乳鐵蛋白水解物及其類蛋白反應(yīng)修飾產(chǎn)物在低硝茶腸加工中的應(yīng)用

馬春敏 戚莉佳 陳芳芳 龐佳楠 李鐵晶，2*

（1 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 哈爾濱150030 2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030）

牛乳鐵蛋白肽具有抗菌、抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等一系列生物活性[1]，成為目前研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。乳鐵蛋白在酸性條件下經(jīng)胃蛋白酶水解，從N 端釋放的一段多肽稱為乳鐵素。乳鐵素最早由Bellamy 等[2]分離得到并將這段多肽命名為L(zhǎng)actoferricin B，簡(jiǎn)稱LfcinB。目前，乳鐵蛋白的研究主要針對(duì)乳鐵素的分離純化、生物學(xué)功能、結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制和類蛋白反應(yīng)的研究。孫玥等[3]對(duì)乳鐵蛋白水解物的制備及其修飾物的抑菌作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，精氨酸與色氨酸修飾的乳鐵蛋白水解物的類蛋白反應(yīng)產(chǎn)物抑菌活性較修飾之前有顯著提高。另外，國(guó)內(nèi)外也對(duì)乳鐵蛋白肽的抑菌機(jī)制做了大量研究。Strom 等[4]通過(guò)基因技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)LfcinB 中色氨酸的數(shù)目增加時(shí)，其抑菌性也有所增加。Hilchie 等[5]認(rèn)為L(zhǎng)fcinB 抑菌活性的中心在色氨酸或者精氨酸集中的區(qū)域。牛乳鐵蛋白肽對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌有廣譜的抗菌殺菌能力[6]，被認(rèn)為在食品防腐、延長(zhǎng)食品保質(zhì)期方面具有很好的應(yīng)用前景，然而目前還沒(méi)有將乳鐵蛋白水解物及其類蛋白反應(yīng)修飾產(chǎn)物添加到食品中的應(yīng)用研究。

亞硝酸鹽在肉制品中起發(fā)色，抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的作用，同時(shí)還可以轉(zhuǎn)化成亞硝胺，引起急性和慢性疾病，如高鐵血紅蛋白血癥、甲狀腺疾病和癌變[7]。減少肉制品中亞硝酸鹽的含量，或者找到代替使用亞硝酸鹽的方法，成為肉制品研究的熱點(diǎn)。豬肉香腸類制品容易被微生物污染而腐敗、變質(zhì)，出現(xiàn)讓人不能接受的感官性狀，甚至引起食源性疾病[8-9]。添加抑菌物質(zhì)抑制食源性致病菌的生長(zhǎng)是替代腸類制品中亞硝酸鹽的重要途徑之一。目前，研究較深入的抑菌替代物包括：乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀及其鹽、乳酸菌等。然而，目前仍存在替代物抗菌譜窄或者不穩(wěn)定等缺點(diǎn)[10]。本文研究乳鐵蛋白水解物及其外源氨基酸修飾產(chǎn)物在低硝茶腸加工中的應(yīng)用，以期為生產(chǎn)低亞硝酸鹽的灌腸類制品提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳鐵蛋白，新西蘭Westland Milk Products 公司；胃蛋白酶，中國(guó)惠世生化試劑有限公司；色氨酸甲酯鹽酸鹽，阿拉丁試劑股份有限公司；鄰苯二甲醛（OPA），中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；十二烷基磺酸鈉（SDS），美國(guó)Sigma 公司；β-巰基乙醇，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氯化鈉、氯化鉀、可溶性淀粉，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；亞硝酸鈉，天津福晨食品添加劑廠（食品級(jí)）；檸檬酸，天津市福晨化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。水解酪蛋白，美國(guó)Sigma 公司；牛肉膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha 1-4 中型凍干機(jī)，德國(guó)Matin Christ 公司；LG-21M 高速冷凍離心機(jī)，上海市離心機(jī)械研究所；HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；DELTA320 型pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-98-II A 型恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；BIO-RAD 680酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD 公司；手提式滅菌鍋，上海醫(yī)用核子儀器廠；ZHOH-1109 無(wú)菌操作臺(tái)，上海毅聽(tīng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；WD-9405B 型水平搖床，北京市六一儀器廠；電動(dòng)絞肉機(jī)，上海一恒科技有限公司；真空灌腸機(jī)，華興機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 菌種與培養(yǎng)基

