牦牛TSHB、DIO2和DIO3基因的克隆及其在繁殖軸的表達(dá)研究

王琴 盧建遠(yuǎn) 字向東

（西南民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

光周期的變化在調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物繁殖方面起著關(guān)鍵的作用。長日照（白天長度＞12 h）繁殖動(dòng)物一般在春季或夏季繁殖，如鳥類和小型嚙齒類動(dòng)物，而有蹄類哺乳動(dòng)物等短日照（白天長度＜12 h）的繁殖動(dòng)物往往將其繁殖季節(jié)限制在前一個(gè)秋季［1］。甲狀腺激素（Thyroid hormone，TH）通過TH中Ⅱ型脫碘酶（Type Ⅱ iodothyronine deiodinase gene，DIO2）和Ⅲ型脫碘酶（Type Ⅲ iodothyronine deiodinase gene，DIO3）基因表達(dá)的相互調(diào)節(jié)來指導(dǎo)季節(jié)性繁殖，該基因表達(dá)在中腦基底下丘腦（Medio-basal hypothalamus，MBH）的室管膜區(qū)中的瞳孔內(nèi)［2］。研究表明，日本鵪鶉垂體結(jié)節(jié)部（Pars tuberalis，PT）分泌的促甲狀腺激素（Thyroid stimulating hormone，TSH）是DIO2、DIO3基因表達(dá)的主要光周期依賴性上游調(diào)節(jié)物［3］。長日照會(huì)誘導(dǎo)PT的TSH生成，增加DIO2表達(dá)并抑制DIO3表達(dá)，從而提高M(jìn)BH中的TH信號(hào)［4］，光周期信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過作用于下丘腦-垂體-性腺（Hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）軸調(diào)節(jié)DIO2、DIO3基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物的生殖活動(dòng)［5］。從眼部輸入的光信號(hào)可通過晝夜節(jié)律起搏器，視交叉上核傳輸?shù)剿晒w，根據(jù)季節(jié)性信號(hào)通過DIO2、DIO3基因轉(zhuǎn)化為褪黑素分泌模式，TSH在管腔中分泌受到褪黑激素分泌的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致下丘腦室管膜細(xì)胞中DIO2、DIO3基因表達(dá)模式的變化，并沿HPG軸誘導(dǎo)神經(jīng)內(nèi)分泌級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)［6］。因此，TSHB-DIO2/DIO3逆向調(diào)控通路在哺乳動(dòng)物季節(jié)性繁殖調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。

