環(huán)境條件對植物乳桿菌降解生物胺的影響

李 春 段春影 張國芳 劉麗波 趙麗雙 呂秋月

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江150030）

生物胺作為一種含氮的低分子質(zhì)量生物活性胺，主要由特殊的生物胺脫羧酶，通過轉(zhuǎn)化特定的氨基酸形成對應(yīng)的生物胺[1]。生物胺在體內(nèi)具有特定的生理活性，過量攝入外源生物胺，則會引起諸如頭痛、惡心、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等過敏反應(yīng)[2]，甚至?xí)霈F(xiàn)腦出血和死亡[3]。許多研究將某些生物胺作為產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)，如Tasic 等[4]將生物胺含量作為傳統(tǒng)發(fā)酵干香腸品質(zhì)優(yōu)良的一個重要指標(biāo)。

研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵時，生物胺的濃度下降了24%[5-6]，進(jìn)一步添加植物乳桿菌的劑量對總生物胺的產(chǎn)量有進(jìn)一步影響[7-8]。Latorre[9]對發(fā)酵香腸的研究表明，游離氨基酸的含量是發(fā)酵過程中生物胺形成的限制性因素。同時有研究表明乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）對色胺、 苯乙胺、 組胺和酪胺降解能力最強(qiáng)達(dá)到51.4%，56.71%，40.86%和24.59%[10]；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus） 對生物胺具有降解能力，其中對亞精胺的降解能力最大，為28.99%，其次是腐胺，為24.54%，對苯乙胺、組胺、酪胺和精胺的降解率分別為14.44%，20.09%，14.21%和7.81%[11]。

生物胺的降解的方法引起廣泛關(guān)注[12]。植物乳桿菌屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，最適生長溫度范圍為30～35 ℃。最適pH 值為6.5 左右，屬于同型發(fā)酵乳酸菌[13]。研究表明植物乳桿菌（L.plantarum）具有降解某些生物胺的作用[14]。本文研究植物乳桿菌在不同pH 值、溫度、NaCl 濃度以及乙醇濃度條件下對3 種生物胺降解的影響，并分析生物胺降解是否與菌種的生長有關(guān)，從而得出生物胺降解與菌株的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株為植物乳桿菌KLDS09004，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。MRS培養(yǎng)基；乙腈、丙酮均為色譜純級、高氯酸、NaOH、NaHCO3、氨水均為分析純級，中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；丹磺酰氯 （CAS#605-65-2，純度≥98%）、組胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CAS#52-45-6，GC≥98%）、尸胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CAS#462-94-2，GC≥98%）、腐胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CAS#333-93-7，T≥98%），sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100 液相色譜儀（配紫外檢測器），美國Agilent 公司；Sonice ＆ materials VCX500 超聲波清洗儀，美國Sonics ＆ Materials，Inc 公司；TGL-16G 型高速離心機(jī)離心機(jī)，上海中科華辰有限公司；LG-1002-A 超凈工作臺，蘇州真田潔凈設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化 將KLDS 09004 于-20 ℃冷凍保存，使用前將凍存菌按2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種到100 mL 的MRS 培養(yǎng)基中，振蕩均勻，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，傳代活化2 次，保證菌數(shù)約為108CFU/mL，備用。

1.3.2 3 種生物胺含量變化的測定

1.3.2.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液（1 mg/mL）的組胺、尸胺、腐胺用0.4 mol/L 的高氯酸溶液稀釋，系列質(zhì)量濃度分別為0.5，1，2，5，10，20 mg/L，按照衍生方法進(jìn)行衍生和測定，每個濃度至少重復(fù)測定3 次，以平均值計(jì)算。以峰面積與對應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算。

1.3.2.2 色譜條件 參考陸永梅等[15]的方法并加以修改，采用色譜柱為Hypersil ODS2 5 μm C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）流速為1.00 mL/min，紫外檢測波長為254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。流動相為乙腈∶水=3∶2。

1.3.2.3 衍生 將1 mL 的樣品液加入400 μL 1 mol/L 的NaOH，然后加入300 μL 的飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，再加入2 mL 用5 mg/mL 丙酮溶液配制的丹磺酰氯溶液，在60 ℃的水浴中避光反應(yīng)30 min 后取出，加入100 μL 氨水中斷反應(yīng)，去除多余的丹磺酰氯，最后加入2 mL 乙腈，靜止30 min，將其用0.45 nm 的濾膜過濾器過濾后待測，濾液可直接進(jìn)HPLC 測定[16-17]。

