外源基因在轉(zhuǎn)基因玉米中的整合位點分析

王翠云 劉艷 劉允軍

（中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081）

隨著全球人口的增長和氣候環(huán)境的變化，糧食安全問題是許多國家面臨的緊迫問題。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因作物并應用于商業(yè)化種植，有助于解決糧食安全問題。自1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積逐年增加，2017年轉(zhuǎn)基因作物種植面積達到1.898億hm2，帶來巨大的社會效益、經(jīng)濟效益和生態(tài)效益［1］。商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因事件一般都是從大量轉(zhuǎn)化事件中篩選得到。由于轉(zhuǎn)基因作物的安全性問題受到廣泛關(guān)注，商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物都經(jīng)過嚴格的安全性評價，許多國家已經(jīng)出臺了一系列法規(guī)和管理方法。

在轉(zhuǎn)基因安全評價中，外源基因在基因組中的整合位點是必須提供的信息。鑒定外源基因在基因組中的整合位點對轉(zhuǎn)基因作物的應用具有重要意義。目前，主要通過PCR技術(shù)鑒定外源基因的整合位點，包括TAIL-PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）、反向PCR（Inverse PCR，I-PCR）、T接頭 PCR（T-linker PCR）等方法［2-6］。TAIL-PCR 技術(shù)簡單易行，反應高效靈敏，產(chǎn)物特異性好，重復性好，應用較為廣泛。Xu等［7］通過TAIL-PCR方法分離了水稻轉(zhuǎn)基因事件Bt-ZJ22中外源基因整合位點3'端旁側(cè)序列，并根據(jù)旁側(cè)序列建立了TaqMan實時定量PCR鑒定方法。Yang等［8］通過TAIL-PCR方法鑒定了轉(zhuǎn)基因番茄華番l號外源基因整合位點的旁側(cè)序列。Liu等［9］對抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米事件Aro203進行分析，鑒定了外源基因整合位點兩側(cè)旁側(cè)序列，并建立了事件特異性的PCR鑒定方法。

基于PCR技術(shù)獲得的旁側(cè)序列相對較短，如果旁側(cè)序列比對到多條染色體，則不能通過旁側(cè)序列確定外源基因整合的染色體。對外源基因進行遺傳定位，可以確定外源基因在基因組中的物理位置，有助于全面了解外源基因在基因組中的整合情況。

本課題組前期將Cry1Ie和bar轉(zhuǎn)化玉米，獲得大量抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新材料［10］。本研究以其中一個抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米事件IE34為研究對象，通過TAILPCR獲得外源基因整合位點上游旁側(cè)序列，并通過遺傳定位的方法確定外源基因整合的染色體位置，以期為轉(zhuǎn)基因玉米的安全性評價提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為轉(zhuǎn)Cry1Ie抗蟲玉米IE34。轉(zhuǎn)基因玉米與玉米自交系B73雜交構(gòu)建F2代分離群體用于遺傳定位。轉(zhuǎn)基因玉米材料申報在北京市和海南省的中間試驗并進行種植。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 取200 mg苗期生長旺盛的玉米葉片，采用改良的CTAB法［11］提取DNA。

1.2.2 TAIL-PCR 依據(jù)Liu等［5］方法進行TAILPCR，在外源基因的左邊界處設計特異性引物與隨機引物組合進行擴增（TAIL-PCR的隨機引物為LAD1-1和LAD1-2，巢式引物為AC1；根據(jù)CaMV35S polyA終止子序列設計特異性引物35S-0、35S-1和35S-2（表1））。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收，與T載體連接，隨機挑選5個陽性克隆進行測序。

表1 TAIL-PCR引物

1.2.3 轉(zhuǎn)化體的特異性PCR檢測 利用抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米IE34的旁側(cè)序列以及外源片段中的CaMV35S polyA序列，設計引物（上游引物IE34F：5'-AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3'；下游引物IE34R ：5'-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3'），建立IE34事件及其衍生產(chǎn)品的定性PCR鑒定方法。反應條件為 95℃ 5 min ；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃1 min，共35個循環(huán)；72℃ 7 min。

1.2.4 BSR-Seq分析 轉(zhuǎn)基因玉米IE34與自交系B73構(gòu)建的F2分離群體植株長至5葉期時，用草銨膦涂抹葉片，5 d后，根據(jù)葉片受害情況鑒定轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株。分別取50株轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米的葉片樣品進行混池，提取RNA，送北京貝瑞和康生物技術(shù)股份有限公司建庫測序。測序數(shù)據(jù)進行BSA分析，初步確定外源基因在玉米基因組上的整合位點。

