唐潤東， 宋思遠(yuǎn)， 吳 薇

(1. 上海市七寶中學(xué)， 上海201100； 2. 上海外國語大學(xué)附屬浦東外國語學(xué)校， 上海200120；3. 中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所， 上海200031)

暴飲暴食是當(dāng)今不同年齡段人們共同面對(duì)的難題，暴飲暴食帶來一系列的危害。糖是飲食中重要的組成成分，是能量的主要來源之一。研究表明，高糖飲食會(huì)引發(fā)肥胖癥、胰島素抗性[1]、心肌病[2]，線粒體功能障礙者多食高糖還會(huì)引發(fā)代謝危機(jī)[3]等。

黑腹果蠅(Drosophlia melanogaster)生命周期較短， 壽命只有3個(gè)月左右， 且與人類衰老基因有高度同源性，特別適合開展壽命研究[4-10]。越來越多學(xué)者通過對(duì)果蠅壽命的研究來尋找合適的生存方式和藥物開發(fā)。研究顯示， 白砂糖、避孕藥、鬼箭羽和荔枝核提取物、北蟲草提取液、長白山蟲草、紫薯提取物、山藥粗多糖、繡球菌多糖、紫甘藍(lán)和紫山藥提取物等[11-20]都對(duì)果蠅壽命產(chǎn)生影響。

果蠅的消化系統(tǒng)在生理結(jié)構(gòu)、細(xì)胞構(gòu)成、遺傳調(diào)控及其干細(xì)胞的形態(tài)和功能上，都與脊椎動(dòng)物存在很大相似性。因此， 果蠅是適宜研究腸干細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)和調(diào)控機(jī)理的理想動(dòng)物模型。Spradling[21]和Perrimon[22]實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用腸道細(xì)胞的相關(guān)分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，成體果蠅的中腸存在腸道干細(xì)胞(intestinal stem cell， ISC)。ISC 經(jīng)過有絲分裂產(chǎn)生一個(gè)子代ISC 和一個(gè)成腸細(xì)胞(enteroblast， EB)，EB又可以分化為吸收型的腸上皮細(xì)胞(enterocyte， EC)和分泌型的內(nèi)分泌細(xì)胞(enteroendocrine cell， EE)，這些細(xì)胞共同構(gòu)成了腸道組織，并且通過ISC 的增殖、分化來實(shí)現(xiàn)維持和更新。樓哲豐等[23]研究表明，高濃度鎘的攝入對(duì)果蠅中腸上皮細(xì)胞核膜、線粒體和微絨毛等超微結(jié)構(gòu)造成損傷，該類損傷能夠誘使果蠅腸道組織上調(diào)表達(dá)相關(guān)配體蛋白，從而激活干細(xì)胞的表皮生長因子受體(EGFR)和Janus 激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)信號(hào)通路，促進(jìn)ISC 的增殖與分化能力，繼而實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道損傷組織進(jìn)行及時(shí)的修復(fù)。然而，中腸干細(xì)胞增殖信號(hào)通路的持續(xù)激活以及干細(xì)胞的過度增殖同樣具有誘發(fā)腸道腫瘤發(fā)生的潛在可能。唐潤東等[24]研究表明，食物中的營養(yǎng)失衡會(huì)顯著影響果蠅的體質(zhì)量以及腸壁和腸道干細(xì)胞的數(shù)目，導(dǎo)致果蠅體質(zhì)量下降或上升，腸道細(xì)胞增殖功能紊亂，對(duì)果蠅發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

綜上所述，進(jìn)行飲食中糖分控制是非常必要的， 而壽命和中腸干細(xì)胞都是非常重要的測(cè)試指標(biāo)。本試驗(yàn)用梯度糖分濃度控制方式研究糖分對(duì)雌黑腹果蠅體質(zhì)量、壽命和中腸干細(xì)胞產(chǎn)生的影響， 以期給女性樹立正確科學(xué)的飲食觀念提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