1.3.2.4 樣品前處理 稱取2.5 mL 發(fā)酵液，用0.4 mol/L 的高氯酸溶液將發(fā)酵樣品于容量瓶中定容到25 mL，取1 mL 按照衍生方法進(jìn)行衍生待測。

1.3.3 不同條件下生物胺的降解

1.3.3.1 pH 值對3 種胺降解及菌種生長情況的影響 配制pH 3.0～10.0 的緩沖液：pH 3.0～5.0，0.1 mol/L 檸檬酸，0.1 mol/L 檸檬酸鈉；pH 6.0～8.0，0.1 mol/L KH2PO4，0.1 mol/L NaOH；用這些緩沖液分配制MRS 培養(yǎng)基，然后用1 mol/L NaOH和HCl 調(diào)節(jié)pH 值到相應(yīng)的緩沖液pH 值。菌株活化3 次，按2%的接種量接種于pH 值分別為4.0，5.0，6.0，6.5，7.0，7.5 的液體MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h 后測定660 nm 波長下的吸光值。4 000×g 離心10 min，然后分別取1 mL 上清液加入0.4 mol/L 高氯酸1 mL，進(jìn)行衍生待測。不同pH 值條件下培養(yǎng)24 h 進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.3.2 溫度對3 種胺降解及菌種生長情況的影響 菌株經(jīng)液體活化3 次，取活化好的種子液以2%的接種量接種于液體MRS 培養(yǎng)基中，分別在25，30，37，40 ℃和45 ℃下培養(yǎng)12 h 后，測定660 nm 波長下的吸光值。4 000×g 離心10 min，然后分別取1 mL 上清液加入0.4 mol/L 高氯酸1 mL，進(jìn)行衍生待測。不同溫度下培養(yǎng)24 h，菌落計(jì)數(shù)。

1.3.3.3 乙醇含量對3 種胺降解及菌種生長情況的影響 菌株經(jīng)液體活化3 次，取活化好的種子液以2%的接種量分別接種于乙醇體積分?jǐn)?shù)為0，1%，2%，3%，4%，5%的液體MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h 后測定660 nm 波長下的吸光值。然后分別取1 mL 菌液加入0.4 mol/L 高氯酸1 mL，于-20 ℃冰箱中保存、衍生，待測。不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下培養(yǎng)24 h 進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.3.4 NaCl 含量對3 種胺降解及菌種生長情況的影響 取活化好的種子液以2%的接種量分別接種于NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，1%，2%，3%，4%，5%，6%的液體MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h 后測定660 nm 波長下的吸光值。4 000×g 離心10 min，然后分別取1 mL 上清液加入0.4 mol/L 高氯酸1 mL，衍生待測。不同NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下培養(yǎng)24 h 進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所有測定結(jié)果取3 次重復(fù)測定的平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Microsoft Excel 2003 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

在該試驗(yàn)建立的色譜條件下，以3 種生物胺色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以相對應(yīng)的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，3 種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.5～20 mg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，由圖1可以看出峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，其組胺、腐胺、尸胺的線性回歸方程分別為yz=22.89x+729.24 R2=0.997；yf=25.29x+731.08 R2=0.998；ys=31.21x+723.42 R2=0.997。

圖1 不同生物胺含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curves of concentration of different biogenic amines

2.2 不同條件對菌種生長情況的影響

2.2.1 pH 值對供試菌株生長情況的影響 從圖2可以看出其它條件不變的情況下，不同pH 值對植物乳桿菌的生長有顯著影響，總體趨勢隨著pH值的遞增菌種活力呈先增大后減小的趨勢，菌落數(shù)與之保持一致的趨勢，最適pH 值為6.5，此時的OD660= 1.795，菌落數(shù)達(dá)到最大為2.76×1010CFU/mL。當(dāng)pH 值大于6.5 時，OD 值隨著pH 值的增加逐漸減小?？梢缘贸龉┰嚲甑淖钸mpH 值為6.5。