大腸桿菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。將保存在甘油中的大腸桿菌在無(wú)菌條件下接入MH 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)使菌種活化，菌液充分恢復(fù)活力備用。

MH 培養(yǎng)基：牛肉膏2.0 g，可溶性淀粉1.5 g，水解酪蛋白17.5 g，溶于1 000 mL 水中，調(diào)節(jié)pH值至7.4，溶解后高壓滅菌鍋中滅菌 （121 ℃，15 min）備用。

1.4 性質(zhì)試驗(yàn)

1.4.1 乳鐵蛋白水解物的制備 在孫玥等[3]已有的水解條件下略做改動(dòng)。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的乳鐵蛋白水溶液，調(diào)節(jié)pH 值至2.5±0.1。胃蛋白酶活力與乳鐵蛋白濃度比（E/S）是1.0 kU/g，調(diào)節(jié)pH值至2.5±0.1 后，37 °C 水浴條件下水解4 h。反應(yīng)結(jié)束后80°C 滅酶15 min，pH 值調(diào)至5.0±0.1。再4°C 冷凍離心（17 000×g）15 min，收集上清，冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 乳鐵蛋白水解物的色氨酸修飾產(chǎn)物的制備按照孫玥等[3]的研究方法制備。LHs 的質(zhì)量濃度為40%，色氨酸按照游離氨基含量與總游離氨基比為0.7 添加，胃蛋白酶與底物濃度比為2.0 kU/g，反應(yīng)pH 值為5.0，反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)時(shí)間12 h。反應(yīng)結(jié)束后貯存于-20 ℃并冷凍干燥保存。

1.4.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用凱氏定氮法，參考AOAC（第18 版）[11]。

1.4.4 游離氨基含量的測(cè)定 采用鄰苯二甲醛（OPA）法，測(cè)定游離氨基含量[12]。

1.4.5 抑菌性的測(cè)定 抑菌性的測(cè)定采用微量稀釋法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌菌液，用MH 培養(yǎng)基逐級(jí)稀釋至105CFU/mL 待用。將抑菌物質(zhì)配制成一定濃度的溶液，用0.22 μm 的醋酸纖維素膜過(guò)濾。將一定濃度的50 μL 已過(guò)濾除菌的抑菌物質(zhì)在96 孔板中梯度稀釋后，再加入50 μL 稀釋好的菌液，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定其在630 nm 波長(zhǎng)處的吸光值OD0；同時(shí)，加入50 μL 無(wú)菌生理鹽水和50 μL 稀釋好的菌液，相同條件下孵育，測(cè)定630 nm 波長(zhǎng)處的吸光值為OD1；加入50 μL 無(wú)菌生理鹽水和50 μL MH 培養(yǎng)基溶液，相同條件下孵育，測(cè)定630 nm 波長(zhǎng)處的吸光值為OD2。每組試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)平行，重復(fù)3 次。以上試驗(yàn)均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，單次測(cè)定時(shí)間控制在15 min 以內(nèi)。抑菌率計(jì)算公式如下：

式中，OD0——添加抑菌物質(zhì)的大腸桿菌生長(zhǎng)體系吸光值；OD1——未添加抑菌物質(zhì)的大腸桿菌生長(zhǎng)體系吸光值；OD2——培養(yǎng)基和無(wú)菌生理鹽水的吸光值。

1.4.6 溫度對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌率的影響 將一定濃度的抑菌物質(zhì)用0.22 μm 的醋酸纖維素膜過(guò)濾除菌后，在55，65，75，85 ℃和95 ℃條件下分別水浴加熱處理5 min 后，立即置于冰桶中，用于測(cè)定不同溫度處理?xiàng)l件下抑菌物質(zhì)的抑菌活性。抑菌活性測(cè)定方法同1.4.5。試驗(yàn)過(guò)程中控制抗菌物質(zhì)的終質(zhì)量濃度為其最小抑菌質(zhì)量濃度200 mg/mL。

