牛博文， 陳麗香， 朱孟敏， 彭秀華， 秦波音， 李 峰

(上海市公共衛(wèi)生臨床中心， 上海 201508)

TALEN、CRISPR/Cas9 等基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展極大縮短了基因修飾小鼠的制備周期，大量的靶位點(diǎn)修飾、轉(zhuǎn)基因小鼠被應(yīng)用于基因功能的研究，這些品系小鼠的活體保種工作也成為各研究機(jī)構(gòu)工作的重要部分。配子冷凍保種是將小鼠精子、卵子以及胚胎保存在極低溫度下，使其新陳代謝完全停止的一種保種方式，被認(rèn)為可以替代活體保種[1]。配子冷凍保存一方面可以防止品系的遺傳漂變，減少各種因素造成的品系丟失，另一方面可以減少活體保種帶來的人力財力消耗。常用的品系保存方法包括胚胎冷凍法和精子冷凍法。精子冷凍相比于胚胎冷凍操作更加簡單，僅需要少量的雄鼠即可完成，同時在復(fù)蘇后可以在短時間內(nèi)繁育出大量后代。對于大多數(shù)品系小鼠而言最常用的冷凍液由18%棉子糖和3%脫脂奶粉組成，但是對于C57BL/6J 等品系小鼠，該冷凍液復(fù)蘇后受精率在10%以下[2，3]， 而大多數(shù)基因修飾鼠以C57BL/6J為背景鼠，所以改善該品系的精子冷凍和復(fù)蘇效率尤為重要， 本文主要圍繞精子冷凍液、精子復(fù)蘇方法和冷凍精子體外受精(IVF)等方面進(jìn)行探索及優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3～6 月齡C57BL/6J 雄鼠、4 周齡C57BL/6J 雌鼠、8 周齡ICR 雌鼠均為SPF 級， 購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2013-0016]； 基因修飾小鼠為上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部 [SCXK(滬)2015-0002]保種品系， 均飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部[SYXK(滬)2015-0008]SPF 動物設(shè)施內(nèi)，飼喂以高壓滅菌水和60Co 輻照飼料，飼養(yǎng)室相對濕度(50±10)%，溫度(23±3)℃， 光照12 h 明暗交替。

1.2 主要試劑儀器

M2 培養(yǎng)液(MR-015P-D)、KSOM 培養(yǎng)液(MR-020P-5F)、HTF 培養(yǎng)液(MR-070-D)、棉子糖(R0250)、MTG(56454)、GSH(G4251)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA，P8136)均購自德國Merck 公司； 脫脂奶粉(A600669)、D-PBS 均購自生工生物工程(上海)股份有限公司； 孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)均購自寧波第二激素廠， 0.25 mL 細(xì)管(005565， 法國卡蘇公司)，培養(yǎng)皿(美國Corning 公司)，體式顯微鏡(SZ61，日本Olympus 公司)，顯微手術(shù)鑷(蘇州施強(qiáng)醫(yī)療器械公司)，水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備公司)。

1.3 主要溶液配制方法

1.3.1 冷凍保護(hù)液配制 R18S3 冷凍液： 將9 g 棉子糖加至30 mL 去離子水中， 80 ℃水浴鍋中加熱30 s使其完全溶解， 再加入1.5 g脫脂奶粉， 定容至50 mL，室溫15 000×g 離心20 min，棄沉淀，重復(fù)兩次直至上清液透明，0.22 μm 過濾器過濾。M-R18S3冷凍液： 每50 mL R18S3 冷凍液中加入2 μL MTG，0.22 μm 過濾器過濾，分裝，-20 ℃保存[11]。

1.3.2 GSH配制 準(zhǔn)確稱取GSH 30.4 mg，用1 mL無菌超純水， 0.22 μm 過濾器過濾， 分裝，-20 ℃保存，此溶液濃度為100 mmol/L，使用前每100 μL HTF 培養(yǎng)液中加入1 μL 進(jìn)行稀釋。