黑腹果蠅Canton-S 購自美國Bloomington 果蠅資源中心。

1.2 培養(yǎng)基

正常果蠅培養(yǎng)基配方： 水1 L， 活性干酵母25 g，大豆粉9.18 g，玉米粉66.8 g，蔗糖40 g，麥芽糖42.4 g，瓊脂粉6 g， 對(duì)羥基苯甲酸甲酯/無水乙醇0.25 mL/2.5 mL、苯甲酸鈉8 g， 丙酸6.875 mL。以正常培養(yǎng)基含糖量為100%糖分， 高糖果蠅培養(yǎng)基配方(含120%糖分)是在上述正常培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上增加質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%含糖量(蔗糖+麥芽糖)， 余類推。

培養(yǎng)基原料均購自上海維編科貿(mào)有限公司，由中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所果蠅資源與技術(shù)平臺(tái)配制。

萬分之一天平FA1004 購自中國上海衡平儀器儀表廠。激光掃描共聚焦顯微鏡Leica TCS SP8 購自德國徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 體質(zhì)量和壽命統(tǒng)計(jì) 將1 日齡黑腹果蠅置于裝有不同培養(yǎng)基的果蠅培養(yǎng)管中飼養(yǎng)， 每管30 只，雌雄各15 只(雌雄混合飼養(yǎng)是為了維持果蠅正常的生活狀態(tài))。25 ℃、相對(duì)濕度40%～60%、12 h 光照+12 h 黑暗培養(yǎng)，每2～3 d 更換一次培養(yǎng)基。果蠅設(shè)7 個(gè)組別(表1)， 每組設(shè)6 個(gè)重復(fù)(6 管)， 3 管用來稱重，3 管用來解剖。每7 d 用萬分之一天平稱各管雌果蠅體質(zhì)量； 每7 d 統(tǒng)計(jì)雌果蠅存活數(shù)、死亡數(shù)，直到全部死亡，計(jì)算存活率和平均壽命。

表1 果蠅組別設(shè)置Table 1 Treatments of groups in Drosophlia melanogaster

1.3.2 中腸干細(xì)胞免疫熒光染色 28 d時(shí)解剖10只雌果蠅(從3 個(gè)重復(fù)管中平均選取)中腸，免疫熒光染色，觀察干細(xì)胞形態(tài)和分布情況。染色條件為：果蠅中腸經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%甲醛固定后用PBST(0.1%PBS/Triton X-100)洗4 次，每次20 min，接著用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% BSA/PBST 溶液封閉1 h，然后與一抗(按一定比例稀釋于PBST 溶液)孵育2 h。PBST洗4 次，每次20 min，與熒光二抗孵育(按一定比例稀釋于PBST)1 h， 接著PBST洗4次， 每次20 min。解剖果蠅取中腸置于載玻片上，封片用于后續(xù)觀察。在研究中使用的抗體包括鼠抗-Armadillo(1∶500， v/v) ( DSHB，Iowa City，Iowa， United States)， 鼠抗-Prospero(1∶2000， v/v) (DSHB)，DAPI 染細(xì)胞核。采用Leica TCS SP8 系統(tǒng)觀察激光共聚焦圖片，實(shí)驗(yàn)圖片采用Adobe Photoshop 及Image J 軟件進(jìn)行處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 糖分控制對(duì)雌果蠅體質(zhì)量的影響

28 d 以后， 果蠅死亡半數(shù)以上，故不再稱重。由圖1 可以看出，隨著年齡增長，A 組和 B 組雌果蠅體質(zhì)量均呈現(xiàn)先緩慢上升，21 d后體質(zhì)量快速上升趨勢(shì)，A 組體質(zhì)量增長0.73 mg，B 組體質(zhì)量增長0.77 mg，說明攝入過量糖會(huì)加速雌果蠅體質(zhì)量增加。高糖喂養(yǎng)后用糖分梯度培養(yǎng)基喂養(yǎng)，體質(zhì)量增長趨勢(shì)隨著糖分減少呈先下降后上升趨勢(shì)，體質(zhì)量增長最慢的是E 組，其次是F 組。而G 組效果不明顯，C 組、 D 組體質(zhì)量增加沒有減緩。

2.2 糖分控制對(duì)雌果蠅存活率的影響

56 d 統(tǒng)計(jì)時(shí)各組果蠅全部死亡。由圖2 可以看出， 隨著處理時(shí)間的延長，雌果蠅在前14 d 基本沒有死亡， 而在14 d 以后， 死亡數(shù)量劇增， 21 d 以后呈直線下降趨勢(shì)。B 組雌果蠅存活率遠(yuǎn)低于A 組。梯度糖分控制后， 存活率有不同程度的增加， E組存活率最高，28 d 存活率為86.67%，A 組為62.22%，B 組為40.00%。