1.4.7 pH 對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌率的影響 配制pH 值為4，5，6，7，8 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，用不同pH 值的緩沖溶液配制一定濃度的抑菌物質(zhì)。具體參照1.4.5 的抑菌性測(cè)定方法，測(cè)定不同pH 值處理?xiàng)l件下抑菌物質(zhì)的抑菌活性。以不加抑菌物質(zhì)的不同pH 值的緩沖溶液為對(duì)照，測(cè)定其抑菌性。試驗(yàn)過(guò)程中控制抗菌物質(zhì)的終質(zhì)量濃度為其最小抑菌質(zhì)量濃度200 mg/mL。

1.4.8 離子濃度對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌率的影響 配制不同濃度的氯化鈉、氯化鉀溶液，用其配制一定濃度的抑菌物質(zhì)。具體參照1.4.5 的抑菌性測(cè)定方法，測(cè)定3 種離子在不同離子濃度處理?xiàng)l件下，抑菌物質(zhì)的抑菌活性。使氯化鈉、氯化鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%。以不加抑菌物質(zhì)的不同濃度氯化鈉、氯化鉀的處理組作為對(duì)照，測(cè)定其抑菌性。試驗(yàn)過(guò)程中控制抗菌物質(zhì)的終質(zhì)量濃度為其最小抑菌質(zhì)量濃度200 mg/mL。

1.5 抑菌物質(zhì)在茶腸中的應(yīng)用

1.5.1 茶腸制作的工藝流程及要點(diǎn) 原料肉→斬拌→滾揉→灌腸→打卡→煮制（90 min）→冷卻→成品。

斬拌機(jī)轉(zhuǎn)速4 000 r/min，保證肉餡的顏色均一，灌腸時(shí)保持腸的松緊度一致。斬拌過(guò)程中先加肉餡1 500 g，再加輔料：胡椒粉3.33 g，大蒜8.83 g，食鹽45 g，亞硝酸鹽（按試驗(yàn)需要量添加）。最后加入土豆淀粉286.66 g。

1.5.2 茶腸切片表面菌落總數(shù)的測(cè)定 按照SN/T 0168[13]方法稍作改動(dòng)，結(jié)果以菌落對(duì)數(shù)值lg（CFU/cm2）表示。培養(yǎng)條件為（36±1）℃，（48±2）h。

1.5.3 亞硝酸鹽與抑菌物質(zhì)添加量的確定 在絞好的肉餡中加入不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鹽75，100，125 mg/mL，按照1.5.1 的工藝流程制作茶腸并將其切片。配制一定濃度的抑菌物質(zhì)溶液，用無(wú)菌涂布棒均勻涂抹在茶腸的兩面切片表面上，使抑菌物質(zhì)的最終涂抹量為5，7.5，10 mg/cm2。（8 cm3的表面積需要抑菌物質(zhì)的體積為100 μL）。以添加亞硝酸鹽150 mg/mL，不涂抹抑菌物質(zhì)為對(duì)照組，共有10 個(gè)試驗(yàn)組。將涂抹完畢的茶腸切片放入無(wú)菌袋中，4 ℃條件下保存。將茶腸表面的菌用無(wú)菌棉全部轉(zhuǎn)移至無(wú)菌生理鹽水中，按照1.5.2 的菌落總數(shù)測(cè)定方法測(cè)定茶腸切片在貯存0，2，4，6，8 d 時(shí)單位表面積上的菌落總數(shù)。茶腸切片及以后的操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)平行，確定亞硝酸鹽和抑菌物質(zhì)的最佳添加量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)結(jié)果均為3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS17.0 軟件中的單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 為差異顯著。用Excel 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳鐵蛋白水解物及其類蛋白反應(yīng)修飾產(chǎn)物抑菌率、蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

