孫 俠， 劉香梅， 龐增雄， 劉冬虹， 徐穎愉， 江 漪， 李 敏， 丘智峰， 黃宇鋒

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院， 廣州511447)

太陽光中的紫外線會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生損傷， 依據(jù)不同的生物學(xué)損傷效應(yīng)，可根據(jù)波長分為短波紫外線(UVC， 100～280 nm)、中波紫外線(UVB， 280～320 nm)和長波紫外線(UVA， 320～400 nm)[1]。其中波長最短的UVC 可對(duì)生物產(chǎn)生較強(qiáng)的破壞作用，但由于臭氧層的存在，UVC 幾乎到達(dá)不了地球表面； UVB具有中等穿透力，主要穿透皮膚的角質(zhì)層和表皮層，僅有不足2% 能到達(dá)地球表面，它對(duì)皮膚較淺的人體皮膚產(chǎn)生的效應(yīng)主要是急性的紅斑反應(yīng)以及隨后一定程度的色素沉積； 地球表面超過98%的紫外線是UVA，UVA 具有很強(qiáng)的穿透力，能穿透人體的角質(zhì)層、表皮層、真皮層從而殃及皮下組織，可造成嚴(yán)重和持久的皮膚危害[2]。

根據(jù)《衛(wèi)生部化妝品檢驗(yàn)規(guī)定》(2002 年版)要求[3]， 具有紫外線吸收功能的化妝品必須進(jìn)行光毒性試驗(yàn)安全性檢驗(yàn)。在衛(wèi)生部“化妝品衛(wèi)生規(guī)范”(2007年版)中皮膚光毒性試驗(yàn)方法規(guī)定了30 min的皮膚光毒性試驗(yàn)[4]。但日常生活中， 太陽光的照射時(shí)間常常大于30 min， 為探討不同輻射時(shí)間紫外線引起的皮膚光毒性損傷作用， 本實(shí)驗(yàn)采用UVA(4.5mJ·cm-2·s-1)+UVB(0.036mJ·cm-2·s-1)輻射的方法，建立紫外線致皮膚光毒性損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并對(duì)不同時(shí)間紫外照射引起的SD大鼠皮膚光毒性損傷進(jìn)行了比較分析，為皮膚光毒性損傷研究提供背景數(shù)據(jù)，并為進(jìn)一步防曬功效評(píng)價(jià)提供合適的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性SD 大鼠， 28 只， 體質(zhì)量180 ～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(粵)2013-0002]。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院毒理實(shí)驗(yàn)室[SYXK(粵)2014-0137]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)院動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有操作均符合3 R 原則。

1.2 主要試劑

抗波形蛋白(Anti-Vimentin)抗體、抗黑色素瘤(Anti-Melanoma)抗體和抗CD34 抗體均購自英國Abcam 公司； 小鼠和兔二步法試劑盒購自中杉金橋公司； DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

皮膚光毒性試驗(yàn)檢測儀(型號(hào)： HOPE-MED 8130B)購自天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司； ES全封閉組織脫水機(jī)(型號(hào)： Excelsior)、組織包埋機(jī)(型號(hào)：HistoStar)、石蠟切片機(jī)(型號(hào)： HM340E)、烘片機(jī)(型號(hào)： Slimline Hotplate)、自動(dòng)染片機(jī)(型號(hào)： Gemini AS) 和自動(dòng)封片機(jī)(型號(hào)： CTM 6)均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司； 顯微鏡(型號(hào)： ZEISS Lab. A1)購自卡爾蔡司光學(xué)(中國)有限公司； 電子天平(型號(hào)： 雙杰JJ3000)購自雙杰電子天平公司。

