戈壁異常球菌角蛋白酶基因的克隆及功能研究

耿秀秀 周正富 劉盈盈 平淑珍 王勁

（1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621000；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

角蛋白是非營(yíng)養(yǎng)型的硬蛋白［1］，起到保護(hù)機(jī)體的作用［2］。β角蛋白存在于鳥禽的羽毛中，因此又被稱為羽毛角蛋白［3］。隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)為我們提供大量肉制品的同時(shí)也產(chǎn)生大量毛發(fā)、羽毛和蹄等難降解物質(zhì)。傳統(tǒng)方法（填埋、焚燒）處理這些物質(zhì)不僅占據(jù)大量空間污染環(huán)境還浪費(fèi)蛋白質(zhì)資源［4］。角蛋白酶（Keratinase，Ker）是專一水解角蛋白且對(duì)環(huán)境友好的一類酶［5］，1899年，Ward首次報(bào)道了一株能降解角蛋白的細(xì)菌——真菌馬甲團(tuán)囊菌［6］；1990年，Williams等［7］報(bào)道了一株能夠降解羽毛的地衣芽孢桿菌 PWD-1；1993年，Atalo和 Gashe［8］得到了一株能夠降解多種纖維性蛋白的嗜熱桿菌，丁正民［9］分離純化得到一株能夠降解雞毛的放線菌株SS-1；1996年，F(xiàn)rederich等［10］分離得到一株能夠利用羽毛角蛋白的嗜熱厭氧菌閃光桿菌，同年Santos等［11］發(fā)現(xiàn)了能夠降解角蛋白的曲霉；1999年，Chitte等［12］得到一株能夠高效降解角蛋的放線菌株嗜熱鏈霉菌，Wang等［13］利用基因工程的手段表達(dá)了重組角蛋白酶。目前，角蛋白酶的研究主要集中在利用基因工程篩選并生產(chǎn)高酶活的角蛋白酶［14］。

自然界中很多菌屬都含有角蛋白酶基因［15］，如：耐輻射異常球菌屬的小球菌（Deinococcus radioduransR1）和戈壁異常球 菌（D. gobiensisI-0）。R1是Anderson 等（1956年）在俄勒岡州經(jīng)大劑量輻射滅菌仍然腐爛變質(zhì)的肉類罐頭中分離獲得的一種微小球菌，備受生物界、環(huán)境工程界和醫(yī)學(xué)界關(guān)注［16-17］。I-0是本實(shí)驗(yàn)室從新疆戈壁沙漠環(huán)境中分離到的極具輻射抗性的微生物，比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，戈壁異常球菌與耐輻射異常球菌在系統(tǒng)進(jìn)化上屬于同一進(jìn)化分支，兩者均為異常球菌屬。生物信息學(xué)分析顯示，戈壁異常球菌I-0基因組中Dgo_RS02895基因編碼的蛋白與peptidases_s8_s53蛋白家族序列具有一定相似性。本研究克隆Dgker蛋白基因，并進(jìn)行外源表達(dá)與純化，探索它對(duì)羽毛的降解能力，旨在獲得高比活的角蛋白酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基 野生型戈壁異常球菌（D.gobiensisI-0）為本實(shí)驗(yàn)室保存；高頻轉(zhuǎn)化受體菌大腸桿菌E. coliTop10及表達(dá)菌株E. coliBL21（DE3）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；原核表達(dá)載體pET22b購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。大腸桿菌于LB培養(yǎng)基（1% Typtone，0.5% Yeast extract，1%NaCl，pH 7.0，固體培養(yǎng)基含 1.5% 瓊脂）中 37℃ 培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 常規(guī)質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)自Magen公司；BSA、限制性內(nèi)切酶購(gòu)于 New England Biolabs公 司；PrimeSTAR HSDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、2k plusⅡmarker 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Western blot化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。引物合成和基因測(cè)序均由華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 Dgker蛋白生物信息學(xué)分析 從NCBI中獲取戈壁異常球菌Dgo_RSO2895基因的序列及所編蛋白的氨基酸序列信息。通過Compute pI/Mw tool（http：//web.expasy.org/compute_pi/）對(duì)戈壁菌角蛋白酶蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/網(wǎng)站在線預(yù)Dgker 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過 SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/Services/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽；利用 TMHMMServer v.2. 0（http ：//www. cbs. dtu.dk/services/TM-HMM/）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 Dgker重組E.Coli菌株的構(gòu)建 根據(jù)目的基因Dgker的序列及表達(dá)載體 pET-22b（+）的多克隆位點(diǎn)，利用 Oligo 7 軟件設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增特異性引物Dgker-F（5'-ACCGGATCCGATGAACGGAGTCTTACCCT-3'，下劃線處為BamH Ⅰ 酶切位點(diǎn)）和Dgker-R（5'-ACC CTCGAGGAAGTTCAGGGTGTACAGCA-3'，下劃線處為XhoⅠ 酶切位點(diǎn)），引物序列由北京擎科生物股份有限公司合成。