1.4 實驗方法

1.4.1 冷凍裝置 冷凍裝置為高約20 cm 的泡沫保溫盒，液氮高度為10 cm，將厚度約為0.5 cm 的泡沫板漂浮在液氮表面，在冷凍前30 min 泡沫盒中加入液氮預(yù)冷泡沫漂浮板。

1.4.2 冷凍方法 ①低濃度精子冷凍法：無菌取出3～6 月齡雄鼠附睪尾及1.5 cm輸精管，在D-PBS中用顯微鑷剝離脂肪和血管，清洗干凈后放入含有1 mL 冷凍液的培養(yǎng)皿中，用1 mL 注射器針頭將附睪尾劃破，擠壓出附睪尾及輸精管中的精子， 37 ℃溫箱中放置10 min。培養(yǎng)結(jié)束后，取1 μL 精子于D-PBS 中稀釋10 倍，觀察精子運(yùn)動狀況， 選擇運(yùn)動狀況良好的精子， 按照圖1 所示裝入0.25 mm冷凍細(xì)管中， PVA 封口結(jié)束后立即放入預(yù)冷的液氮漂浮板上預(yù)冷10 min，之后投入液氮中長期保存。②高濃度精子冷凍法： 采集和冷凍方法同低濃度組，用120 μL 冷凍液懸浮撕開的附睪尾及輸精管，每支細(xì)管裝入10 μL(0.5 cm)冷凍精子。

圖1 0.25 mm 冷凍細(xì)管填裝冷凍精子示意圖

1.4.3 冷凍精子復(fù)蘇 在雌鼠注射hCG后12 h開始復(fù)蘇精子。將細(xì)管從液氮中拿出，在空氣中停留5 s，立即投入37 ℃水浴鍋中，1 min 后取出，擦干細(xì)管表面水分，剪掉兩端冷凍液，將精子吹入空的培養(yǎng)皿中。①低濃度精子冷凍組，用槍頭將10 μL 復(fù)蘇的精子(約106個)吹入含200 μL HTF 培養(yǎng)液的受精皿中，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h； ②高濃度精子冷凍組，用10 μL 槍頭將復(fù)蘇的精子(約107個)吹入含80 μL HTF 的獲能皿中，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中放置30 min 后用槍頭在獲能滴的邊緣吸入10 μL 活動精子并轉(zhuǎn)移至含200 μL HTF 的受精皿中，培養(yǎng)箱中孵育30 min。

1.4.4 體外受精(IVF) 小鼠超數(shù)排卵： 4周齡C57BL/6J 雌鼠按每只5 IU 腹腔注射PMSG，47 h 后按每只5 IU 腹腔注射hCG； 在精子復(fù)蘇后30 min開始收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)。無菌取出超數(shù)排卵的雌鼠輸卵管，在體式顯微鏡下用1 mL 注射器針頭撕開輸卵管壺腹部，輕輕擠壓出COCs， 在HTF培養(yǎng)液中清洗3 遍； 用200 μL 槍頭將COCs 轉(zhuǎn)移至含有精子的受精液中。4～6 h 后用槍頭吹散粘附在卵母細(xì)胞表面的精子， 轉(zhuǎn)入M2培養(yǎng)液中清洗5遍后將胚胎轉(zhuǎn)移至過夜平衡的KSOM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.4.5 胚胎移植 取0.5 d假孕ICR受體鼠， 麻醉， 剔除背部毛發(fā)，酒精及碘酊消毒，剪開脊柱背側(cè)皮膚，剪開脊柱兩側(cè)0.5 cm 處肌肉層，在此創(chuàng)口處用鈍頭鑷子夾住脂肪墊拉出附帶的卵巢及輸卵管，用脂肪夾固定，在體視顯微鏡下找出輸卵管壺腹部，用1 mL 注射器針頭在壺腹部前側(cè)刺一切口，之后將移卵針中的卵裂胚胎經(jīng)此切口吹入輸卵管壺腹部(可用氣泡作為標(biāo)記)，再將輸卵管及卵巢放回腹腔，分別縫合肌肉層及皮膚，碘酊消毒。