1.4 造模方法

28 只大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型1 組、模型2 組和模型3 組，每組7 只。除空白對(duì)照組外，其余各組予以紫外線照射。每次照射前，在大鼠背部3 cm×3 cm 區(qū)域內(nèi)剃毛，使皮膚充分暴露， 將大鼠放在皮膚光毒性試驗(yàn)檢測儀(UVA+UVB)燈具正下方的30 cm 處照射， 輻射參數(shù)設(shè)為UVA(4.5 mJ·cm-2·s-1)+ UVB(0.036 mJ·cm-2·s-1)，每周照射2 次， 連續(xù)照射4 周， 共8 次。模型1 組8 次照射時(shí)間分別為6 min、12 min、24 min、36 min、48 min、60 min、72 min、84 min，8 次累計(jì)共342 min。模型2 組8 次照射時(shí)間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，累計(jì)共440 min。模型3 組8 次照射時(shí)間分別為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min，累計(jì)共520 min。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 皮膚刺激反應(yīng) 每次照射后觀察皮膚反應(yīng)，并按表1 對(duì)皮膚刺激反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分(紅斑和焦痂形成、水腫分別積分，最高積分為8 分)。

1.5.2 病理學(xué)觀察 取照射部位皮膚1 cm×1 cm大小， 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%中性甲醛溶液固定， 進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、切片， HE 染色， 光學(xué)顯微鏡觀察并照相， 觀察各組之間照射部位皮膚病理學(xué)形態(tài)差異。在高倍顯微鏡下， 用ZEN2病理圖文分析軟件測量皮膚的表皮厚度和真皮層皮脂腺的橫截面積， 參照GB7919-87《化妝品安全性評(píng)價(jià)程序和方法》按表2進(jìn)行皮膚損傷評(píng)分， 總分按(a+b+c+d+e+f+g+i+j+k)或(h+i+j+k)選擇總分較大者。

1.5.3 免疫組織化學(xué)檢測 用黑色素瘤特異性標(biāo)記(HMB45)抗體檢測皮膚表皮層黑素細(xì)胞變化，用Vimentin 抗體檢測真皮層成纖維細(xì)胞增生情況，用CD34 抗體檢測真皮層微血管的生成情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所測數(shù)據(jù)采用Excel錄入和SPSS21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用t 檢驗(yàn)、方差分析和多重比較(LSD 法)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚組織大體觀察

正常對(duì)照組大鼠皮膚未見明顯異常， 模型1 組、模型2 組、模型3 組大鼠皮膚略黃，各組均未見明顯紅斑和水腫形成。

表1 大鼠皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分Table 1 Score of skin irritation response

表2 大鼠皮膚損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Score standard of skin injury

2.2 皮膚組織病理學(xué)觀察

正常對(duì)照組大鼠的背部皮膚表皮由角質(zhì)層、顆粒層、棘細(xì)胞層和基底細(xì)胞層構(gòu)成，顆粒層和棘細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)較少，表皮厚薄均勻(圖1A1)； 真皮層由乳頭層(真皮淺層)和網(wǎng)狀層(真皮深層)組成，膠原纖維是真皮結(jié)締組織中最為豐富的成分，彈力纖維數(shù)量較膠原纖維少，較均勻散在分布在膠原束之間(圖1A2)； 真皮層皮膚附件由毛囊、皮脂腺組成，均未見明顯異常(圖1A3)。模型1 組大鼠背部部分皮膚表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚)，棘層肥厚(表皮為正常厚度1.6～2.7 倍)，表皮厚薄不均，皺紋明顯加深，真皮層散在的成纖維細(xì)胞增生(圖1B1、圖1B2)； 真皮層毛囊增大，皮脂腺增生(圖1B3)。模型2 組大鼠背部部分皮膚表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚)，棘層肥厚(表皮為正常厚度1.5～2.9 倍)，表皮厚薄不均，皺紋明顯，真皮層少量膠原纖維變性伴少量成纖維細(xì)胞增生，局部散在炎細(xì)胞浸潤(圖1C1、圖1C2)； 真皮層毛囊增大，皮脂腺增生(圖1C3)。模型3 組大鼠背部部分皮膚表皮角化過度(角質(zhì)層、顆粒層增厚)，棘層肥厚(表皮為正常厚度1.5～3.7 倍)，表皮厚薄不均，皺紋明顯，部分表皮細(xì)胞空泡化，真皮層纖維排列較亂，部分膠原纖維變性伴部分成纖維細(xì)胞增生，局部少量炎細(xì)胞浸潤(圖1D1、圖1D2)； 真皮層毛囊增大，皮脂腺增生(圖1D3)。