2.2.2 溫度對供試菌株生長情況的影響 從圖3可以看出，其它條件不變的情況下，菌落數(shù)與菌種的生長情況保持一致。不同溫度對植物乳桿菌的生長有顯著影響，總體趨勢隨著溫度的增加菌株生長活性以及菌落數(shù)均呈先增加后降低的趨勢，由圖可知37 ℃下菌株的生長活性最好，OD660=1.764，菌落數(shù)達(dá)到2.9×1010CFU/mL，當(dāng)溫度超過37 ℃時，菌株的生長活性也隨之下降。所以供試菌株的發(fā)酵溫度最適為37 ℃。

圖2 pH 值對菌株的生長狀況的影響Fig.2 Effect of pH on the growth conditions of the strain

圖3 溫度對菌株生長狀況的影響Fig.3 Effect of temperature on the growth conditions of the strain

2.2.3 乙醇含量對供試菌株生長情況的影響在其它條件不變的情況下，由圖4可以看出，乙醇的添加量對植物乳桿菌的發(fā)酵也有影響。由圖可知，無論是菌株的生長情況還是對應(yīng)條件下的菌落數(shù)有相同的變化趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在0～2%之間，供試菌株的生長活性與菌落數(shù)均呈先增大后減小的趨勢，且在2%時達(dá)到最大，分別為2.421和2.87×1010CFU/mL。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于2%時，菌落數(shù)和菌株的生長情況均受到抑制。這可能是當(dāng)乙醇含量達(dá)到一定量時，對菌體的細(xì)胞有一定的刺激作用；當(dāng)乙醇含量大于一定量時，這種刺激受到抑制。

2.2.4 NaCl 含量對供試菌株生長情況的影響在其它條件不變的情況下，由圖5可以看出供試菌株隨著NaCl 含量的增加，菌株的總體生長以及對應(yīng)條件下菌落數(shù)均呈先增加后降低的趨勢，在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2%時，菌種的生長情況和菌落數(shù)均達(dá)到最大，分別為OD660=2.308，2.98×1010CFU/mL，當(dāng)NaCl 達(dá)到一定含量時，菌落數(shù)和菌株的生長活性均受到抑制，其原因可能是NaCl 對菌株的細(xì)胞膜有一定的刺激作用。

圖4 乙醇含量對菌株生長狀況的影響Fig.4 Effect of ethanol content on growth conditions of the strain

圖5 NaCl 含量對菌株生長狀況的影響Fig.5 Effect of NaCl content on the impact of the growth of the strain condition

2.3 不同條件對3 種生物胺降解的影響

2.3.1 pH 值對3 種生物胺降解的影響 從圖6可以看出，組胺和腐胺的降解在不同pH 值條件下存顯著性差異，尸胺的降解在pH 4 和pH 7.5時，分別與pH 5，6，6.5，7 的差異顯著（P＜0.05）。3種生物胺的降解情況，由圖可以清晰的看出pH 6.5 時，3 種生物胺的降解達(dá)到最大，組胺、腐胺、尸胺的降解率分別為23.76%，25.82%，23.77%，而在pH 4 和pH 7.5 時降解率較小，因此可以得出生物胺的降解與pH 值有明顯的關(guān)系。

2.3.2 溫度對3 種生物胺降解的影響 從圖7可以看出，組胺和腐胺的降解在不同溫度下分別表現(xiàn)出顯著差異，40 ℃和45 ℃下尸胺的降解與其它溫度下尸胺的降解差異顯著（P＜0.05）。由圖可以看出，不同溫度對生物胺的降解也有明顯影響，總體趨勢隨著溫度的升高生物胺不斷降解。當(dāng)溫度超過37 ℃時，生物胺的降解率降低；在溫度為37℃時，3 種生物胺降解達(dá)到最大，組胺、腐胺、尸胺分別為22.12%，24.22%，23.02%，因此生物胺的降解也受外界環(huán)境溫度的影響。