2 結(jié)果

2.1 不同組合精子冷凍液及IVF液的冷凍復(fù)蘇效率

以低濃度精子冷凍法進(jìn)行精子冷凍，復(fù)蘇后與C57BL/6J 品系雌鼠卵子孵育進(jìn)行IVF，對比表1中幾種不同組合的精子冷凍液和IVF液的胚胎發(fā)育情況(表1)，用R18S3 或M-R18S3 進(jìn)行精子冷凍，復(fù)蘇后以HTF培養(yǎng)液進(jìn)行IVF，2-細(xì)胞發(fā)育率分別為8.4%及20.6%，而復(fù)蘇后采用濃度1 mmol/L GSH 的HTF 液進(jìn)行IVF，2-細(xì)胞發(fā)育率可分別達(dá)到25%及43.5%，若用M-R18S3 進(jìn)行精子冷凍，復(fù)蘇后用濃度為1.5 mmol/L GSH 的HTF 培養(yǎng)液進(jìn)行IVF，2- 細(xì)胞發(fā)育率降至21.4%。

2.2 兩種不同精子密度的冷凍和復(fù)蘇方法比較

M-R18S3 作為冷凍保護(hù)液，分別用高、低濃度精子冷凍及復(fù)蘇法進(jìn)行IVF，高濃度精子冷凍組相比于低濃度精子冷凍組，2-細(xì)胞發(fā)育率由41.3%(31/75)提高至64.2%(36/64)。

表1 不同組合冷凍液及IVF 液胚胎發(fā)育情況

2.3 不同類型基因修飾小鼠的冷凍效果

用高密度精子冷凍法對本中心保種的四種C57BL/6J 背景的基因修飾小鼠進(jìn)行精子冷凍、復(fù)蘇及IVF，結(jié)果(表2)顯示，冷凍精子IVF 后2-細(xì)胞發(fā)育率34%～90%，將部分2-細(xì)胞移植入假孕受體鼠輸卵管中，4 種小鼠均有子代出生，出生率40%～57%。

表2 幾種基因修飾小鼠冷凍精子IVF 后胚胎發(fā)育及出生情況

3 討論

隨著基因修飾方法的不斷改進(jìn)和發(fā)展，基因修飾動物已經(jīng)成為科學(xué)研究中常用的實驗材料，傳統(tǒng)的保種方式大多采用活體保種，這種方式往往會出現(xiàn)遺傳變異，同時對動物設(shè)施要求較高。低溫冷凍保存方式可以克服這些缺點(diǎn)，與胚胎冷凍相比，精子冷凍技術(shù)具有方便、快速、成本及設(shè)備要求低等特點(diǎn)，正被廣泛應(yīng)用。

精子冷凍即將精子保存在極低溫度下(-196 ℃)，完全抑制精子的新陳代謝，精子復(fù)蘇后能夠恢復(fù)受精能力。在這一過程中，由于滲透壓、溫度等的變化，精子細(xì)胞會受到一系列的損傷，導(dǎo)致精子死亡或者失去受精能力[4]，所以相比于新鮮精子，冷凍精子的受精率往往較低。目前，小鼠精子冷凍方法較多，包括冷凍液、冷凍容器、冷凍裝置以及精子處理方法等方面均有相關(guān)的研究[5，6]。本實驗室通過試驗對比多種冷凍裝置及容器，我們認(rèn)為泡沫漂浮板及0.25 mm冷凍細(xì)管進(jìn)行精子冷凍操作更加簡便，冷凍效果較為穩(wěn)定，且對于非專業(yè)技術(shù)人員較容易掌握。