2.3 各組大鼠皮膚表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面 積比較

表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積測定結(jié)果顯示(表3)，模型1 組、模型2 組、模型3 組均較正常對(duì)照組顯著增厚或增大(P＜0.05)，且隨著輻照時(shí)間增加，增厚或增大更為明顯。

2.4 皮膚損傷評(píng)分

模型1 組： 棘層肥厚1 分，角質(zhì)層增厚1 分，顆粒層增厚1 分； 模型2 組： 棘層肥厚1 分，角質(zhì)層增厚1 分，顆粒層增厚1 分，真皮層少量炎細(xì)胞浸潤1 分，少量膠原纖維變性伴少量成纖維細(xì)胞增生1 分； 模型3 組： 棘層肥厚1～2 分，角質(zhì)層增厚1 分，顆粒層增厚1 分，部分表皮細(xì)胞空泡化1 分，真皮層炎細(xì)胞浸潤1 分，部分膠原纖維變性伴部分成纖維細(xì)胞增生1 分。與正常對(duì)照組比較，模型1 組、模型2 組、模型3 組皮膚損傷評(píng)分均顯著升高(P＜0.05)，且照射時(shí)間越長，皮膚損傷的程度越重(表4)。

2.5 免疫組織化學(xué)觀察

根據(jù)圖2 結(jié)果，正常對(duì)照組(圖2a1)、模型1組(圖2b1)皮膚未見明顯HMB45 的表達(dá)； 模型2組(圖2c1)、模型3 組(圖2d1)局部皮膚可見少量細(xì)胞表達(dá)HMB45，表達(dá)部位位于表皮基底層和毛囊的上皮層。

正常對(duì)照組(圖2a2)皮膚真皮層見散在的成纖維細(xì)胞Vimentin表達(dá)(細(xì)胞數(shù)≤10個(gè)/高倍視野)； 模型1組(圖2b2)皮膚真皮層見成纖維細(xì)胞Vimentin表達(dá)增多(細(xì)胞數(shù)＞10 且≤20 個(gè)/高倍視野)； 模型2 組(圖2c2)、模型3 組(圖2d2)皮膚真皮層見成纖維細(xì)胞Vimentin表達(dá)明顯增多(細(xì)胞數(shù)＞20個(gè)/高倍視野)。

圖1 紫外線照射大鼠皮膚組織病理學(xué)觀察

表3 各組大鼠皮膚表皮厚度和真皮層皮脂腺橫截面積比較Table 3 Comparison of skin epidermal thickness and cross section area of sebaceous glands in dermis of SD rats in each group

表4 各組大鼠皮膚損傷評(píng)分比較 Table 4 Comparison of skin injury scores of SD rats in each group

正常對(duì)照組(圖2a3)SD大鼠背部皮膚真皮層毛細(xì)血管CD34 的表達(dá)較少； 模型1 組(圖2b3)、模型2 組(圖2c3)、模型3 組(圖2d3)大鼠背部皮膚真皮層毛細(xì)血管CD34 的表達(dá)均較正常對(duì)照組明顯增多。