2.3 糖分控制對(duì)雌果蠅平均壽命的影響

由圖3 可以看出， B 組雌果蠅平均壽命(25.2 d)與A 組(29.4 d)沒有顯著差異。但經(jīng)過糖分控制處理后， D 組和 E 組壽命增長明顯，且E 組(35.15 d)與B 組比差異顯著，C 組和 G 組壽命幾乎沒有增加。說明適當(dāng)減少糖攝入量利于長壽，但完全不吃糖也不利于壽命增加。

圖1 糖分控制對(duì)雌果蠅體質(zhì)量的影響Figure 1 The effects of sugar concentration control on body weight of female Drosophila melanogaster

圖2 糖分控制對(duì)雌果蠅存活率的影響Figure 2 The effects of sugar concentration control on survival rate of female Drosophila melanogaster

圖3 糖分控制對(duì)雌果蠅平均壽命的影響Figure 3 The effects of sugar concentration control on average longevity of female Drosophila melanogaster

2.4 糖分控制對(duì)雌果蠅中腸細(xì)胞形態(tài)的影響

喂養(yǎng)到28 d時(shí)(圖4)，A組腸道細(xì)胞分布均勻，形態(tài)正常，B 組腸道比A 組增粗，細(xì)胞形態(tài)變化很大，排列無序，說明中腸受到損傷。高糖喂食后用控制糖分培養(yǎng)基喂養(yǎng)，各組中腸細(xì)胞形態(tài)與一直高糖喂養(yǎng)相比都有一定變化。C 組、D 組和G 組細(xì)胞排列無序， E 組和F 組細(xì)胞排列有序性增強(qiáng)，說明腸道受損傷較輕，但仍舊不能恢復(fù)到一直正常飲食狀態(tài)，說明合理控制糖分?jǐn)z入對(duì)雌性身體健康是有好處的，但暴食高糖后恢復(fù)正常或降低糖分?jǐn)z入飲食短期內(nèi)都不能完全減輕腸道損傷。

3 討論

圖4 糖分控制對(duì)雌果蠅中腸干細(xì)胞形態(tài)的影響Figure 4 The effects of sugar concentration control on midgut cells of female Drosophila melanogaster

果蠅在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中，能量的來源只有培養(yǎng)基，因此研究培養(yǎng)基各成分對(duì)果蠅壽命的影響具有實(shí)際意義。酵母粉是果蠅飼料中不可缺少的基本成分之一，研究表明酵母粉攝入限制下，果蠅壽命有明顯的延長。但酵母粉攝入超過一定量時(shí)會(huì)促使果蠅壽命縮短，Min 等[25]研究表明，培養(yǎng)基中酵母粉含量達(dá)到質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%和質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%時(shí)，果蠅的壽命有明顯的縮短，顧蔚等[26]研究了高濃度酵母粉對(duì)果蠅生長及壽命的影響，顯示高濃度酵母粉對(duì)果蠅生長具有促進(jìn)作用，但壽命顯著縮短。

糖也是果蠅飼料中不可缺少的基本成分之一，田禎祥等[11]采用雌性黑腹果蠅壽命作為女運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)水平的模型，研究表明雌性黑腹果蠅的壽命與白砂糖濃度成倒U字型相關(guān)，正常糖分組處于壽命內(nèi)穩(wěn)態(tài)，低糖或高糖遠(yuǎn)離壽命內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

本試驗(yàn)從不同糖濃度處理對(duì)雌果蠅的體質(zhì)量、壽命和中腸干細(xì)胞形態(tài)影響的綜合分析表明，高糖飲食后適度減糖能減緩體質(zhì)量增長，延長壽命，但只能一定程度上減輕腸道損傷，不能完全恢復(fù)。說明對(duì)雌性果蠅來說，合理控制飲食，控制糖分?jǐn)z入很重要。但糖分只是飲食的一個(gè)重要組成成分，還有脂肪、蛋白質(zhì)等，也需要進(jìn)一步研究。