LHs 及其色氨酸修飾物的抑菌率、 蛋白質(zhì)含量的結(jié)果，如表1?？梢钥闯觯彼嵝揎椢镙^LHs抗菌性得到顯著提高（P＜0.05）。蛋白質(zhì)含量LHs及其plastein 修飾產(chǎn)物分別為82.01%和78.13%。采用鄰苯二甲醛法可以計(jì)算出游離氨基的減少量為45.00 μmol/g。與孫玥等的研究結(jié)果一致[3]。

表1 乳鐵蛋白水解物及其修飾物的抑菌率、蛋白質(zhì)含量Table1 The antibacterial rate and protein content of LHs and its modifier

2.2 溫度對(duì)乳鐵蛋白水解物及其類蛋白反應(yīng)修飾產(chǎn)物抑菌率的影響

溫度對(duì)LHs 及其色氨酸修飾物抑菌率的影響結(jié)果，如圖1?？梢钥闯?，LHs 色氨酸修飾物的抑菌率顯著高于LHs 的抑菌率（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)不同溫度的熱處理，55～95 ℃之間兩種抑菌物質(zhì)的抑菌率無(wú)顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)溫度高于75 ℃時(shí)，抑菌率稍有所下降。色氨酸修飾產(chǎn)物的抑菌率最多變化了4.2%，乳鐵蛋白水解物的抑菌率最多變化了3.9%。結(jié)果表明，兩種抑菌物質(zhì)對(duì)溫度均有較強(qiáng)穩(wěn)定性，將兩種抑菌物質(zhì)應(yīng)用于食品中殺菌溫度低于75 ℃時(shí)，對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌率沒(méi)有影響。溫度高于75 ℃時(shí)抑菌率稍會(huì)有所降低，可以將抑菌物質(zhì)涂抹于已殺菌后的食品切片表面，應(yīng)用于食品加工中。

2.3 pH 值對(duì)乳鐵蛋白水解物及其類蛋白反應(yīng)修飾產(chǎn)物抑菌率的影響

pH 值對(duì)LHs 及其修飾物抑菌率的影響結(jié)果，如圖2。可以看出，LHs 色氨酸修飾物的抑菌率顯著高于LHs 的抑菌率（P＜0.05），兩者抑菌率又顯著高于對(duì)照組，即未添加抑菌物質(zhì)組的抑菌率（P＜0.05）。隨著pH 值的升高LHs 的抑菌率呈顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05），所以兩種抑菌物質(zhì)更適合于添加到酸性食品中。隨著pH 值的升高色氨酸修飾物的抑菌率顯著降低（P＜0.05），色氨酸修飾物的抑菌率受pH 值的影響比LHs 抑菌率受pH 值的影響小。

2.4 離子對(duì)乳鐵蛋白水解物及其類蛋白反應(yīng)修飾產(chǎn)物抑菌率的影響

氯化鈉濃度對(duì)LHs 及其修飾物抑菌率的影響結(jié)果，如圖3。可以看出，LHs 色氨酸修飾物的抑菌率顯著高于LHs 的抑菌率（P＜0.05），兩者抑菌率又顯著高于對(duì)照組，即未添加抑菌物質(zhì)組的抑菌率（P＜0.05）。從未加抑菌物質(zhì)的對(duì)照組可知，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2.0%時(shí)，對(duì)照組抑菌率突然升高，可能由于鹽離子濃度過(guò)大使得細(xì)菌細(xì)胞失水所致。NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%～2.0%之間時(shí)，隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大兩種物質(zhì)抑菌率呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）。這可能由于離子與抗菌肽競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌細(xì)胞膜上的受體所致，離子濃度越高，阻礙了抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，進(jìn)而抑菌率降低。

氯化鉀對(duì)LHs 及其修飾物抑菌率的影響結(jié)果，如圖4?？梢钥闯觯琇Hs 色氨酸修飾物的抑菌率顯著高于LHs 的抑菌率（P＜0.05），兩者抑菌率又顯著高于對(duì)照組，即未添加抑菌物質(zhì)組的抑菌率（P＜0.05）。抑菌率的變化規(guī)律與添加NaCl 時(shí)基本相似。兩種抑菌物質(zhì)應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)盡量避免離子干擾。

