，除了溫度和濕度外，就是土壤微生物因素所起的誘導(dǎo)作用。菌根土壤中一些微生物可能會(huì)對(duì)羊肚菌子實(shí)體的形成產(chǎn)生影響，但不是決定因素。在羊肚菌人工栽培過(guò)程中，通過(guò)環(huán)境條件的嚴(yán)格控制，雖然能夠保證土壤中產(chǎn)生大量的菌核，但是菌核不一定都能形成子實(shí)體。而子實(shí)體能否形成的關(guān)鍵是找到刺激菌核萌發(fā)的土壤微生物因素[32]。因此，在人工栽培過(guò)程中，尋找土壤中的微生物誘導(dǎo)因素具有更重要的研究?jī)r(jià)值。我們借助于Biolog-ECO方法從微生物代謝的角度來(lái)解釋羊肚菌根際土壤不同土層深度微生物功能多樣性的差別，進(jìn)一步縮小影響羊肚菌發(fā)生的影響因素范圍。通過(guò)對(duì)羊肚菌根際不同土層AWCD動(dòng)態(tài)變化、不同土層碳源利用特征及多樣性指數(shù)分析均表明:①羊肚菌根際土壤微生物不同土層AWCD隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈增加趨勢(shì)，符合微生物培養(yǎng)過(guò)程中的增長(zhǎng)曲線。從3個(gè)土層AWCD總體變化曲線來(lái)看土層1>土層2>土層3，這表明土層1的微生物代謝活性最強(qiáng)；②從羊肚菌根際不同土層微生物對(duì)不同碳源利用特點(diǎn)來(lái)看，土層1能夠利用的碳源類型最多，利用碳源能力最強(qiáng)，總體表現(xiàn)為土層1>土層2>土層3；③從羊肚菌根際不同土層微生物多樣性指數(shù)分析結(jié)果來(lái)看，土層1的AWCD、多樣性指數(shù)U、多樣性指數(shù)H′、豐富度指數(shù)S、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D均顯著高于其他2個(gè)土層。均勻度指數(shù)E表現(xiàn)為土層2顯著高于其他2個(gè)土層。均勻度指數(shù)越高，菌落一致性越好，但是多樣性越低，從另外一個(gè)方面反映了土層1的微生物功能多樣性是最豐富的。由此我們可以得出羊肚菌根際土壤微生物功能多樣性表現(xiàn)為土層1>土層2>土層3。在野生羊肚菌采集過(guò)程中，我們觀察了羊肚菌菌根分布范圍，菌根分布深度一般不超過(guò)土壤深度的30 cm，而且絕大部分菌根分布于土層的表層即10 cm左右。因此將羊肚菌根際土層分為0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm三個(gè)土層進(jìn)行采樣，然后進(jìn)行對(duì)比研究。 而研究的結(jié)果也表明了這3個(gè)土層在微生物功能多樣性方面的確存在顯著差異，并且表層土壤(土層1)的微生物功能多樣性最強(qiáng)，這與熊川等[32]2015年的研究結(jié)果一致。羊肚菌根際不同土層土壤在理化性質(zhì)方面可能存在較大差異，從而導(dǎo)致其微生物多樣性產(chǎn)生不同，進(jìn)一步影響了羊肚菌菌根的土層分布，而表層土壤中特殊的微生物菌落又影響了羊肚菌子實(shí)體的發(fā)生。

Biolog-ECO方法只能從代謝特性角度反映微生物功能多樣性，不能反映具體種屬多樣性。而利用土壤微生物培養(yǎng)研究微生物多樣性雖然能夠在一定程度上反映土壤微生物種屬多樣性，但是對(duì)于不可培養(yǎng)的微生物無(wú)法通過(guò)培養(yǎng)獲取。因此要想全面、準(zhǔn)確的反映土壤微生物多樣性，找到土壤中對(duì)羊肚菌子實(shí)體發(fā)生起誘導(dǎo)作用的微生物因素，還需借助于高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。