史向華， 楊文彬， 薛潤(rùn)苗， 趙靜宇， 續(xù) 艷， 張彩峰， 柴秋彥

(山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院藥理研究室， 太原 030006)

維生素D3(VitD3)屬脂溶性維生素，是維持生命所必須的營(yíng)養(yǎng)素之一， 它有兩種形式， 即膽鈣化醇(VitD3)和角骨化醇(VitD2)[1]。VitD3對(duì)人體的骨骼發(fā)育極為重要，其主要功能是促進(jìn)鈣、磷在腸道的吸收， 維持血清鈣和磷的濃度在正常范圍內(nèi)，并促進(jìn)鈣在骨組織中的沉積，維持人體骨骼的健全以及神經(jīng)肌肉功能的正常。此外，VitD3還具有免疫調(diào)節(jié)功能，參與人體對(duì)感染的反應(yīng)。當(dāng)VitD3不足時(shí)，在小兒可引起佝僂病(俗稱缺鈣)， 在成人則可引起骨軟化癥(特別是妊娠和哺乳期的婦女)，與老年人的骨質(zhì)疏松癥也有密切關(guān)系。目前，維生素VitD3在臨床得到了廣泛的使用，作為動(dòng)物生長(zhǎng)和維持生命所必須的營(yíng)養(yǎng)素之一，在動(dòng)物飼料配制中，也進(jìn)行了大量的添加使用。VitD3雖是發(fā)育不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分，但并不是攝入越多越好，過(guò)量服用會(huì)引起中毒[2]。VitD3中毒常是因?yàn)槭褂貌划?dāng)，或是在治療佝僂病的過(guò)程中反復(fù)大量使用VitD3所致[3]。VitD3產(chǎn)生的中毒癥狀是通過(guò)增加腸鈣的吸收而造成血液中鈣水平升高所引起的。當(dāng)血清鈣濃度超過(guò)110～130 mg/L 時(shí)，出現(xiàn)全身癥狀，如乏力、口渴、食欲不振、意識(shí)障礙等。急劇發(fā)生重癥高鈣血癥會(huì)引發(fā)高鈣血癥性腎危象，表現(xiàn)為以急性腎小管壞死為特征的急性腎功衰竭[4]。在某些情況下，腎損害可能是不可逆轉(zhuǎn)的。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)給大鼠攝入大劑量的VitD3，探討中毒劑量VitD3對(duì)腎功能的生化指標(biāo)、腎組織自由基及鈣離子沉積的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)5 周齡SD 大鼠，40 只，雄雌各半，體質(zhì)量150～170 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(冀)2008-1003]，飼養(yǎng)于山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院藥理研究室SPF屏障級(jí)動(dòng)物房[SYXK(晉)2017-0001]。

1.2 主要試劑

VitD3注射液(7.5 mg/mL)， 購(gòu)自上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(批號(hào)： 20100106)； 超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(批號(hào)： 20130408)， 丙二醛(MDA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)和尿酸(UA)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào)： 20130416)，血液鈣(Ca2+)定量檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自中生北控物科技股份有限公司(批號(hào)： 2010416)。

1.3 主要儀器

電子天平(型號(hào)BT2202S)購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司， 全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)ChemWell 2910)購(gòu)自金西盟(北京)儀器有限公司， 半自動(dòng)酶標(biāo)儀(型號(hào)R960型)購(gòu)自長(zhǎng)春賽諾邁德醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司， 光學(xué)顯微鏡(型號(hào)BH-2 型)購(gòu)自日本Olympus 公司， 全自動(dòng)五分類動(dòng)物專用血液分析儀( 型號(hào)HEMAVET950型)購(gòu)自北京卓越勵(lì)新有限責(zé)任公司，原子吸收光譜儀(型號(hào)DUOAA)購(gòu)自安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組 將40 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、VitD3低劑量組(1 875 IU/kg 組，VitD3Ⅰ)、VitD3中劑量組(3 750 IU/kg 組，VitD3Ⅱ)、VitD3高劑量組(7 500 IU/kg 組，VitD3Ⅲ)和VitD3超高劑量組(15 000 IU/kg 組，VitD3Ⅳ)5 組，每組8 只，雌雄各半； 動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前不禁食，不禁水。