3 討論

本研究在輻照參數(shù)UVA(4.5 mJ·cm-2·s-1)+UVB(0.036 mJ·cm-2·s-1)不變的基礎(chǔ)上，通過延長輻照時(shí)間，設(shè)置了3個(gè)不同輻照劑量的模型組，其中， 模型1 組累計(jì)輻照時(shí)間為342 min，模型2 組累計(jì)輻照時(shí)間為440 min， 模型3 組累計(jì)輻照時(shí)間為520 min。根據(jù)皮膚組織病理學(xué)分析結(jié)果， 模型1 組大鼠皮膚表皮損傷較明顯， 真皮損傷較輕； 模型2組大鼠皮膚表皮損傷較明顯， 真皮損傷較模型1 組加重； 模型3組大鼠皮膚表皮損傷和真皮損傷均較模型1 組加重?？梢?，隨著紫外照射時(shí)間的延長，皮膚損傷程度也逐漸加重。楊汝斌等[5]采用UVA+UVB輻射成功建立SD 大鼠光老化模型， 造模結(jié)束時(shí)UVA、UVB 輻照強(qiáng)度累計(jì)分別為148.5J·cm-2和21.38J·cm-2。樓彩霞等[6]采用更接近日光UVA、UVB 比例的輻照參數(shù)，造模結(jié)束時(shí)UVA、UVB 輻照強(qiáng)度累計(jì)分別為123J·cm-2和5J·cm-2， 成功建立了大鼠光老化模型，皮膚損傷程度較楊汝斌等報(bào)道的有所減輕。本實(shí)驗(yàn)采用的UVA 累計(jì)照射量與上述報(bào)道基本一致， 而UVB 累計(jì)照射量則明顯降低，真皮層未見明顯的出血改變，皮膚病理改變也相應(yīng)減輕，更能模擬人類皮膚經(jīng)紫外線照射后的表現(xiàn)，也更適合于防曬化妝品的防曬功效評(píng)價(jià)。

圖2 紫外線照射大鼠皮膚組織免疫組織化學(xué)觀察

HMB45是Gown等[7]發(fā)現(xiàn)的能與黑素瘤的一種抗原結(jié)合的單克隆抗體， 它能識(shí)別前黑素小體球蛋白，可與增生活躍的黑素細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞起反應(yīng)[8]。Vimentin 是間質(zhì)細(xì)胞中最主要的中間纖維，與皮膚損傷后修復(fù)及瘢痕增生有關(guān)[9]。CD34 是細(xì)胞表面的一種磷酸化糖蛋白，選擇性地表達(dá)于造血干/祖細(xì)胞、小血管內(nèi)皮細(xì)胞等表面[10]，也可作為微血管再生的一個(gè)標(biāo)記蛋白[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： 空白對(duì)照組和模型1 組大鼠皮膚未見明顯HMB45 的表達(dá)，模型2 組、模型3 組大鼠局部皮膚可見少量細(xì)胞表達(dá)HMB45，而3個(gè)模型組的Vimentin和CD34表達(dá)都增多。結(jié)果表明長時(shí)間紫外線照射可促進(jìn)皮膚黑色素細(xì)胞增生，紫外輻照可造成皮膚損傷，紫外輻照可促進(jìn)微血管的生成，這些效應(yīng)可隨輻照時(shí)間延長而更加嚴(yán)重。

本實(shí)驗(yàn)采用UVA+UVB紫外線輻射的方法，成功建立了皮膚光毒性損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，同時(shí)結(jié)合毒性病理學(xué)評(píng)價(jià)方法，分析比較了表皮厚度、表皮黑色素細(xì)胞H M B 4 5 表達(dá)、真皮成纖維細(xì)胞Vimentin 表達(dá)、真皮毛細(xì)血管CD34 表達(dá)、皮膚損傷評(píng)分等病理學(xué)指標(biāo)。這些指標(biāo)易于觀察和量化，相比人體防曬系數(shù)(SPF)和防曬時(shí)間(PA)測試結(jié)果，更能直觀反應(yīng)防曬化妝品對(duì)紫外線引起的皮膚深層光損傷的防護(hù)作用，可用于防曬化妝品防曬功效評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)的模型2 組、模型3 組SD 大鼠皮膚HMB45 表達(dá)、皮膚光毒性損傷程度均明顯加重，或可作為評(píng)價(jià)防曬化妝品功效的動(dòng)物模型。