1.2.5 外源基因整合位點的初定位驗證 在MaizeGDB（http：//www.maizegdb.org/）網(wǎng)站上下載初定位處的SSR標記，通過PAGE凝膠電泳篩選出在綜31和B73雙親之間存在多態(tài)性的引物。然后以分離群體中非轉(zhuǎn)基因植株DNA為模板進行PCR擴增，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，硝酸銀染色，篩選交換單株，驗證外源基因整合位點。

2 結(jié)果

2.1 TAIL-PCR擴增與序列分析

前期通過Southern雜交確定轉(zhuǎn)基因玉米IE34中外源基因單拷貝整合［10］。以轉(zhuǎn)基因玉米IE34葉片基因組DNA為模板，非轉(zhuǎn)基因玉米綜31基因組DNA為對照，用5'端特異性引物與隨機引物組合進行TAIL-PCR擴增。在第2輪及第3輪PCR后，轉(zhuǎn)基因玉米IE34擴增到一條特異性條帶，而非轉(zhuǎn)基因玉米綜31沒有擴增到條帶（圖1）。

圖1 TAIL-PCR擴增旁側(cè)序列

將第3輪PCR擴增到的特異PCR產(chǎn)物回收并克隆到T載體，選取陽性單克隆進行測序、比對，發(fā)現(xiàn)該序列1-776 bp為玉米基因組序列，777-982 bp為外源基因的序列（圖2）。BLAST比對結(jié)果表明，1-776 bp的玉米基因組序列為重復序列，存在于玉米基因組的多條染色體上。

2.2 轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測方法的建立

依據(jù)5'端旁側(cè)序列的信息，分別在旁側(cè)序列和5'端載體序列上設計上游、下游引物進行PCR擴增，只有轉(zhuǎn)基因玉米IE34親本、雜種F1和后代及其葉片、種子的DNA能擴增出312 bp特異性目的條帶，水、非轉(zhuǎn)基因植株和質(zhì)粒均無擴增條帶（圖3），從而建立了轉(zhuǎn)基因玉米IE34的特異性PCR鑒定方法。

圖2 轉(zhuǎn)基因玉米IE34外源DNA整合位點5'端旁側(cè)序列

圖3 轉(zhuǎn)基因玉米IE34事件特異性PCR檢測

2.3 外源基因的定位分析

2.3.1 分離群體的構(gòu)建及分離比驗證 外源基因整合位點旁側(cè)序列比對到玉米多條染色體。為了進一步確定外源基因整合位點所在的染色體，構(gòu)建遺傳分離群體并進行定位分析。標記基因Bar與目的基因緊密連鎖，可以通過在葉片上涂抹草銨膦的方法區(qū)分轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米植株。將轉(zhuǎn)基因玉米IE34與自交系B73雜交構(gòu)建的F2代群體種植于田間，在苗期涂抹草銨膦后進行抗性鑒定并統(tǒng)計分離比，卡方測驗表明F2代群體抗性分離比符合3∶1（表2），表明轉(zhuǎn)基因玉米中只有1個外源基因的整合位點。

2.3.2 外源基因的定位 從F2代分離群體中隨機取50株轉(zhuǎn)基因植株和50株非轉(zhuǎn)基因植株的葉片構(gòu)建2個混池，提取葉片RNA。RNA樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序后，運用測序所得的SNP標記進行BSA分析。發(fā)現(xiàn)在第1和第5染色體上均有信號較強的峰（圖4），分別位于玉米第1染色體短臂36.2-51.7 Mb和第5染色體短臂2.74-7.77 Mb。

表2 轉(zhuǎn)基因玉米IE34 F2群體遺傳分離統(tǒng)計

圖4 BSR-Seq分析對外源基因整合位點的初定位

在 MaizeGDB網(wǎng) 站（http：//www.maizegdb.org/）下載BSR-Seq分析的2條染色體初定位區(qū)間的SSR引物，通過PAGE凝膠電泳篩選在雙親之間存在多態(tài)性的引物。其中第5染色體處的多態(tài)性引物有umc2539、umc2591和umc1679，第1染色體處的多態(tài)性引物有umc1403和phi109275。以分離群體中192個非轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板，驗證BSRSeq分析得到的初定位區(qū)間，結(jié)果（表3）顯示，第1染色體處的標記引物擴增出2個親本以及雜合型3種條帶，第5染色體處的標記引物只擴增出親本B73以及雜合型2種條帶，說明外源基因的整合位點位于第5染色體。