1.4.2 給藥途徑、劑量和時(shí)間 VitD3注射液，以玉米油進(jìn)行等量遞增稀釋，分別配成所需濃度，每日臨用時(shí)現(xiàn)配。每日灌胃給藥1 次，給藥體積為 0.5 mL/100 g，連續(xù)3 周； 對(duì)照組大鼠灌胃等量生理鹽水。

1.4.3 樣本采集 血清樣本采集，禁食過(guò)夜后稱量體質(zhì)量，用乙醚麻醉大鼠，采用腹主動(dòng)脈采血，血樣自然凝固后離心(4 ℃，3 000 r/min) 10 min，取上清液貯存于-4 ℃待測(cè)。

腎組織Ca2+含量測(cè)定樣品制備，精確稱取干燥后樣本約0.5 g 于250 mL 高型燒杯，加混合酸消化液20～30 mL，上蓋表面皿。置于電熱板或沙浴上加熱消化。如未消化好而酸液過(guò)少時(shí)，補(bǔ)加消化液， 繼續(xù)消化， 直至無(wú)色透明。加5 mL 水， 加熱以除去多余的硝酸。待燒杯中液體量約2～3 mL時(shí)，取下冷卻。用20 g/L 氧化鑭溶液洗并轉(zhuǎn)移于10 mL 刻度試管中，定容待測(cè)。

1.4.4 樣本測(cè)定 體質(zhì)量增長(zhǎng)測(cè)定， 分別在實(shí)驗(yàn)1 d、9 d、18 d、21 d 用電子天平稱量并記錄體質(zhì)量。

血清生化指標(biāo)測(cè)定，利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組大鼠血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)； 按試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定MDA、SOD。

腎組織Ca2+含量測(cè)定， 取腎組織精密稱量， 按1∶9 加入冷藏的生理鹽水， 剪碎， 勻漿， 3 000 r/min離心10 min，取上清液，以原子吸收光譜儀測(cè)定；取與消化試樣相同量的混合酸消化液，按上述操作試劑空白測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

SPSS l9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析， 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x- ± s表示，組間比較采用LSD-t 法進(jìn)行分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，被毛光亮，活動(dòng)如常，能自由進(jìn)食飲水。Vit D3用藥各組大鼠，在1 周時(shí)，外觀被毛、活動(dòng)、飲食、排便及體質(zhì)量增長(zhǎng)等一般狀況，與對(duì)照組無(wú)明顯差別； 2 周時(shí)，VitD3Ⅲ和VitD3Ⅳ組大鼠的一般狀況欠佳； 3 周時(shí)，VitD3Ⅲ和VitD3Ⅳ組大鼠活動(dòng)及飲食明顯減少，被毛無(wú)色澤。

2.2 大鼠體質(zhì)量

3 周后，VitD3 Ⅲ和Ⅳ組雄性大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯降低(P＜0.05)； 雌性大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)略有減緩(P＞0.05)。與低劑量組比較，VitD3Ⅲ和Ⅳ在連續(xù)給藥21 d，雄性大鼠體質(zhì)量隨著劑量的增加，體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯減緩(P＜0.05)， 給藥期間，雌性大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化，詳見表1。

2.3 大鼠血清BUN 和Cre 濃度

連續(xù)3 周后，與對(duì)照組比較， VitD3Ⅲ和Ⅳ組大鼠BUN 含量明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)； 各劑量組大鼠Cre 含量隨著劑量增加明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)，詳見表2。

2.4 大鼠血清和腎組織 Ca2+、SOD 和MDA 含量

給藥3周后，VitD3中劑量起各組大鼠血清Ca2+含量明顯上升(P＜0.05， P＜0.01)(表3)； 腎組織Ca2+含量隨著劑量的增加逐漸升高(P＜0.05， P＜0.01)(表3)。