圖1 溫度對(duì)乳鐵蛋白水解物及其修飾物抑菌率的影響Fig.1 Effect of temperature on the antibacterial rate of LHs and its modifier

圖2 pH 對(duì)乳鐵蛋白水解物及其修飾物抑菌率的影響Fig.2 Effect of pH on the antibacterial rate of LHs and its modifier

圖3 NaCl 對(duì)乳鐵蛋白水解物及其修飾物抑菌率的影響Fig.3 Effect of NaCl on the antibacterial rate of LHs and its modifier

圖4 KCl 對(duì)乳鐵蛋白水解物及其修飾物抑菌率的影響Fig.4 Effect of KCl on the antibacterial rate of LHs and its modifier

2.5 亞硝酸鹽與乳鐵蛋白水解物及其類蛋白反應(yīng)修飾產(chǎn)物添加量的確定

亞硝酸鹽添加量為75，100，125 mg/mL 的茶腸切片，在表面涂抹LHs，使最終涂抹量分別為5，7.5，10 mg/cm2。0 d 時(shí)茶腸切片表面菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值都小于1。4 ℃條件下保存2，4，6，8 d 時(shí)的細(xì)菌總數(shù)狀況如表2所示。從表2可以看出，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組的有第2 組和第3 組，即添加亞銷酸鹽125 mg/kg，添加乳鐵蛋白水解物為7.5 mg/cm2和10 mg/cm2，此時(shí)能起到延長(zhǎng)保質(zhì)期，減少亞硝酸鹽含量的作用。第2 組和第3 組的菌落總數(shù)結(jié)果差異不顯著（P>0.05），試驗(yàn)中霉菌酵母菌和乳酸菌未被檢出，表格中不再表述。為節(jié)約原料考慮，選擇添加亞銷酸鹽125 mg/kg，添加乳鐵蛋白水解物7.5 mg/cm2為最優(yōu)添加條件。

表2 4 ℃保存條件下茶腸切片表面上的菌落總數(shù)【lg（CFU/cm2）】Table2 Total count of sausages during storage at 4°C [lg（CFU/cm2）]

當(dāng)LHs 替換成色氨酸修飾產(chǎn)物涂抹于茶腸表面時(shí)，不同貯存時(shí)間細(xì)菌總數(shù)狀況如圖5所示。從圖5可以看出，同一貯存時(shí)間，添加色氨酸修飾產(chǎn)物7.5 mg/cm2，亞硝酸鹽125 mg/kg 的試驗(yàn)組菌落總數(shù)顯著低于乳鐵蛋白水解物7.5 mg/cm2，亞硝酸鹽125 mg/kg 的試驗(yàn)組，兩者的菌落總數(shù)又顯著低于加入亞硝酸鹽傳統(tǒng)劑量150 mg/kg 的試驗(yàn)組。確定加入色氨酸修飾物的最佳工藝條件為7.5 mg/cm2，亞硝酸鹽125 mg/kg。

圖5 4°C 保存條件下茶腸中的菌落總數(shù)Fig.5 The total count of tea sausage during storage at 4°C

3 結(jié)論

通過(guò)以上LHs 及其色氨酸修飾產(chǎn)物的性質(zhì)試驗(yàn)，得出溫度在75 ℃以下時(shí)，對(duì)兩者的抑菌效果無(wú)顯著性影響，溫度在75 ℃以上時(shí)抑菌效果會(huì)有所下降，可以采用食品先殺菌再涂抹抗菌肽的方式進(jìn)行加工。兩種抑菌物質(zhì)均適用于酸性食品，加工過(guò)程中應(yīng)盡量避免離子干擾。本試驗(yàn)采用表面涂抹的方式將其應(yīng)用在茶腸切片食品中，得出加入色氨酸修飾物7.5 mg/cm2，亞硝酸鹽125 mg/kg時(shí)效果最好，既能夠延長(zhǎng)茶腸保質(zhì)期又降低了亞硝酸鹽添加量。為工業(yè)生產(chǎn)低硝茶腸制品提供了新思路。