圖6 pH 值對3 種生物胺降解的影響Fig.6 Effect of pH on the degradation of histamine

圖7 溫度對生物胺降解的影響Fig.7 Effect of temperature on the degradation of biogenic amines

2.3.3 乙醇含量對3 種生物胺降解的影響 乙醇達(dá)到一定含量時，能夠使生物胺的降解率達(dá)到最大。本研究考察了乙醇含量對植物乳桿菌降解3種生物胺的影響（圖8），與不含乙醇的體系相比，總體趨勢是先增大后減小。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到2%時，菌種對3 種生物胺的降解率達(dá)到最大，組胺、腐胺、尸胺的降解率分別為23.68%，24.65%，21.89%；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于2%時，3 種生物胺的降解率均低于15%；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于3%時，菌株對3 種生物胺的降解率幾乎在8%左右。由此可得出供試菌種的乙醇體積分?jǐn)?shù)在2%時，發(fā)揮較好的生物胺降解作用。由圖也可以看出，每種生物胺在不同的乙醇含量下分別表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）。

2.3.4 NaCl 含量對3 種生物胺降解的影響 由圖9可以清晰的看出3 種胺在不同NaCl 含量條件下的降解情況，總體趨勢先增加后減小，在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～2%時，都得到很好的降解。在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時達(dá)到最大，組胺、腐胺、尸胺的降解率分別為23.77%，24.62%，21.98%。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%時，降解率明顯下降，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時，分別為9.56%，10.12%，11.11%，這種情況可能是由于一定含量的NaCl 改變了細(xì)胞膜的通透性，當(dāng)大于一定含量時又會抑制細(xì)胞膜的通透性，從而抑制菌株活性。由圖可以看出每種生物胺之間，不同NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)下分別表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。

圖9 NaCl 含量對生物胺降解的影響Fig.9 Effect of NaCl content on the degradation of biogenic amines

3 討論與結(jié)論

乳酸菌作為自然界中普遍存在的一類菌，是人和動物體內(nèi)重要的生理細(xì)菌。有研究表明某些乳酸菌在氨基酸脫羧酶的作用下產(chǎn)生生物胺類物質(zhì)[18]，影響其在食品中的應(yīng)用。有研究表明乳酸菌具有降解生物胺的能力，故有必要對乳酸菌產(chǎn)生物胺的能力和降解生物胺的能力進(jìn)行評價[19]。試驗(yàn)結(jié)果表明植物乳桿菌的生物胺降解能力受到一些條件影響，所表現(xiàn)的降解能力也有些不同，這與國外研究結(jié)果一致[20]。

目前，國內(nèi)外研究人員分離出一些具有生物胺降解能力的菌種，?pika[21]研究表明泡菜中添加植物乳桿菌能顯著降低酪胺、尸胺和腐胺的含量。Almudena[22]從酒中分離出85 株乳酸菌，其中25%的菌株能降解組胺，18%能降解酪胺，18%能降解腐胺。

劉玉晗[23]的相關(guān)研究表明，生物胺的降解受溫度、pH 值、 鹽濃度、 乙醇濃度等其它因素的影響，研究表明24 株乳酸菌中[24]，對色胺、苯乙胺、組胺和酪胺降解能力最強(qiáng)的為乳酸片球菌達(dá)到了51.4%，56.71%，40.86%和24.59%；乳酸片球菌對6 種生物胺具有降解能力，其中對亞精胺的降解能力最強(qiáng)，為28.99%，其次是腐胺，為24.54%，對苯乙胺、組胺、酪胺和精胺的降解率分別為14.44%，20.09%，14.21%和7.81%。

以上結(jié)果與相關(guān)學(xué)者研究生物胺在不同條件下的降解程度不同的結(jié)果相一致，綜上所述，菌株的生長狀況與生物胺的降解率保持相似的狀況。此種情況是否與菌種細(xì)胞內(nèi)的酶有關(guān)或者與某一個基因有關(guān)還需要進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)研究供試菌株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 降解生物胺以及對其生長狀況，主要通過研究溫度、pH 值、 乙醇含量、NaCl 含量對植物乳桿菌對生物胺降解率的影響，并探究其降解率是否與菌株的生長狀況有關(guān)。本試驗(yàn)得出該植物乳桿菌在不同因素下表現(xiàn)出不同的生長狀況，同時生物胺的降解情況對不同條件下菌種的生長狀況有顯著性影響。

綜上所述，可以利用植物乳桿菌對生物胺的降解作用，將其用于發(fā)酵制品中，以減少發(fā)酵食品中生物胺的含量。