用藥3 周后，與對(duì)照組比較， VitD3Ⅲ和Ⅳ組大鼠血清SOD含量隨著劑量的增加逐漸降低(P＜0.05，P＜0.01)； VitD3Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組大鼠血清MDA含量隨著劑量增加逐漸升高(P＜0.05， P＜0.01)(表3)。用藥3 周后，與對(duì)照組比較，VitD3Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ劑量組大鼠腎組織勻漿MDA含量未見明顯的變化， VitD3Ⅳ組MDA 含量均明顯降低(P＜0.01)(表3)。

表1 VitD3 對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響 g

表2 VitD3 對(duì)各組大鼠BUN 和Cre 的影響

3 討論

體質(zhì)量增長(zhǎng)是反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般生理狀況的重要指標(biāo)，特別是在藥物的毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)中，是必須考察的項(xiàng)目。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， Vit D3用藥組大鼠在連續(xù)3周用藥后， 體質(zhì)量增長(zhǎng)均有減緩， 與對(duì)照組相比， 雌性大鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 但雄性大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)則明顯降低， Vit D3在7 500 IU、15 000 IU劑量時(shí)， 增長(zhǎng)停滯， 體質(zhì)量下降， 說(shuō)明在此劑量時(shí)， 對(duì)大鼠的正常生理代謝功能造成了嚴(yán)重干擾， 出現(xiàn)了明顯的毒性。并說(shuō)明雄性大鼠比雌性大鼠更為敏感。

表3 VitD3 對(duì)各組大鼠血清和腎組織 Ca2+、SOD 和MDA 含量

血清BUN、Cre含量是臨床上反映機(jī)體腎臟功能的常用指標(biāo)， 其含量的高低， 可以敏感反映腎小球的濾過(guò)功能和損害程度[5]。在有關(guān)實(shí)驗(yàn)性腎功能損傷的研究中，都把血清BUN、Cre 含量作為衡量腎功能的主要指標(biāo)之一，但尚未見大劑量Vit D3使用于大鼠造成中毒而引起血清BUN、Cre含量升高的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在中毒劑量范圍內(nèi)的大鼠血清BUN、Cre含量隨著劑量的增加而相應(yīng)的下降， 同對(duì)照組比較， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，可能在此中毒劑量時(shí)， 嚴(yán)重干擾了大鼠體內(nèi)蛋白質(zhì)和肌肉的合成和代謝， 使相應(yīng)的代謝產(chǎn)物減少所致。

近年來(lái)的研究[6]表明，氧化應(yīng)激損傷是腎損傷發(fā)病的重要機(jī)制之一。有文獻(xiàn)[7]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)VitD3能促進(jìn)氧化作用產(chǎn)生過(guò)氧化物即VitD3自由基，后者造成細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，引起組織損傷。細(xì)胞膜受損后，即使血鈣不升高，也可發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化。本實(shí)驗(yàn)所用劑量下，大鼠血液過(guò)氧化物歧化酶SOD 含量明顯降低，MDA 含量明顯上升，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)大鼠使用VitD3可以使血清中SOD濃度下降，MDA 活性增高，造成腎臟組織的自由基損傷，同文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果相似。同時(shí)也提示大劑量使用VitD3后造成機(jī)體自由基增加造成的氧化應(yīng)激性損傷，可能是大劑量使用VitD3后產(chǎn)生腎臟毒性作用的機(jī)制之一。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1 875～7 500 IU/kg 劑量下，大鼠腎組織勻漿SOD、MDA 含量沒有明顯變化，但在15 000/kg 劑量時(shí)明顯降低， 與大鼠血清SOD、MDA 含量測(cè)定結(jié)果相反，排除實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差外，尚無(wú)法作出合理的解釋，有待進(jìn)一步研究探討。VitD3用藥組腎組織Ca2+含量隨著劑量的增加逐漸升高，與對(duì)照組比較，差異有顯著或十分顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明大劑量使用VitD3時(shí)可造成大量Ca2+在腎組織中沉積，是造成腎臟毒性的主要原因。結(jié)果同以往文獻(xiàn)[8，9]報(bào)道結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， VitD3在7500～15 000 IU/kg 劑量，已經(jīng)達(dá)到引起大鼠腎臟毒性的劑量。