采用試劑盒提取戈壁異常球菌I-0基因組DNA，測(cè)定其濃度及純度后，以此為模板，用已合成的引物Dgker-F和Dgker-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將 PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)。將目的條帶膠塊用凝膠回收試劑盒回收。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+Plus）10 μL ；2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL；10 μmol/L 上、 下 游 引 物 各 2 μL ；200 ng/μL DNA 模板 2 μL ；2.5 U/μL PrimeSTAR HSDNA 聚合酶 0.5 μL；加 ddH2O 至總體積 50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

將上步回收獲得的 PCR 產(chǎn)物與載體 pET-22b質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ 37℃酶切3 h，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物并回收目的基因及載體的DNA片段，隨后用T4 DNA

Ligase連接，轉(zhuǎn)化E. colitop10感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性克隆菌落。運(yùn)用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，隨后進(jìn)行雙酶切鑒定，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒交由北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21（DE3）獲得重組菌株BL21（pET22b-Dgker）。

1.2.3 重組E.coli菌株誘導(dǎo)表達(dá) 將實(shí)驗(yàn)的重組菌株以及對(duì)照菌株在LB平板上分別劃線過夜培養(yǎng)，從活化的平板上分離單菌落，接種于20 mL含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)作為母液，將母液以1%的接種量加入到100 mL含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基配養(yǎng)2 h左右OD600達(dá)到0.6-0.8加IPTG使終濃度為0.3 mmol/L誘導(dǎo)，37℃誘導(dǎo)4 h。

1.2.4 重組E.coli菌株功能試驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)的重組菌株以及對(duì)照菌株在LB平板上分別劃線過夜培養(yǎng)，從活化的平板上挑取單菌落，接種于20 mL含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)作為母液。將母液以1%的接種量加入到10 mL含有氨芐抗生素的羽毛培養(yǎng)基中37℃ 220 r/min培養(yǎng)，同時(shí)把菌液點(diǎn)在含脫脂奶粉的平板上37℃培養(yǎng)，觀察有無降解圈以及降解圈的變化。

1.2.5 羽毛粉為底物酶活力的測(cè)定 參照蔡成崗［18］測(cè)定角蛋白酶酶活方法，略有改動(dòng)：實(shí)驗(yàn)組10 mg羽毛粉與2 mL Tris-HCl（50 mmol/L pH8.5）混勻，加入1 mL粗酶液30℃反應(yīng)1 h后加入2 mL10%三氯乙酸（TCA）終止反應(yīng)；冰浴10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清紫外分光光度計(jì)測(cè)定280 nm處吸光值?？瞻捉M10 mg羽毛粉與2 mLTris-HCl（50 mmol/L pH8.5）混勻，加入1 mL粗酶液和2 mL10%三氯乙酸（TCA）30℃反應(yīng)1 h后終止反應(yīng)；冰浴10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清紫外分光光度計(jì)測(cè)定280 nm處吸光值。