小鼠精子冷凍常用的冷凍液是R18S3，但是由于不同品系對于冷凍損傷的敏感性不同[3]，NOD、FVB、DBA 及雜交小鼠冷凍精子復(fù)蘇后2-細(xì)胞發(fā)育率可以達(dá)到35%～70%，C57BL/6J、BALB/c、129S3/SvIm 等品系小鼠冷凍精子復(fù)蘇后2-細(xì)胞發(fā)育率僅為6%左右[2]，本實驗中C57BL/6J品系小鼠冷凍精子復(fù)蘇后2-細(xì)胞發(fā)育率為8.4%。實驗證明，在R18S3冷凍液基礎(chǔ)上加入抗氧化劑例如GSH、谷氨酰胺、褪黑激素、橡黃素、紅景天多糖等可以提高精子冷凍復(fù)蘇效率，這是由于在冷凍降溫和復(fù)蘇后，精子呼吸代謝會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，ROS 能夠氧化精子質(zhì)膜，損傷精子功能，而抗氧化劑可以清除這些ROS[7-9]。參考相關(guān)研究[2，10，11]，本研究在R18S3 冷凍液中加入終濃度為477 μmol/L 的MTG，2-細(xì)胞發(fā)育率由8.4%升高至20.6%，這可能與MTG 的抗氧化作用有關(guān)。冷凍精子在復(fù)蘇后運(yùn)動能力下降50%左右，這類精子細(xì)胞往往缺乏受精能力[12]，為了避免這些精子產(chǎn)生ROS 影響受精率，往往需要將復(fù)蘇后的精子進(jìn)行洗滌處理。在家畜精子復(fù)蘇中通常采用浮游法和密度梯度離心法進(jìn)行洗滌，但是密度梯度離心法需要離心處理，可能對精子造成二次損傷[13]，本研究參考浮游法篩選獲得活力較高的精子。此外，為保證IVF時有足夠的精子量，本研究也采用高濃度精子冷凍法[10]，精子復(fù)蘇后在受精滴中用IVF液將高濃度精子稀釋至合適的濃度，孵育一定時間后活力較強(qiáng)的精子將浮游至液滴邊緣，用此類精子進(jìn)行IVF，C57BL/6J 小鼠的受精率可由41.3%提高至64.2%。GSH 是人體內(nèi)一種重要的內(nèi)源性抗氧化物，是存在于精子和精漿內(nèi)的 ROS 清除劑之一，在保護(hù)精子對抗氧化損傷的防御機(jī)制中起著重要作用[14]。本研究在IVF 液中加入1 mmol/L GSH，可使受精率顯著提高，達(dá)到43.5%。有觀點(diǎn)認(rèn)為適當(dāng)水平的ROS 在精子的高活躍性運(yùn)動、獲能、頂體反應(yīng)中具有重要作用[14]，本研究在受精液中加入1.5 mmol/L GSH 時，受精率下降至21.4%，這可能與GSH 消除較多的ROS 導(dǎo)致精子獲能及頂體反應(yīng)受到影響有關(guān)。

根據(jù)Jackson實驗室統(tǒng)計，目前以C57BL/6J 為背景的基因修飾小鼠約占75%[2]，為驗證本研究建立的方法是否適合這些基因修飾小鼠的保種工作，我們選取本中心幾種C57BL/6J背景的基因修飾小鼠進(jìn)行精子冷凍。冷凍精子IVF 后2-細(xì)胞平均發(fā)育率可以達(dá)到50%，且移植后均有子代出生。這說明本研究中所用方法可以作為C57BL/6J背景基因修飾小鼠的保種方法。

綜上所述，以M-R18S3 作為冷凍保護(hù)液，采用高濃度精子細(xì)管冷凍法進(jìn)行精子冷凍，冷凍精子復(fù)蘇后通過受精滴浮游法進(jìn)行篩選， 在含1 mmol/L GSH 的HTF 培養(yǎng)液中進(jìn)行IVF，這一技術(shù)體系可以作為C57BL/6J 背景基因修飾鼠的保種方法，為常規(guī)實驗室進(jìn)行精子冷凍提供了較理想的方法。