表3 BSR-Seq初定位結(jié)果驗證

在第5染色體定位區(qū)間內(nèi)篩選到3個InDel標記引物，分別為INS.71312、INS.71373和INS.26044。通過對定位群體篩選將bar定位在INS.71373和INS.26044 2個標記之間。進而依據(jù)BSR-Seq結(jié)果分析這個區(qū)間內(nèi)SNP位點，通過測序篩選出具有多態(tài)性的SNP位點，得到SNP1-1和SNP5-6 2個SNP多態(tài)性位點。用這8對多態(tài)性引物對F2代群體中384個非轉(zhuǎn)基因植株進行檢測，發(fā)現(xiàn)左側(cè)標記檢測的交換單株從32株遞減到3株，右側(cè)標記檢測到的交換單株呈現(xiàn)從23株到22株的遞減趨勢，說明外源基因位于SNP5-6與INS.26044 2個標記之間，這兩個標記分別位于第5染色體2.35和2.61 Mb的位置（圖5）。綜上所述，外源基因整合到了玉米第5染色體2.35-2.61 Mb約260 kb的區(qū)間內(nèi)。

圖5 外源基因整合位點的精細定位

3 討論

隨著轉(zhuǎn)基因作物研究的快速發(fā)展，需要對轉(zhuǎn)基因作物進行有效監(jiān)管。在創(chuàng)制有育種價值轉(zhuǎn)基因新材料時，希望外源基因的整合不影響受體作物的有利性狀，而且沒有質(zhì)粒骨架整合到受體基因組中。因此，確定外源基因在受體基因組中的整合位點對轉(zhuǎn)基因作物安全性評價具有重要意義。檢測外源基因整合位點旁側(cè)序列的方法有多種，如TAIL-PCR、反向PCR、染色體步移技術(shù)等［12-14］。本研究采用TAIL-PCR方法獲得了轉(zhuǎn)基因玉米事件IE34中外源基因整合位點5'端的旁側(cè)序列，但是沒有獲得整合位點3'端旁側(cè)序列，表明TAIL-PCR方法也有局限性，擴增不成功的原因可能是引物不匹配，或者旁側(cè)序列結(jié)構(gòu)復雜導致無法擴增到目的條帶。

如果知道外源基因整合位點兩端旁側(cè)序列，可以建立三引物PCR方法鑒定純合轉(zhuǎn)基因植株及雜合轉(zhuǎn)基因植株［9，15-16］。雖然本研究沒有得到轉(zhuǎn)基因玉米IE34中外源基因整合位點下游旁側(cè)序列，但利用外源基因5'端的旁側(cè)序列建立了轉(zhuǎn)基因玉米IE34的特異性PCR檢測方法，便于對其轉(zhuǎn)基因后代進行檢測。

Blast比對發(fā)現(xiàn)外源基因整合到轉(zhuǎn)基因玉米IE34基因組中的重復序列區(qū)。此重復序列存在于玉米基因組多條染色體上，因此無法確定外源基因所整合的染色體及具體位置。在構(gòu)建的F2代分離群體中轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米呈現(xiàn)3∶1的分離比，表明外源基因在玉米基因組中只有一個整合位點，因此可以利用遺傳定位的方法對外源基因整合位點進行定位，進一步確定外源基因在玉米染色體上的位置。采用BSR-Seq對外源基因整合位點進行初定位，確定外源基因整合在第5染色體。通過進一步的精細定位確定外源基因的整合位點在玉米第5染色體2.35-2.61 Mb約260 kb的區(qū)間內(nèi)，但還需要通過其他方法來確定整合位點下游的旁側(cè)序列。Guo等［14］利用基因組重測序方法鑒定到轉(zhuǎn)基因大豆中外源基因整合位點的旁側(cè)序列。直接利用高通量測序的方法有可能鑒定到轉(zhuǎn)基因玉米IE34中外源基因整合位點的下游旁側(cè)序列。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)基因玉米IE34中的外源基因整合在5號染色體2.35-2.61 Mb約260 kb的區(qū)間內(nèi)，通過PCR可以特異性檢測轉(zhuǎn)基因玉米IE34。