1.2.6 角蛋白酶最適溫度和最適pH的測(cè)定 用pH8.5的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液混合底物，在不同溫度（20-80℃）下?lián)u床振蕩反應(yīng)1 h測(cè)Dgker的酶活力，由結(jié)果繪制最適溫度曲線。以pH4.0-11.0的緩沖液混合羽毛粉底物，在60℃水浴反應(yīng)1 h測(cè)Dgker的酶活力，根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制Dgker的最適pH曲線。

2 結(jié)果

2.1 Dgker蛋白生物信息學(xué)分析

通過分析戈壁異常球菌基因組發(fā)現(xiàn)，Dgo_RS02895位于D. gobiensisI-0染色體上，Dgker由412個(gè)氨基酸組成，分子量為41.17 kD，等電點(diǎn)（pI）為6.07。在線預(yù)測(cè)Dgker蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，多以α螺旋和卷曲結(jié)構(gòu)存在，對(duì)該蛋白和來自B.licheniformisPWD-1的Ker A蛋白保守性分析，結(jié)果顯示前50左右的氨基酸（圖1-A紅色框內(nèi)）與跨膜結(jié)構(gòu)有關(guān)，成熟蛋白區(qū)（圖1-A紅色括號(hào)內(nèi)）有3個(gè)主要氨基酸分別是171位的天冬氨酸、203位的組氨酸、358位的絲氨酸。氨基酸序列預(yù)測(cè)圖表明該蛋白前端有一段序列形成前導(dǎo)肽（圖1-B），跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果還顯示該蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖1-C），另外對(duì)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬（圖1-D），結(jié)果顯示前50左右的氨基酸并沒有參與主結(jié)構(gòu)的形成，主結(jié)構(gòu)是從第51個(gè)氨基酸開始和模型相似。

2.2 構(gòu)建pET-22b-Dgker表達(dá)載體

以提取的耐輻射異常球菌基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增目的基因，獲得的條帶大小與預(yù)期一致約為1 239 bp（圖2-A）。將回收產(chǎn)物連接pET-22b后轉(zhuǎn)化到E. coliTOP10獲得pET-22b-Dgker重組菌株，對(duì)重組菌株提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖2-A），重組質(zhì)粒8 000 bp左右，雙酶切得到一條1 300 bp左右的目的條帶和一條大于5 000 bp的載體片段。同時(shí)送公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證明目的基因已經(jīng)成功連入表達(dá)載體。

對(duì)Dgker蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)親和層析過柱純化，獲得純化后的蛋白。SDS-PAGE分析結(jié)果（圖2-B）顯示，以僅含空載體pET22b的大腸桿菌和未誘導(dǎo)的重組菌為對(duì)照，0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下出現(xiàn)1條與Dgker蛋白大?。?1.1 kD）吻合的條帶（圖2-B中黑色箭頭所指）。

2.3 Dgker降解羽毛實(shí)驗(yàn)

以O(shè)D 0.1轉(zhuǎn)接種子液于加入羽毛的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察記錄到重組菌株在3 d左右的時(shí)間里把羽毛分解（圖3-A），同時(shí)在奶粉培養(yǎng)基上誘導(dǎo)表達(dá)獲得的重組菌株粗酶液、空載菌株粗酶液出現(xiàn)降解圈的時(shí)間同步（圖3-B），對(duì)比可知含角蛋白基因的重組菌株粗酶液降解能力比空載菌株強(qiáng)，說明角蛋白基因有作用。

圖1 Dgker序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 Dgker酶活最適溫度和pH實(shí)驗(yàn)

用pH8.5的緩沖液，分別在20、30、40、50、60、70和80℃下，測(cè)定Dgker酶活力。如圖（4-A）所示，Dgker的最適溫度是60℃，當(dāng)溫度從20℃上升到60℃時(shí)，Dgker的酶活隨之有上升的趨勢(shì)，60℃到80℃酶活隨溫度升高而降低；溫度在30-50℃之間酶活比較穩(wěn)定，有利于在工業(yè)上應(yīng)用推廣。在60℃條件下，分別在pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的緩沖液測(cè)定Dgker酶活力。由圖4-B可知，Dgker的最適pH是5.0，pH從4.0上升到5.0時(shí)，酶活有個(gè)上升的過程，pH5.0-pH9.0酶活呈變化狀態(tài)總趨勢(shì)是下降。