牦牛（Bos grunniens）是我國青藏高原及其周邊地區(qū)的珍稀畜種，是世界畜種中分布區(qū)域極少的家畜之一［7］，屬于季節(jié)性繁殖動(dòng)物。但其繁殖性能較低，產(chǎn)犢間隔長，多為三年二胎或三年一胎［8］。為探索TSHB-DIO2/DIO3 逆向調(diào)控通路在牦牛季節(jié)性發(fā)情的調(diào)控機(jī)制及其在HPG軸上的表達(dá)變化，本研究以TSHB、DIO2、DIO3基因?yàn)檠芯繉?duì)象，選取處于發(fā)情期的健康成年母牦牛的下丘腦、垂體、子宮、輸卵管、卵巢等組織作為試驗(yàn)材料，對(duì)TSHB、DIO2、DIO3基因克隆測(cè)序及生物信息學(xué)分析，進(jìn)而通過qPCR技術(shù)檢測(cè)其在HPG軸的表達(dá)情況，并進(jìn)行表達(dá)差異性分析，旨為研究牦牛 TSHB-DIO2/DIO3逆向調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與組織的采集 發(fā)育良好且處于發(fā)情期的健康成年母牦牛5頭，采自四川成都青白江唐家寺屠宰場(chǎng)。屠宰后立即采集牦牛下丘腦、垂體、子宮、輸卵管、卵巢新鮮組織剪碎，用無菌生理鹽水清洗，置于不含RNase 的離心管中，錫箔紙密封后立即投入液氮罐并送至實(shí)驗(yàn)室，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器、試劑 PCR儀（Biometra），熒光定 量 PCR儀（Bio-Rad），Trizol試 劑（Invitrogen），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（MBI），熒光定量試劑盒與pMD-19T載體購自大連寶生物工程公司；Taq聚合酶和感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α購自天根生化科技有限公司；AxyPrepTM DNA Gel Extraction Ki康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因克隆 選用Trizol法提取牦牛各組織總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度，將A260/A280在1.8-2.1之間的RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)GenBank上普通牛TSHB基因序列（NM_174205.1）、DIO2基因序列（AY858551.2）和牛DIO3基因序列（AY858552.1），用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)PCR克隆引物（表1），PCR擴(kuò)增總體系為10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各 1 μL，2×Long Taq PCR Mix 5 μL，cDNA模板1 μL和2 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸 80 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行膠回收，將目的片段與pMD19-T載體連接后，轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布到含有0.1%氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行目的基因檢測(cè)，送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.2 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因生物信息學(xué)分析 通過NCBI中BLAST在線比對(duì)工具檢索TSHB、DIO2、DIO3基因的核苷酸序列，Megalign軟件進(jìn)行同源性比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹。通過開放閱讀框（ORF）預(yù)測(cè)目的基因氨基酸序列，利用ProtParam程序分析蛋白的主要結(jié)構(gòu)及理化參數(shù)，ProtScal程序分析疏水性，SOPMA程序預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 qPCR檢測(cè)組織TSHB、DIO2、DIO3基因表達(dá) 根據(jù)已克隆出的牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（表2），內(nèi)參基因選用GAPDH，檢測(cè)各基因表達(dá)量。反應(yīng)總體系為20 μL ：Green Supermix 10 μL、上下游引物各 0.5 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 2 min；變性95℃ 10 s，退火 58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

表1 引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長度

表2 定量PCR引物序列及產(chǎn)物長度

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以垂體的Ct值為參考對(duì)牦牛各組織的差異定量分析，采用比較閾值法（2-ΔΔCt法）進(jìn)行相對(duì)定量分析，通過LSD法進(jìn)行其差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因的克隆

PCR擴(kuò)增獲得417 bp、951 bp、874 bp大小的條帶（圖1），經(jīng)NCBI ORF在線程序比對(duì)分析，獲得TSHB基因的CDS區(qū) 417 bp，編碼139個(gè)氨基酸；DIO2基因的CDS區(qū)為951 bp，編碼132個(gè)氨基酸；DIO3基因CDS區(qū)為874 bp，編碼278個(gè)氨基酸。將cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列通過BankIt提交NCBI，登錄號(hào)分別為MH598976、MH598977和MH598978。

2.2 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因生物信息學(xué)分析

圖 1 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因擴(kuò)增結(jié)果

ProtParam結(jié)果表明，牦牛TSHB、DIO2、DIO3蛋 白 的 分 子 式 分 別 為 C700H1071N173O200S21、C648H1036N172O191S6和C1407H2178N398O408S13，相對(duì)分子量分別為15783.50、14484.75和31613.97，理論等電點(diǎn)分別為8.19、6.26和6.07，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中半衰期均為30 h，不穩(wěn)定參數(shù)分別為46.33、50.10和59.00，三者均屬于不穩(wěn)定蛋白；脂溶性系數(shù)依次為63.88、104.77、84.86，ProtScal分析其疏水性平均值為0.066、0.173、-0.304，預(yù)測(cè)TSHB和DIO2蛋白為疏水性蛋白，DIO3蛋白為親水性蛋白；TMPRED分析3個(gè)蛋白均無跨膜結(jié)構(gòu)；SOPMA分析二級(jí)結(jié)構(gòu)：TSHB主要由無規(guī)卷曲組成，占53.96%，并含有α-螺旋，β-折疊和延伸鏈；DIO2二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成，占44.70%，并含有延伸鏈和無規(guī)卷曲；DIO3二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成，占46.76%，并含有延伸鏈、β-折疊和無規(guī)卷曲。