3 討論

圖2 Dgker驗(yàn)證及純化圖

圖3 Dgker降解羽毛圖

圖4 Dgker在不同溫度、pH下的酶活圖

Dgker蛋白是相對(duì)分子量在30-50 kD的酶類，對(duì)羽毛有一定的分解作用、對(duì)頭發(fā)和蹄分解作用不明顯。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Dgker蛋白分子量為41.1 kD與耐輻射異常球菌的蛋白親緣關(guān)系最近且與同屬蛋白具有較高的序列相似性，是一個(gè)異常球?qū)偬禺愋缘鞍住．惓Ｇ驅(qū)傥⑸锟梢栽跇O端環(huán)境中生存，其擁有非凡的適應(yīng)機(jī)制以抵抗極端環(huán)境造成的損傷。Dgker來源于戈壁異常球菌，該菌分離于戈壁沙漠，推測(cè)其可能更耐酸堿及高溫，對(duì)羽毛處理有重要作用。

目前為止，有關(guān)角蛋白酶的研究多集中在篩選新菌株［19-20］、發(fā)酵和處理?xiàng)l件優(yōu)化［21-22］、基因工程等方面，研究表明角蛋白酶能破壞角蛋白中的二硫鍵［23］和肽鍵，可以在動(dòng)物飼料加工和皮革制品鞣制過程中發(fā)揮重要作用［24］。本研究從戈壁異常球菌中克隆了一個(gè)新的角蛋白酶編碼基因，氨基酸序列前段有前導(dǎo)肽與Wu等［15］在文章中分析的一致，并且在相似的位置形成跨膜結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)的存在對(duì)于蛋白的純化有一定的影響。模擬Dgker的三維結(jié)構(gòu)時(shí)還發(fā)現(xiàn)這個(gè)區(qū)域的氨基酸沒有參與主結(jié)構(gòu)的模擬，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以考慮把它們突變掉觀察酶活性變化，用來提高生產(chǎn)效率。對(duì)Dgker和kerA蛋白保守性分析結(jié)果顯示有很相似的區(qū)域如前導(dǎo)肽、成熟蛋白區(qū)都沒有尾巴結(jié)構(gòu)（C-terminal propeptide［15］），成熟蛋白區(qū)都有 3 個(gè)主要的氨基酸（Asp、His、Ser）在水解角蛋白時(shí)發(fā)揮作用。通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)并純化后的蛋白經(jīng)檢測(cè)具有角蛋白水解活性，該菌株以后可以用于處理廢棄羽毛等，為進(jìn)一步發(fā)掘工業(yè)用角蛋白酶提供了基因資源。實(shí)驗(yàn)得出Dgker粗酶液酶活最適溫度是60℃，此溫度比B.licheniformisPWD-1生長(zhǎng)溫度45-50℃［7］更耐高溫，該蛋白又是在大腸桿菌中表達(dá)方便培養(yǎng)利于生產(chǎn)。Dgker的最適pH是5.0與已知的大多數(shù)蛋白酶最適的值在7.5-10之間相比該蛋白更耐酸有利于生產(chǎn)成本的降低。該基因編碼的前50個(gè)氨基酸對(duì)Dgker的影響將在接下來的工作中進(jìn)行探索［25］，同時(shí)將進(jìn)一步研究Dgker在工業(yè)上的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究確定了戈壁異常球菌（D. gobiensisI-0）中Dgo_RS02895基因編碼的蛋白與peptidases_s8_s53 家族蛋白相似，是角蛋白酶的一種，命名為Dgker。成功構(gòu)建了表達(dá) Dgker 的重組菌株E. colipET22b-Dgker/BL21，降解羽毛實(shí)驗(yàn)表明Dgker有降解羽毛的功能。粗蛋白的酶活測(cè)定結(jié)果表明 Dgker酶活最適溫度在60℃，最適pH是5.0。