2.3 同源性比較

通過NCBI中BLAST在線比對(duì)工具對(duì)來自其他物種的TSHB、DIO2、DIO3基因的核苷酸序列進(jìn)行比較和搜索，Megalign軟件同源性比對(duì)：牦牛TSHB基因同源性與各物種都很近，均在90%以上，其中與普通牛（Bos taurus）最近，達(dá)98.8%，說明該基因具有高度保守性；牦牛DIO2基因與普通牛同源性最高，達(dá)99.7%，牦牛DIO3基因也與普通牛的同源性最高達(dá)99.8%，山羊（Capra hircus）97.5%。

Megalign軟件構(gòu)建TSHB、DIO2、DIO3基因物種進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2-圖4，其中牦牛的序列前用▲表示，可見牦牛TSHB基因，普通牛（NM_174205.1）和牦牛聚為一類，再與綿羊（X90775.1）、山羊（NM_001287576.1）聚為一類，與物種進(jìn)化一致；牦牛DIO2基因，普通牛（AY858551.2）和牦牛聚為一類，再與綿羊（GQ468498.1）、山羊（XM_018053898.1）聚為一類；牦牛DIO3基因和普通牛（AY858552.1）聚為一類，再與山羊（KJ184352.1）、綿羊（AY656759.1）聚為一類，與其遺傳進(jìn)化規(guī)律相符。

圖 2 TSHB基因核苷酸進(jìn)化樹分析

圖 3 DIO2基因核苷酸進(jìn)化樹分析

圖 4 DIO3基因核苷酸進(jìn)化樹分析

2.4 TSHB、DIO2、DIO3基因的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TSHB、DIO2、DIO3基因在牦牛各組織中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5-7，TSHB基因在垂體組織中的表達(dá)水平高于其他組織，差異極顯著（P＜0.01）；在下丘腦、卵巢、子宮和輸卵管中表達(dá)水平較低；DIO2基因在各組織中均有表達(dá)，在子宮的表達(dá)水平高于其他組織，差異極顯著（P＜0.01），卵巢的表達(dá)水平顯著高于垂體、下丘腦和輸卵管（P＜0.05）；DIO3基因在子宮組織未檢測(cè)到表達(dá)，卵巢組織表達(dá)水平高于垂體、下丘腦和輸卵管，差異極顯著（P＜0.01）。

圖 5 TSHB基因在垂體、下丘腦、卵巢、子宮和輸卵管組織的表達(dá)水平

圖 6 DIO2基因在垂體、下丘腦、卵巢、子宮和輸卵管組織的表達(dá)水平

圖7 DIO3基因在垂體、下丘腦、卵巢、子宮和輸卵管組織的表達(dá)水平

3 討論

研究表明，TSH亞基基因TSHB在垂體TH中的表達(dá)主要通過甲狀腺激素脫碘酶基因DIO2、DIO3和下丘腦PT促甲狀腺激素釋放激素來調(diào)節(jié)［9］。本研究克隆了牦牛TSHB基因，編碼區(qū)cDNA序列長417 bp，編碼 138 個(gè)氨基酸，與山羊［10］、綿羊［9］等物種一致；測(cè)序結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)分析可知，TSHB蛋白為不穩(wěn)定疏水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由延伸鏈和無規(guī)卷曲組成；通過同源比對(duì)，牦牛TSHB基因與其他8個(gè)物種的同源性均在90%以上，其中與普通牛的最近，高達(dá)98.8%，說明該基因具有高度保守性；進(jìn)化樹結(jié)果表明，牦牛和普通牛、山羊、綿羊有著最近的分子進(jìn)化關(guān)系，該結(jié)論和山羊的研究一致［9］。目前對(duì)綿羊［9］、山羊［10］、大鼠［11］、小鼠［12］等動(dòng)物的研究表明TSHB基因主要在垂體中表達(dá)，這與本研究TSHB基因在牦牛HPG軸的表達(dá)情況一致，表明TSHB基因在牦牛HPG軸組織中發(fā)揮重要作用，該基因在垂體的高表達(dá)量與牦牛的季節(jié)性繁殖密切相關(guān)。

DIO2和DIO3基因表達(dá)的變化與動(dòng)物繁殖狀態(tài)的季節(jié)性變換顯著相關(guān)，通過去碘作用，DIO2可以將四碘甲狀腺原氨酸（Thyroxine，T4）轉(zhuǎn)化為生物活性更強(qiáng)的三碘甲狀腺原氨酸（Triiodothyronine，T3），而DIO3將催化T4和T3分別轉(zhuǎn)化為其生物活性代謝物三碘甲狀腺原氨酸和二碘甲狀腺原氨酸［13］。通過調(diào)節(jié)TH水平，DIO2和DIO3基因在許多物種的光周期反應(yīng)相關(guān)的季節(jié)性繁殖調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究克隆了牦牛DIO2基因，獲得了951 bp的cDNA，編碼132個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子（TGA）；測(cè)序結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)分析可知，DIO2為不穩(wěn)定疏水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成；DIO2是一種硒蛋白，其SeCys（U）殘基的活性位點(diǎn)由TGA編碼［14］，SeCys殘基上的硒氫基團(tuán)參與機(jī)體的激素調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過程［15］，提示可能與DIO2、DIO3相互轉(zhuǎn)化相關(guān)。對(duì)牦牛DIO2基因進(jìn)行同源性比對(duì)同時(shí)構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，該基因與普通牛同源性最高，符合進(jìn)化關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)嚙齒動(dòng)物DIO2基因主要表達(dá)于下丘腦［16-17］，小腦［18］、甲 狀 腺［19］、以及睪丸等組織［20］，同時(shí)有研究表明，DIO2在包括人類在內(nèi)的多種動(dòng)物中均可表達(dá)［18-21］，這可能與甲狀腺激素功能廣泛有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，該基因在牦牛5個(gè)組織均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，這與前述各種動(dòng)物DIO2廣泛表達(dá)相似，也與在山羊各組織的表達(dá)水平研究一致［22］。目前對(duì)DIO2基因組織表達(dá)主要集中在嚙齒動(dòng)物和鳥類的下丘腦、小腦、甲狀腺、睪丸、子宮。本研究首次對(duì)牦牛HPG軸組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因在HPG軸廣泛表達(dá)，其中在子宮的表達(dá)量高于其他組織。Detti等［21］對(duì)人類子宮內(nèi)膜的研究發(fā)現(xiàn)，DIO2基因在誘導(dǎo)排卵的婦女子宮內(nèi)膜早期蛻膜分化過程中的表達(dá)量顯著低于發(fā)育正常的子宮內(nèi)膜，推測(cè)DIO2基因可能對(duì)牦牛子宮也具有調(diào)控作用。

本研究克隆了牦牛的DIO3基因，獲得873 bp的cDNA，編碼278個(gè)氨基酸和一個(gè)終止子（TAA）；生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，DIO3蛋白為不具有跨膜結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定親水蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成。研究發(fā)現(xiàn)，DIO3 基因在大鼠小腦［23］、大腦皮層［24］和海馬［25］及心肌細(xì)胞［26］中表達(dá)，還有研究發(fā)現(xiàn)DIO3在早期妊娠小鼠子宮內(nèi)膜、鳥類［18-19］和綿羊［16］下丘腦以及人的胎盤均有表達(dá)［27-28］。本研究通過qPCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DIO3主要表達(dá)于牦牛HPG軸上卵巢、垂體和輸卵管組織，且卵巢組織表達(dá)量高于其他組織。在下丘腦和子宮中僅有微弱表達(dá)，該結(jié)論和DIO3基因在季節(jié)性發(fā)情的遼寧青山羊組織表達(dá)中保持一致［22］，表明DIO3基因在牦牛HPG軸組織中發(fā)揮重要作用。以上研究表明，DIO2、DIO3基因在調(diào)節(jié)季節(jié)性繁殖活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

本研究成功克隆出牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因cDNA序列，片段大小分別為417 bp、951 bp和874 bp，編碼139、132和278個(gè)氨基酸。TSHB基因在垂體中的表達(dá)量高于下丘腦、卵巢、輸卵管和子宮；DIO2基因在檢測(cè)組織中均有表達(dá)，并且在子宮中的表達(dá)量高于其他4個(gè)組織；DIO3基因在子宮組織中未檢出，卵巢組織的表達(dá)量高于垂體、下丘腦和輸卵管。